Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
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Wir danken Diamond Light Source für den Zugang zu und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im nationalen Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) des Vereinigten Königreichs, das vom Wellcome Trust, MRC und BBRSC finanziert wird. Wir danken auch Andrew Howe für den Erwerb des Apoferritin-Tomogramms (Film 1), Ishika Kumar für die Vorbereitung und den Erwerb des Neuronen-Tomogramms (Film 2) und Craig MacGregor-Chatwin für das Cyanobakterien-Lamella-Tomogramm (Film 3).

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Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Tomo5 Die Workflow-Beschreibung der Tomographie-Software zeigt einen möglichen und optimierten Weg für eine (Remote-) Batch-Tomographie-Sitzung auf. Während die Software für Anfänger einfach ist, können einige erste Kryo-EM-Erfahrungen und grundlegendes Tomographie-Verständnis bei der Einrichtung helfen. Kritische Schritte werden im Protokoll hervorgehoben und sollten bei der Fehlerbehebung helfen, auch wenn ein anderer Setup-Ansatz verwendet wurde. Die Weiterentwicklung der Software wird die (Fern-)Datenerfassung erleichtern und die Kryo-ET für eine breite Benutzerbasis zugänglicher machen. Im Folgenden werden einige Tipps und Tricks zur Behebung häufig auftretender Probleme beschrieben.
Ein wichtiger Punkt ist die Wahl der Raster, da bei einer Neigung der Probe auf ±60° Rasterbalken bei hohen Neigungen die Sicht verdecken können (Abbildung 8). In einem TEM-Gitter bezieht sich die Maschenweite auf die Anzahl der Gitterquadrate pro Längeneinheit des Gitters. Größere Netznummern haben mehr Rasterquadrate pro Längeneinheit, eine höhere Dichte von Gitterquadraten und kleinere Rasterquadrate, d. h. ein 400-Netzraster hat kleinere Quadrate als ein 200-Netzraster. Eine gute Wahl der Gitter für die Tomographie sind 200-Mesh- oder 300-Mesh-Gitter. Wie in Abbildung 8 dargestellt, verringert sich die verfügbare zu erfassende Fläche, wenn das Raster geneigt wird. Bei einer Neigung von ±60° hat ein 300-Maschen-Raster ein kleines Sichtfeld, auf dem ein vollständiges Tomogramm erfasst werden kann. Die Vorteile von 200-Mesh-Gittern sind, dass die größeren Gitterquadrate den molekularen Tomographieaufbau beschleunigen, und mit der vergrößerten Raster-Quadrat-Fläche wird ein Quadrat wahrscheinlich für eine Übernachtsammlung ausreichen. Der Nachteil ist, dass 200-Mesh-Gitter zerbrechlicher sind, so dass Handhabung und Clipping mehr Finesse erfordern.
Darüber hinaus muss bei Verwendung von löchriger Stützfolie (siehe Materialtabelle) auf EM-Gittern der Lochabstand für die Einrichtung des Fokus- und Trackingbereichs in Bezug auf den Belichtungsbereich berücksichtigt werden. Idealerweise sollte der Strahldurchmesser bei der gewünschten Vergrößerung klein genug sein, um den Kohlenstoffbereich neben dem Belichtungsbereich entlang der Neigungsachse abzudecken, um eine optimale und schnelle Einrichtung zu ermöglichen. Auf diese Weise können potenzielle Interessengebiete in jedem Bohrloch erfasst werden.
Da die euzentrische Höhenroutine der Software derzeit nicht so robust ist, wie die serialEM-Routine, können die folgenden Tipps dieses Problem umgehen. Wenn die euzentrische Höhenbestimmung mit der euzentrischen Höhenvoreinstellung fehlschlägt, kann man stattdessen die Übersichtsvoreinstellung verwenden und "Auto-euzentrisch durch Bühnenneigung" erneut ausführen; Dies kann Probleme lösen, wenn die euzentrische Höhe weit von 0 entfernt ist. Wenn dies gelingt, kann man "Auto-eucentric by stage tilt" mit "Eucentric Height" -Presets erneut ausführen, um die Präzision zu verbessern. Wenn dies fehlschlägt, kann man "Auto-Eucentric by beam tilt" mit der euzentrischen Höhenvoreinstellung ausführen und dann "Auto-Eucentric by stage tilt" erneut ausführen oder die durch "Auto-Eucentric by beam tilt" konsolidierte z-Höhe manuell in der TEM-Benutzeroberfläche unter "Stage" -Einstellungen einstellen. Wenn Gitter mit einem sich wiederholenden Muster von Löchern verwendet werden, können sie die Identifizierung eines einzelnen Kreuzkorrelationspeaks verhindern. Man kann versuchen, die euzentrische Höhenvoreinstellung auf einen niedrigeren Defokussierungsversatz wie −25 μm und/oder eine kürzere Belichtungszeit zu ändern, um die Kreuzkorrelation von den Lochmustern zu reduzieren. Auf der anderen Seite liefert die Verwendung von Spitzengittern / Lamellen möglicherweise kein ausreichendes Signal für eine starke Kreuzkorrelationsspitze. Man kann versuchen, die euzentrische Höhenvoreinstellung auf einen größeren Defokussierungsversatz wie −75 μm und/oder eine verlängerte Belichtungszeit zu ändern, um den Kreuzkorrelationspeak zu erhöhen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Bildfiltereinstellungen anzupassen. Sie finden sie im Reiter "Vorbereitung". Optionen zum Anpassen der Filtereinstellungen können für niedrige (Übersicht/Rasterquadrat), mittlere (euzentrische Höhe) und hohe Vergrößerung (Tracking/Fokus) eingestellt werden, um den optimalen Kreuzkorrelationspeak für jede Voreinstellung zu finden. Die erforderliche Eingabe ist ein Bild, d. h. bei 0° und eines bei 5°, gefolgt von einem Klick auf Vergleichen , um beide Bilder zu vergleichen. Der empfohlene Startwert für die längste Wellenlänge beträgt ein Viertel des Maßstabsbalkens im Bild und für die kürzeste Wellenlänge ein Vierzigstel des Maßstabsbalkens. Wenn der Peak nicht robust identifiziert wird, kann man die Einstellungen optimieren, bis ein überzeugender Peak gefunden werden kann. Es ist nicht notwendig, jedes Mal Bilder neu zu erfassen. Ein einfaches Drücken von "Vergleichen" genügt. Sollte TOMO die euzentrische Höhe immer noch nicht automatisch finden, kann die manuelle euzentrische Höhenkalibrierung verwendet werden. Man sollte über einem einigermaßen großen Eiskristall in Übersichtsvergrößerung in der Registerkarte "Vorbereitung" zentrieren, dann zur "Bühnensteuerung" der TEM-Benutzeroberfläche gehen, Alpha auf −30° einstellen und den Stufen-Z-Wert anpassen, um den Kristall mit dem fluoreszierenden Bildschirmbild neu zu zentrieren. Die Auswahl der Einstellungen "Hohe Auflösung" und "Hoher Kontrast" in der TEM-Benutzeroberfläche erleichtert dies (Schaltflächen am unteren Rand des fluoreszierenden Bildschirmfensters). Optional, wenn es Zugriff auf eine Kamera mit Live-Modus gibt, kann dies verwendet werden, um die euzentrische Höhe zu bestimmen; Es wird einfacher sein als auf dem fluoreszierenden Bildschirm.
