Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

אנו מכירים במקור אור יהלום עבור גישה ותמיכה במתקני cryo-EM במרכז הלאומי להדמיית אלקטרונים בבריטניה (eBIC), במימון קרן Wellcome, MRC ו- BBRSC. ברצוננו גם להודות לאנדרו האו על רכישת טומוגרמה אפופריטין (סרט 1), אישיקה קומאר על ההכנה והרכישה של טומוגרמה נוירונים (סרט 2), וקרייג מקגרגור-צ'טווין על הציאנובקטריה למלה-טומוגרמה (סרט 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

טומו5 תיאור זרימת העבודה של תוכנת הטומוגרפיה מדגיש דרך פוטנציאלית אחת ויעילה ביותר להגדרת הפעלת טומוגרפיה אצווה (מרוחקת). בעוד התוכנה קלה למתחילים, כמה ניסיון קריו-EM ראשוני והבנה טומוגרפיה בסיסית יכולים לעזור עם ההתקנה. שלבים קריטיים מסומנים בפרוטוקול ואמורים לסייע בפתרון בעיות גם אם נעשה שימוש בגישת התקנה שונה. התקדמות התוכנה תקל על איסוף נתונים (מרחוק) ותהפוך את cryo-ET לנגיש יותר לבסיס משתמשים רחב. כמה עצות וטריקים שיכולים לסייע בפתרון בעיות נפוצות מתוארים להלן.
נקודה חשובה אחת שיש לדון בה היא בחירת הרשתות, מאחר שכאשר מטים את הדגימה ל-±60°, פסי רשת בהטיה גבוהה יכולים לטשטש את התצוגה (איור 8). ברשת TEM, גודל רשת השינוי מתייחס למספר ריבועי הרשת ליחידת אורך של הרשת. למספרי רשת שינוי גדולים יותר יש יותר ריבועי רשת ליחידת אורך, צפיפות גבוהה יותר של ריבועי רשת וריבועי רשת קטנים יותר, כלומר, לרשת של 400 רשתות שינוי יש ריבועים קטנים יותר מרשת שינוי של 200 רשת. בחירה טובה של רשתות עבור טומוגרפיה היא 200-רשת או 300-רשתות שינוי. כפי שניתן לראות באיור 8, השטח הזמין לאיסוף מצטמצם ככל שהרשת מוטה. בהטיה של ±60°, לרשת של 300 רשת יהיה שדה ראייה קטן שעליו ניתן לרכוש טומוגרמה מלאה. היתרונות של רשתות של 200 רשתות הם שריבועי הרשת הגדולים יותר הופכים את מערך הטומוגרפיה המולקולרית למהיר יותר, ועם הגדלת שטח הרשת-ריבוע, סביר להניח שריבוע אחד יספיק לאיסוף בן לילה. החיסרון הוא שרשתות של 200 רשתות הן שבריריות יותר, ולכן טיפול וחיתוך דורשים יותר עדינות.
יתר על כן, אם משתמשים בסרט תמיכה חורי (ראה טבלת חומרים) ברשתות EM, יש לשקול את מרווח החורים לצורך הגדרת אזור המיקוד והמעקב ביחס לאזור החשיפה