Die größten Einschränkungen in Tomo5-Versionen vor 5.8 sind die fehlenden Montagen mit mittlerer Vergrößerung, das fehlende dosissymmetrische Schema und Probleme im Zusammenhang mit der euzentrischen Höhenfindung. Diese existieren in serialEM, einer Freeware mit schneller Entwicklung und Community-Unterstützung, einer robusten euzentrischen Höhenroutine und der Option zu skripten, d.h. einem maßgeschneiderten dosissymmetrischen Schema. Ab Version 5.8 in Tomo5 wurde das am häufigsten auftretende Problem beim Finden der euzentrischen Höhe, d.h. eine erfolglose Schleife um den Ziel-Z-Wert, durch die Implementierung der Option zum Festlegen eines euzentrischen Höhenakzeptanzkriteriums gelöst. Bei verschiedenen Raster- und Probentypen wird jedoch dringend empfohlen, die Bildfiltereinstellungen anzupassen, um die einzigartigen Bildbedingungen einzelner Sitzungen widerzuspiegeln und den bestmöglichen Kreuzkorrelationspeak zu erzielen, um die euzentrische Höhe zu finden und den Fokus und den Tracking-Bereich während der Tomogrammaufnahme zuverlässig zu arbeiten.

Insgesamt haben sich viele Einrichtungen während der Pandemie schnell an den Fernbetrieb angepasst. Die Tomo5-Software bietet einen einfachen Zugang und eine benutzerfreundliche Route zur Tomographie, die sich gut für die Fernbedienung eignet. Die Fortschritte in der Software werden zweifellos die Ferndatenerfassung und die Tomographieerfassung im Allgemeinen in der Community weiter zum Mainstream machen.
emClarity Da emClarity eine schablonenbasierte Partikelpicking-Methode verwendet, benötigt es eine Vorlage für das Objekt von Interesse. Die Partikelpickung (Schritt 2.6) ist sehr empfindlich und entscheidend für die endgültige Struktur. Vor der Mittelwertbildung und Ausrichtung (Schritt 2.9) muss sichergestellt werden, dass die Fehlalarme sorgfältig überprüft und manuell entfernt werden. Wenn eine Vorlage nicht verfügbar ist, ist emClarity möglicherweise nicht einfach zu verwenden, aber es ist möglich, andere Software, z. B. Dynamo37 und PEET48, zu verwenden, um ein erstes Modell zu erstellen.
Für heterogene Stichproben ist emClarity mit einer Klassifizierungsmethode ausgestattet, die es Anwendern ermöglicht, sich auf bestimmte Merkmale mit unterschiedlichen Skalen zu konzentrieren. Es ist hilfreich, vor der Klassifizierung einige Ausrichtungszyklen auszuführen und sie in einem höheren Binning auszuführen (z. B. Bin 4 oder Bin 3).
Die aktuelle Version der Software (V1.5.3.11) weist im Vergleich zum ersten Release (V1.0)17 erhebliche Updates auf. Dazu gehören unter anderem eine Händigkeitsprüfung während der CTF-Schätzung (Schritt 2.3); Symmetrie für Ausrichtungen (CX, I, I2, O); Berechnung von Pro-Partikel-3D-Probenahmefunktionen (3DSF); ein Wechsel zu MATLAB 2019a für Kompatibilität und Stabilität; und Rekonstruktion mit Hilfe der Rohprojektionsbilder (cisTEM). Die Software wird für verschiedene Muster weiter verbessert, und die neuesten Ankündigungen finden Sie online (siehe Materialtabelle).

Es ist allgemein bekannt, dass die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) eine Renaissance erlebt hat und sich zu einem zentralen und zentral nützlichen Werkzeug in der Strukturbiologie entwickelt hat. Die Entwicklung und Nutzung von Direktelektronendetektoren 1,2,3, verbesserte Mikroskope und Elektronenquellen3,4,5, Verbesserungen in der Automatisierung/Durchsatz6,7,8,9 und rechnerische Fortschritte in der Einzelteilchenanalyse 10,11,12,13 ,14 und Tomographie15,16,17 sind alle zum Teil für den jüngsten Erfolg der Technik verantwortlich. Diese technologischen Treiber haben die Fähigkeit von Kryo-EM entwickelt, biologische makromolekulare Strukturen unter kryogenen und nativen Bedingungen zu lösen. Die Auflösungen, die leicht erhältlich sind, reichen für eine atomar genaue Modellierung aus und haben die Technik an die Spitze der strukturbiologischen Arena gebracht. Ein reduktionistischer Ansatz zur Expression und Reinigung eines biologischen Ziels von Interesse hat sich in der makromolekularen Kristallographie (MX) für die biologische Grundlagenforschung, die Wirkstoffforschung und die translationale Wissenschaft seit langem als erfolgreich erwiesen. Mit dem gleichen Ansatz kann Kryo-EM nun Ergebnisse liefern, die parallel zu hochauflösenden MX-Studien verlaufen. Der derzeitige große Erfolg im Kryo-EM-Zweig der Strukturbiologie wird als Einzelpartikelanalyse (SPA) bezeichnet, die 2D-Projektionsbilder typischerweise einer gereinigten Proteinprobe18 aufnimmt, um Tausende von Ansichten eines biologischen Makromoleküls19 zu erhalten. Diese Bilder (1) enthalten Informationen aus einer Reihe von Ansichten, die die Orientierungen des Ziels im 3D-Raum vollständig darstellen und (2) erfassen die Objektkonformationsheterogenität, die später getrennt und untersucht werden kann.
Ein alternativer Ansatz zur Aufnahme dieser 2D-Projektionsbilder biologischer Proben, auch in situ und ohne Reinigung, ist die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Cryo-ET nimmt eine Reihe von Bildern desselben Objekts in geneigten Winkeln auf, indem die Probe mechanisch gedreht wird. Daher werden die in SPA gesammelten 2D-Projektionen, die die Winkelposen des interessierenden Moleküls darstellen, inhärent als Teil des Kryo-ET-Bildgebungsexperiments20 gesammelt. Tomographische Neigungsreihen werden dann in ein Tomogramm rekonstruiert, das 3D-Darstellungen der abgebildeten makromolekularen Komplexe enthält. Die Art der tomographischen Datenerfassung verringert bis zu einem gewissen Grad die Abhängigkeit von der Mittelwertbildung, um eine vollständige 3D-Darstellung eines Moleküls aus einer Sammlung von 2D-Bildern zu erhalten. Aufgrund aktueller Bühnendesigns ist die Probe jedoch typischerweise von −60° bis +60° geneigt, so dass in der tomographischen 3D-Rekonstruktion ein Keil21 an Informationen fehlt.
Die 3D-Rekonstruktionen in einem einzigen Tomogramm haben dann einen fehlenden Informationskeil und ein geringes Signal-Rauschen. Einzelne Makromoleküle können als Subtomogramme extrahiert und zusammen gemittelt werden, um dies anzugehen. Wenn jedes Makromolekül in einem Subtomogramm in einer anderen Orientierung gefunden wird, ist der fehlende Keil in jedem Subtomogramm des Zielobjekts anders ausgerichtet, so dass die Mittelung über viele Kopien Informationen aufgrund des fehlenden Keils ausfüllt. Jüngste Entwicklungen in der Bildverarbeitung haben auch versucht, neuronale Netze der künstlichen Intelligenz zu trainieren, um den fehlenden Keil mit aussagekräftigen Daten zu füllen22. Dieser Mittelungsprozess erhöht auch das Signal zu Rauschen, ähnlich dem Ziel der Mittelung in der Einzelpartikelanalyse, so dass sich die Qualität und Auflösung der Rekonstruktion verbessert. Wenn das interessierende Molekül eine Symmetrie besitzt, kann auch diese definiert und während der Mittelung verwendet werden, wodurch die Rekonstruktionsauflösung weiter verbessert wird. Die Extraktion von 3D-Volumina eines Makromoleküls aus einem Tomogramm in eine Reihe von Subtomogrammen und deren anschließende Verarbeitung wird als Subtomogrammmittelung (STA)23 bezeichnet. Wenn jedes Subtomogramm eine eindeutige Kopie des untersuchten Moleküls darstellt, kann jede strukturelle Heterogenität mit dem STA-Workflow abgefragt werden. Wie im SPA-Workflow üblich, können Klassifizierungstechniken während der STA eingesetzt werden, um die Konformationszustände des interessierenden Komplexes zu analysieren. Neben der STA, die eine hochauflösende Rekonstruktion in Kryo-ET ermöglicht, macht dieser Ansatz die Technik zu einem leistungsfähigen Werkzeug, um die strukturellen Mechanismen von Makromolekülen in ihrer nativen zellulären Umgebung oder von Zielen zu untersuchen, die SPA24,25,26 oft nicht zugänglich sind.
Die Elektronentomographie hat eine lange Geschichte der Bestimmung der 3D-Ultrastruktur von Zellproben bei Raumtemperatur27. Die Aufnahme von Ansichten durch physikalisches Kippen der Probe liefert genügend Informationen für die 3D-Rekonstruktion eines Objekts auf zellulären Längenskalen und ist besonders wichtig, wenn zellulären Strukturen die Regelmäßigkeit für die Mittelung fehlt. Zellen können auch auf Substraten für die Kryo-ET-Bildgebung an den Zellrändern eingefroren werden, wo die Probe dünn genug ist, um elektronentransparent zu sein. Unter diesen Bedingungen kann STA verwendet werden, um makromolekulare Strukturen in einer zellulären Umgebung zu bestimmen, wenn die Probe dünn genug ist, um elektronentransparent zu sein28. In Kombination mit zusätzlichen präparativen Techniken, einschließlich kryokorrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (Kryo-CLEM) und fokussiertem Ionenstrahlfräsen (Kryo-FIB), kann Kryo-ET jedoch verwendet werden, um ganze Zellen unter kryogenen Bedingungen abzubilden29. Dies vereint die Kraft der Kryo-ET zur Untersuchung der zellulären Ultrastruktur mit der Kraft von STA, um die Strukturen makromolekularer Komplexe in situ zu bestimmen, während sie ihre zelluläre Position30 identifizieren und Momentaufnahmen von Komplexen liefern, die an dynamischen Prozessen beteiligt sind31. Die Fähigkeit der Technik, zelluläre Proben abzubilden und STA in mehreren Studien einzusetzen, hat die Leistungsfähigkeit der Technik zur Lösung makromolekularer Strukturen in situ unterstrichen, selbst bei Auflösungen, die mit SPA32 vergleichbar sind. Ein weiterer Vorteil liegt in der Kenntnis der ursprünglichen Position des Makromoleküls, dargestellt durch die abschließende klassifizierte 3D-Rekonstruktion im Tomogramm30. Daher kann die makromolekulare Struktur mit der zellulären Ultrastruktur korreliert werden. Diese Beobachtungen über Längenskalen hinweg werden vermutlich zu wichtigen Erkenntnissen führen, bei denen strukturelle Mechanismen im Rahmen funktioneller Studien mit zellulären Veränderungen korreliert werden können.
Kryo-ET und STA ermöglichen die Datenerfassung in drei Hauptarbeitsabläufen: molekulare, zelluläre und Lamellentomographie. Die Strukturen gereinigter makromolekularer Komplexe können mittels Kryo-ET durch molekulare Tomographie bestimmt werden. Die Bestimmung von Proteinstrukturen in ihrer zellulären Umgebung, in der die Zelle dünn genug ist, kann als zelluläre Tomographie bezeichnet werden. In jüngerer Zeit, mit der Entwicklung von kryogenem Targeting und Mahlen, können dieselben Techniken in Lamellentomographie-Workflows angewendet werden, um die Proteinstrukturen tief in der Zelle in ihrer natürlichen Umgebung zu bestimmen und gleichzeitig den zellulären Kontext aufzudecken, in dem diese Proteine beobachtet werden. Je nach verfügbarem Softwarepaket und vor allem je nach Anforderung der Probe können unterschiedliche Datenerfassungsstrategien eingesetzt werden. Molekulare oder nicht haftende Proben auf einem Kupfer-TEM-Gitter eines gereinigten Proteins erfordern typischerweise weniger Handhabung und bleiben daher im Idealfall flach und unbeschädigt. Elektronentomogramme können leicht in Reihe über ein löchriges Kohlenstoffgitter aufgestellt werden, um schnell Dutzende bis Hunderte von Tomogrammen systematisch zu erfassen. Der einfachste Weg für Benutzer, molekulare Tomographieproben einzurichten, in denen Proteine reichlich im Gitter vorhanden sind, wäre die Verwendung von Tomo5 (Software für die 3D-Elektronentomographie, die in der vorliegenden Studie verwendet wird, siehe Tabelle der Materialien). Andere Tomographie-Software wie Leginon9 und serialEM6 sind ebenfalls verfügbar; Sie bieten mehr Setup-Optionen für personalisiertere Ansätze zur Datenerfassung, sind jedoch komplexer und können daher schwieriger zu navigieren sein, insbesondere für Benutzer, die neu in der Tomographie sind, und für Benutzer, die auf ihre Sitzung aus der Ferne zugreifen. Für eine Einrichtung mit einer großen und vielfältigen Benutzerbasis ist Tomo5 einfach in einer entfernten Umgebung zu bedienen und Benutzer darin zu schulen. Für adhärente Zellen erfordern Gitter typischerweise mehr Handhabungsschritte, und die Notwendigkeit, zerbrechliche Goldgitter zu verwenden, erhöht den Bedarf an verbesserter Sorgfalt bei der Handhabung und Datenerfassungsstrategien. Um das Auffinden einer Zellregion von Interesse zu erleichtern und eine Okklusion aus dem Gitter selbst bei hohen Neigungswinkeln zu vermeiden, ist es auch vorteilhaft, größere Maschenweite zu verwenden, aber auf Kosten dessen, dass sie von Natur aus zerbrechlicher sind. Bei Lamellenproben wird die Zerbrechlichkeit der Probe durch die Qualität der Lamelle bestimmt, die variabel sein kann. Diese Faktoren erhöhen die Einrichtungszeit und Überlegungen, aber die erhöhte Anpassungsfähigkeit und Robustheit machen Tomo5 wieder für diese Art der Datenerfassung geeignet. Für jeden Workflow gibt es jedoch spezielle Datenerfassungsszenarien. BISECT und PACE-tomo (beide laufen in SerialEM) führen die Möglichkeit der skriptgesteuerten Strahlbildverschiebung während der Tomographieaufnahme ein, um die Tomogramm-Erfassungsgeschwindigkeit zu erhöhen28, insbesondere in der molekularen Tomographie. Montagen mit mittlerer Vergrößerung (MMM) in SerialEM 6,7,33 können molekulare Merkmale in allen Arbeitsabläufen besser identifizieren und präzise anvisieren, obwohl diese Funktionen zum Zeitpunkt des Schreibens in Tomo5 implementiert werden.
Wie SPA werden Kryo-ET und STA durch die Verbesserungen der Erfassungssoftware und eine Fülle verfügbarer Pakete für Subtomogramme von durchschnittlich 16,17,32,34,35,36,37,38 immer zugänglicher. Darüber hinaus wurde während der Pandemie der Fernzugriff auf Kryo-EM-Instrumente für den weiteren Betrieb nationaler Einrichtungen wie dem Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) an der Diamond Light Source (DLS) in Großbritannien unerlässlich. Diese Entwicklungen haben die Kryo-ET für Forscher, die die Technik einsetzen möchten, zugänglicher und robuster gemacht. Sobald die Daten erfasst wurden, ist STA ein wesentliches Werkzeug für die Analyse wiederkehrender Objekte, um eine Rekonstruktion mit maximaler Auflösung zu erhalten und die Klassifizierung der makromolekularen Heterogenität zu ermöglichen. Das aktuelle Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Anleitung zur Vorbereitung eines Kryo-TEM-Mikroskops für die Kryo-ET-Datenerfassung und zur Durchführung einer Subtomogramm-Mittelung mit emClarity an einem molekularen Tomographie-Datensatz von Apoferritin als Beispiel zu bieten. Die Verwendung von emClarity (Software für hochauflösende Kryo-Elektronentomographie und Subtomogramm-Mittelwertbildung, siehe Materialtabelle) erfordert das Ausführen von Skripten über die Befehlszeile, so dass ein gewisses Maß an Vertrautheit mit Linux/UNIX-Systemen vorausgesetzt wird.
Die Remote-Verbindung hängt von der Netzwerkumgebung in jedem Institut/jeder Einrichtung ab. Bei eBIC verwendet das Remote-System Programme, die eine Remote-Datenerfassung über die bei Diamond verwendete spezifische Netzwerkkonfiguration ermöglichen. Die Fernverbindung zum Mikroskop wird durch zwei Plattformen erleichtert: NoMachine und TeamViewer (siehe Materialtabelle). Mit dem Programm NoMachine kann sich der Benutzer an einem entfernten Windows-Desktop anmelden. Der von NoMachine bereitgestellte Remote-Windows-Desktop befindet sich im selben Netzwerk wie das Mikroskop und fungiert somit als virtueller Support-PC für das Mikroskop. Vom virtuellen Support-PC aus verbindet sich der Benutzer über TeamViewer mit dem Mikroskop und bietet direkten Zugriff und Steuerung zum Mikroskop-PC, auf dem TUI und Tomo ausgeführt werden.
Das vorliegende Protokoll besteht aus zwei Teilen (Schritt 1 und Schritt 2). Schritt 1 konzentriert sich auf die Kryo-ET-Ferndatenerfassung mit Tomo5 (Software für 3D-Elektronentomographie). Der Rundgang für eine (Remote-)Sitzung erfasst Bilder mit immer höheren Vergrößerungen, um es dem Benutzer letztendlich zu ermöglichen, die Tomographie-Software auf Zielprobenbereiche für die tomographische Datenerfassung zu lenken. Abbildung 1 fasst diesen Prozess zusammen. Schritt 2 beschreibt die Kryo-ET STA-Datenverarbeitung mit emClarity (Software für hochauflösende Kryo-Elektronentomographie und Subtomogramm-Mittelung). Abbildung 9 fasst diesen Prozess zusammen.
Das Protokoll ist für ein Remote-Publikum gedacht. Es geht davon aus, dass die Person physisch am Mikroskop und beim Laden der Proben die direkte Ausrichtung vorgenommen und sich um die Kameraabstimmung und die Referenzerfassung gekümmert hat. Für dieses Protokoll wird ein Drei-Kondensator-Linsensystem mit einem Autoloader angenommen. Weitere detaillierte Anleitungen zur Tomographie-Software finden Sie in der Windows-Starttaste, von der aus die Software geladen wurde, ein ausführliches Handbuch des Herstellers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) hat in den letzten Jahren an Dynamik gewonnen, insbesondere seit der Einführung von Direktelektronendetektoren, verbesserten automatisierten Erfassungsstrategien, präparativen Techniken, die die Möglichkeiten erweitern, was das Elektronenmikroskop mit Kryo-ET hochauflösend abbilden kann, und neuer Subtomogramm-Mittelungssoftware. Darüber hinaus wurde die Datenerfassung zunehmend rationalisiert, wodurch sie für viele Benutzer zugänglicher wird. Die SARS-CoV-2-Pandemie hat die Datenerfassung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), insbesondere für Einzelpartikel-Kryo-EM, in vielen Einrichtungen weltweit weiter beschleunigt und bietet während der Pandemie ununterbrochenen Benutzerzugriff auf modernste Instrumente. Mit den jüngsten Fortschritten bei Tomo5 (Software für die 3D-Elektronentomographie) ist die Ferndatenerfassung von Kryo-ET robust und einfach von überall auf der Welt zu handhaben. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine detaillierte Anleitung zu bieten, beginnend mit der Einrichtung der Datenerfassung in der Tomographie-Software für den Prozess einer (Remote-) Kryo-ET-Datenerfassungssitzung mit detaillierter Fehlerbehebung. Das (Fern-)Datenerfassungsprotokoll wird durch den Workflow zur Strukturbestimmung bei nahezu atomarer Auflösung durch Subtomogrammmittelung mit emClarity am Beispiel von Apoferritin ergänzt.

Bei Zell- und Lamellenproben hängt die Datenerhebungsstrategie weitgehend von der Probe und dem Ziel der Bildgebungsstudie ab (Abbildung 1). Der Targeting-Ansatz hängt davon ab, ob das molekulare Target in situ ist oder aus dem gereinigten makromolekularen Komplex für hochauflösende Rekonstruktionsproben mit molekularen Targets hergestellt wird. Für gereinigte Komplexe, die auf löchrigen (Kohlenstoff-) Gittern verglast sind, kann das Targeting einfach auf der Bildgebung in den Löchern der (Kohlenstoff-) Stützfolie basieren. Für In-situ-Arbeiten erfordert der Targeting-Ansatz die Kenntnis der Position der molekularen Entität basierend auf korrelativen Daten oder bekannten zellulären Landmarken mit geringer Vergrößerung. Zelluläre Landmarken wären idealerweise bei der Aufnahme von Übersichtsbildern identifizierbar und können, wenn sie ausreichen, um Regionen von Interesse grob zu lokalisieren, eine schnelle Möglichkeit bieten, die Zielidentität mit einem Suchbild zu bestätigen. Wenn die beobachtbaren Ereignisse jedoch selten sind, können Suchbilder mit mittlerer Vergrößerung erforderlich sein, um zu qualifizieren, dass das Ziel korrekt ist. Suchkarten sind Montagen mit mittlerer Vergrößerung von Suchbildern und können somit die Zielsuche erheblich erleichtern, wo sie bei einer Vergrößerung erfasst werden können, bei der das interessierende Merkmal sichtbar ist. Suchkarten können dann durchleuchtet werden, um Zielstapelpositionen zu finden und einzurichten. Für Proben, die zelluläre Merkmale für die ultrastrukturelle Rekonstruktion enthalten, ist der Targeting-Ansatz ähnlich, hängt jedoch gleichermaßen von der Sichtbarkeit des zellulären Ereignisses bei verschiedenen Vergrößerungen und seiner Prävalenz in der Probe ab.
Die Datenerfassungsstrategie muss ebenfalls berücksichtigt werden; In allen Fällen bestimmt das Ziel der Studie maßgeblich, wie die Daten erhoben werden. Für die Rekonstruktion der zellulären Ultrastruktur kann eine geringe Vergrößerung (20-5 Å / px) und ein großes Sichtfeld angebracht sein, aber hohe Vergrößerungen sind erforderlich, um molekulare oder hochauflösende Details (5-1 Å / px) zu rekonstruieren. Ein Datensatz, der bei 1,5 Å/px unter idealen Bedingungen gesammelt wurde, wird physikalisch nur in der Lage sein, eine Rekonstruktion bei der Nyquist-Frequenz von 3,0 Å/px zu erzeugen; In Wirklichkeit beeinflussen jedoch viele Faktoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Probendicke, Größe und Heterogenität, die erhaltene Rekonstruktionsqualität. Die genauen Bildgebungsparameter gleichen auch die Vergrößerung basierend auf dem Ziel der Studie aus, wobei das Sichtfeld genügend Informationen enthält. Dieser Artikel stellt ein Subtomogramm vor, das einen durchschnittlichen Fall von 2,86 Å erreicht, aber zusätzliche Studien 17,42,43,44,45 sind in Tabelle 1 dargestellt, um die Sammlungsparameter zu veranschaulichen, die mit Studien verbunden sind, die auf verschiedene Endpunkteabzielen 17,42,45,46.
Sobald ein Targeting-Workflow und ein Datenerfassungsregime für Kryo-ET etabliert sind, ist die Datenerfassung vieler verschiedener Probentypen möglich. Repräsentative Tomogramme einer Vielzahl von Proben werden hier vorgestellt: molekulare Proben wie Apoferritin (Film 1), dünnzellige Prozesse (Film 2) und FIB gefräste Lamellen der dickzelligen Probe (Film 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den Aufbau des Tomographie-Workflows. Der im Protokoll beschriebene Kryo-ET-Imaging-Workflow wird als Flussdiagramm dargestellt. Die zu erwartenden Bilder werden für den zellulären und molekularen Workflow gezeigt. Die vorgestellte Benennung folgt der Tomo5-Konvention, obwohl die meisten Tomographie-Erfassungssoftware gemeinsame Prinzipien für die Erfassung dieser Bilder hat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Abbildung 2: Registerkarte "Vorbereitung" und voreingestellte Suchbedingungen . (A) Übersichtsbild der gesamten Registerkarte. In dieser Registerkarte werden die Voreinstellungen für Bildbedingungen festgelegt, und die Einstellungen "Bildverschiebung kalibrieren" und "Bildfilter" finden Sie im Dropdown-Menü "Aufgaben". (B) Vergrößern des Dropdown-Menüs "Presets", in dem jedes Preset für die Einrichtung individueller Bildbedingungen ausgewählt werden kann. (C) Bild mit einer ausreichenden Vergrößerung, um sowohl die Belichtung als auch den Bereich "Fokus und Tracking" in das Sichtfeld zu passen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Abbildung 3: Dosisberechnungen. Beispieldosisberechnungen für mögliche Tomographie-Erfassungsschemata, bei denen die Dosisleistung über Vakuum gemessen wurde. Die beiden Berechnungen bestimmen die Belichtungszeit(en) für jede Neigung, unabhängig davon, ob sie auf eine optimale Dosis pro Neigung oder eine optimale Gesamtdosis für die Full Tilt-Serie abzielen. Bei der Subtomogramm-Mittelwertbildung ist es üblich, eine optimale Dosis pro gekipptem Bild im Bereich von 3,0-3,5 e-/Å2 anzustreben. In beiden Fällen werden die "Fraktionen (Nr.)" auf 6 gesetzt, um ~0,5 e-/Å2 Dosis pro Filmbild der Neigung für ein ausreichendes Signal zur Bewegungskorrektur zu erreichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Abbildung 4: Registerkarte Atlas. Übersichtsbild der Registerkarte "Atlas". Das Bild wurde zugeschnitten, um leere Rasterpositionsräume zu vermeiden. Das Menü "Aufgaben" enthält Einstellungen für die Sitzungseinrichtung und Rasterauswahlbereiche für die individuelle Auswahl aller inventarisierten Raster und eine Option zum Abrufen eines einzelnen Atlas, nachdem die Kassette aus dem Autoloader entfernt wurde. Ein ausgewähltes Raster kann zurückgesetzt und dann wieder erfasst werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Abbildung 5: Kalibrierte Bildverschiebungen. Das Bild zeigt eine Belichtung und ein Suchbild. Das rote Kreuz im Suchbild ist die verschobene Markierung, um den Versatz zwischen Belichtung und Suche zu korrigieren. Man sollte die Kalibrierung der Bildverschiebung zu Beginn der Sitzung oder nach dem Ändern der Voreinstellungen für die Bildgebungsbedingungen wiederholen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Abbildung 6: Autofunktionen und Blenden. (A) Die Registerkarte "Auto-Funktionen" zeigt das Dropdown-Menü "Presets" und die Auswahl "Task". Blau unterstrichen ist die Voreinstellung "Thon Ring", die für "Autostigmate" (auch blau unterstrichen) und "Autocoma" erforderlich ist. Man sollte für jede Aufgabe entsprechende Voreinstellungen auswählen und dann die Starttaste drücken. (B) Blenden befinden sich in der TEM-Benutzeroberfläche. Wählen Sie die gewünschte "Objektivblende", nachdem die Autofunktionen ausgeführt wurden, und führen Sie "Autostigmate" mit der Blende aus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Abbildung 7: Übersicht über die Registerkarte Tomografie. Bilder zeigen die Benutzeroberfläche von Tomo 5.8. (A) Chargenpositionen. Die neuesten Funktionen, die im Bild dargestellt sind: die Option "Suchkarte erfassen"; Tomogrammpositionen werden in der Atlasansicht mit der Zoom-in-Option angezeigt. oben rechts hervorgehoben ist "Positionen auswählen"; unten wurden alle vier Positionen zu den Parametern "Defokussierung aktualisieren" ausgewählt. (B) Auf der Suchkarte werden drei Positionen mit den Bezeichnungen 1, 2 und 3 ausgewählt. Position 1 stellt kein Problem dar, wenn "Alle verfeinern" ausgeführt wird. Wenn jedoch in einer Einstellung mit hoher Zieldichte, z. B. wenn Lamellenpositionen ausgewählt werden, wie für Position 2 und Position 3 dargestellt, führt "Alle verfeinern" die Routine "Tracking" und "Fokus" für den Bereich "Belichtung" von Position 2 aus und legt das Ziel frei, bevor das Tomogramm erfasst wird. Der Rastertyp ist R1.2/1.3. Maßstabsbalken = 1,2 μm. (C) Datenerfassung. Ausgewählte Positionen, die in "Chargenpositionen" eingerichtet sind, können nun individuell erfasst werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Abbildung 8: Definition des maximalen Neigungswinkels. Die Abbildung zeigt einen schrittweisen Ansatz zur Bestimmung des maximalen Neigungsbereichs für Tomogrammaufnahmen. (A) 0° Übersicht und eine Suchkarte in der Mitte des Rasterquadrats. Um den Neigungsbereich zu testen, kann der Winkel in der Tomographie-Software mit "Neigung einstellen (°)" eingestellt werden, indem der gewünschte Wert eingegeben und anschließend auf Einstellen gedrückt wird. (B) Die Bühne wurde auf −60° geneigt, was zeigt, dass eine Ecke der Suchkarte bei −60° nicht vollständig erfasst wird. (C) Die Bühne wurde um 60° geneigt. Durch das Zählen der verschwundenen Löcher bei ±60° kann man sich ein Bild vom Neigungsbereich eines Rasterquadrats machen. Maßstabsbalken = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Abbildung 9: emClarity-Flussdiagramm. Das Flussdiagramm beschrieb die verschiedenen Schritte für die Kryo-Sub-Tomogramm-Mittelung. Maßstabsbalken = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Abbildung 10: Vorlagenabgleich mit emClarity . (A) Eine typische Mikroaufnahme von Apoferritin auf einem graphenbeschichteten Gitter. Defokussierung: −3,430 μm. (B) Ein Ausschnitt des Tomogramms, der nach der Vorlagensuche mit Modellpunkten überlagert wird. (C) Eine obere und (D) eine Seitenprojektionsansicht von Modellpunkten, die eine einzelne flache Schicht monodisperser Apoferritinpartikel anzeigen. Maßstabsbalken = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Abbildung 11: Kryo-ET-STA von Apoferritin . (A) Die endgültige Karte nach 21 Zyklen der Sub-Tomogramm-Ausrichtung. (B) Das Fourier-Shell-Korrelationsdiagramm (FSC) der endgültigen Karte mit einer gemeldeten Auflösung von 2,86 Å, das 38 Kegel-FSCs enthält. (C) Repräsentative Dichtekarten (ausgestattet mit PDB-Modell 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Probe</td>
			<td>Kryo-ET-Typ</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Neigungsbereich (+/-)</td>
			<td>Kippstufe (°)</td>
			<td>Unschärfebereich (μm)</td>
			<td>Gesamtdosis (e-/Å2)</td>
			<td>Auflösung</td>
			<td>Rohdaten</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr><tr><td>Apoferritin</td>
			<td>Gereinigt/Molekular (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & dieses Papier</td>
		</tr><tr><td>HIV-1-Knebel</td>
			<td>Gereinigt/Molekular (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosom</td>
			<td>Gereinigt/Molekular (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>SARS-CoV-2-Spitze</td>
			<td>Lamellen/Moleküle (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Neuronenaxonstruktur</td>
			<td>Zellulär (ultrastrukturell)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Sammelparameter für mehrere Kryo-ET-Studien. Studien, die auf die Rekonstruktion molekularer Details aus gereinigten oder in situ Proteinen abzielen, verglichen mit einer Studie, die darauf abzielt, die ultrastrukturellen zellulären Merkmale aufzulösen und zu segmentieren.
Film 1: Ein Tomogramm von Apoferritin-Proben auf einem normalen EM-Gitter und dann mit einem Kryo-TEM, das mit einer ultrahochauflösenden Kamera mit einem kompatiblen Filter ausgestattet ist. Die Tilt-Serien wurden mit einem dosissymmetrischen Schema mit einer Neigungsspanne von 54° und einer Gesamtdosis von 134 e-/A2in der Elektronentomographie-Software erfasst. Maßstabsbalken = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 2: Ein Tomogramm eines primären Neurons, das auf einem EM-Gitter gezüchtet und dann direkt mit einem Kryo-TEM abgebildet wurde, das mit einer ultrahochauflösenden Kamera mit einem kompatiblen Filter ausgestattet ist. Die Neigungsserien wurden dosissymmetrisch mit einer Neigungsspanne von 60° und einer Gesamtdosis von 120 e-/A2in der Elektronentomographie-Software erfasst. Maßstabsbalken = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 3: Ein Tomogramm eines Cyanobakteriums auf einem EM-Gitter, das einer FIB-Fräsung unterzogen und dann mit einem Kryo-TEM abgebildet wurde, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und einem kompatiblen Filter ausgestattet ist. Die Neigungsserien wurden mit einem dosissymmetrischen Schema mit einer Neigungsspanne von 50° und einer Gesamtdosis von 120 e-/A2in der Elektronentomographie-Software erfasst. Maßstabsbalken = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 1: Die Parameterdateivorlage zur Schätzung der Unschärfe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Details zur Datenerhebung und zum Aufbau des Mikroskops. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Zusatztabelle 2: Liste der Befehle in der Reihenfolge ihrer Ausführung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Dieses Protokoll bietet einen einfachen Zugang in die immer beliebter werdende, aber komplexe Welt der Kryo-Elektronentomographie. Sechs zelluläre Proben können abgebildet werden. Institut in einem Heimatstaat.Mikromoleküle können dann mit hoher Auflösung in ihrer nativen zellulären Umgebung aufgelöst werden, indem CROW, ET und Subatom-Mittelung verwendet werden. Starten Sie zunächst die Tomo five-Software vom TEM-Server-PC. Starten Sie die Einrichtung der Sitzung, indem Sie die Bildaufnahmeparameter auf der Registerkarte Vorbereitung unter Voreinstellungen anpassen.Kopieren Sie die Parameter der Bildaufnahme in alle anderen Voreinstellungen für hohe Vergrößerung. Drücken Sie "Set", um die Belichtung im Mikroskop einzustellen, und "Get", um die Belichtungseinstellungen für alle anderen hohen Vergrößerungen zu erhalten, nachdem Sie sie einzeln ausgewählt haben. Um einen Atlas zu sammeln, klicken Sie auf die Registerkarte "Neue Sitzung" im Atlas.Legen Sie die Sitzungseinstellungen fest. Geben Sie den Speicherpfad und das Ausgabeformat ein und drücken Sie Übernehmen. Wählen Sie "Screening" und kreuzen Sie alle zu erwerbenden Atlanten an.Select Close Call Valves"Wenn das Mikroskop unbeaufsichtigt ist, werden die Säulenventile geschlossen. Um die Vorführung zu starten, drücken Sie dann die Starttaste. Überprüfen Sie die einzelnen oder mehrere Atlanten auf Ziele, indem Sie auf das Raster im linken Bereich unter Sitzungseinrichtung klicken"Klicken Sie dann mit der linken Maustaste und ziehen Sie die Maus, um sich zu bewegen, und den mittleren Bildlauf, um zu vergrößern und zu verkleinern.Wählen Sie das Raster für das Ziel-Setup aus. Wählen Sie es aus und klicken Sie in der Software auf "Load Sample". Um die Kalibrierung der Bildverschiebung durchzuführen, stellen Sie auf der Registerkarte "Autofunktionen" die Voreinstellung auf Euzentrische Höhe "Navigieren Sie zu Auto-Euzentrisch" durch Stufenneigung ein und drücken Sie Start.Wenn das Feature während des Zielens zentriert blieb, überspringen Sie die Kalibrierung der Bildverschiebung. Andernfalls gehen Sie auf die Registerkarte "Vorbereitung" für die Kalibrierung der Bildverschiebung, wählen Sie "Bildverschiebung kalibrieren" und drücken Sie Start. Dadurch werden die niedrigeren Vergrößerungen an dem bei der Belichtungsvergrößerung zentrierten Feature ausgerichtet.Für die Tomographie einrichten, starten Sie eine neue Sitzung in "Session Setup" für biologische Proben. Wählen Sie "Slab like" als Probentyp und wählen Sie "Batch" und "Low Dose" und wählen Sie dann das Ausgabeformat und den Ordner "Speicher". Fügen Sie optional einen E-Mail-Empfänger hinzu und drücken Sie Übernehmen"Um Ziele einzurichten, gehen Sie zum Atlaspfeil, suchen Sie eine Region von Interesse und bewegen Sie sich, indem Sie die Optionen auswählen, die mit einem rechten Mausklick angezeigt werden.Machen Sie ein Übersichtsbild, um eine gute Position für die euzentrische Höhenverstellung zu bestätigen. Drücken Sie dann "autoeuzentrisch", um die euzentrische Neigungsroutine auszuführen, ein neues Übersichtsbild zu erhalten, um die euzentrische Höhe zu aktualisieren. Überprüfen Sie die Quadratübersicht oder die erworbene Suchkarte.Wechseln Sie zu einer Region von Interesse und drücken Sie die Suche erwerben. Überprüfen Sie dann das Suchbild, wenn die Region von Interesse nicht zentriert ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Position und wiederholen Sie "Move stage here" und erfassen Sie das Bild. Passen Sie den Fokus und die Tracking-Bereiche an.Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Tracking- und Fokusbereiche zu ziehen. Sobald alle Parameter eingestellt sind, drücken Sie Position hinzufügen"Um automatische Funktionen auszuführen, überprüfen Sie die Einstellungen, um die Ausrichtung über die Registerkarte "Autofunktionen" durchzuführen, indem Sie den Atlas zu einem Bereich aus Kohlenstoff navigieren. Bringen Sie diesen Bereich auf euzentrische Höhe und folgen Sie der Reihenfolge der Ausrichtungen, wie im Textmanuskript beschrieben.Als nächstes starten Sie die automatisierte Erfassung der Tomographie-Registerkarte. Wählen Sie die "Datenerfassung" aus und stellen Sie die gewünschten Parameter ein. Richten Sie Datenerfassungsparameter ein: Neigungsschritt, maximaler positiver Winkel, maximaler negativer Winkel, Tracking-Schema.Wählen Sie dann "Säulenventile schließen" für das euzentrische Höhenschema. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Eingabedateien und Verzeichnissen. Richten Sie einen Projektordner unter dem Ordner "Projekt" ein.Erstellen Sie einen weiteren neuen Ordner mit festen Stapeln und bereiten Sie die Eingabedateien vor. Neigungsserie eins feste Neigung Serie 1. XF und Tilt Serie 1.tlt.Um die Unschärfe zu berechnen, aktualisieren Sie die Parameterdatei mit den Mikroskop- und Bildgebungsparametern. Kopieren Sie eine Parameterdatei in den Projektordner. Ändern Sie den Namen in param_CTF.M und führen Sie den angegebenen Befehl aus. Überprüfen Sie als Nächstes die CTF-Schätzergebnisse. Überprüfen Sie für jeden Stapel die ausgerichteten Stapel mit 3D-Mod und stellen Sie sicher, dass die treuhänderischen Perlen korrekt gelöscht werden.Stellen Sie sicher, dass die Händigkeit korrekt ist, indem Sie den angegebenen Befehl ausführen. Überprüfen Sie dann den Defokussierungswert und stellen Sie sicher, dass er mit der theoretischen CTF-Schätzung übereinstimmt. Um die Teilbereiche zu definieren, generieren Sie ein Biegetomogramm.Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Bestimmen Sie die Grenzen, indem Sie sechs Punkte Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin und Zmax auswählen, um einen Unterbereich unter dem Ordner bin10 zu erstellen, führen Sie den angegebenen Befehl aus. Führen Sie als Nächstes die Partikelauswahl für jeden Unterbereich aus.Für den Apoferritin-Datensatz führen Sie eine Vorlagensuche in bin sechs durch. Ändern Sie den Unterstrichwinkel der Vorlage. Suchparameter zur Bestimmung des Winkels, des Bereichs und der Intervalle für die Suche in Grad in oder außerhalb der Ebene.Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Entfernen Sie die falschen Partikel mit 3D-Mod unter dem Ordner. Convmap_wedge_Type2_bin6. Führen Sie den angegebenen Befehl aus.Initialisieren Sie als Nächstes das Projekt. Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus, um eine Datenbank für EM-Klarheit zu erstellen, AppoF.mat. Führen Sie eine Tomogrammrekonstruktion vor der Sub-Tomo-Mittelung und -Ausrichtung durch, um CTF-korrigierte Subregion-Tomogramme in bin4 zu generieren, führen Sie den angegebenen Befehl aus.Um als nächstes eine Sub-Tomo-Mittelung und -Ausrichtung durchzuführen, führen Sie die Mittelwertbildung mit den CTF-korrigierten Subtelegrammen durch, die bei bin4 beginnen. Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Fahren Sie mit den Ausrichtungen fort, und führen Sie den Befehl aus.Reinigen Sie die überlappenden Partikel, indem Sie den angegebenen Befehl ausführen. Führen Sie die endgültige Rekonstruktion durch, indem Sie die beiden halben Datensätze kombinieren. Führen Sie im Projektordner die angegebenen Befehle aus.Überblick über den Tomographie-Workflow für die zelluläre und molekulare Tomographie werden hier für Zell- und Lamellenproben gezeigt, die Datenerhebungsstrategie hängt maßgeblich von der Probe und dem Ziel der bildgebenden Untersuchung ab. Die Sammelparameter für mehrere Kryo-ET-Studien sind hier dargestellt. Repräsentative Tomogramme molekularer Proben wie Apoferritin, dünnzellige Prozesse und fokussierte ionenstrahlgefräste Lamellen der dickzelligen Probe werden hier gezeigt.Hochauflösende Strukturanalysen können helfen, Bindungsstellen für Wirkstoffziele aufzudecken, und Tomographie und subtomograle Mittelung haben auch die Impfstoffentwicklung gegen SARS-CoV-2 unterstützt.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

Meerwasser Probenahme und Sammlung

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Forschung

Biologie

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Sammlung und Identifizierung von Pollen aus Honigbienenvölkern

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Kryostrukturierte Beleuchtung Mikroskopische Datenerfassung von kryogen konservierten Zellen

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Konstruktion eines realistischen, dreidimensionalen Ganzkörper-Pferdeskelettmodells unter Verwendung von Computertomographiedaten

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...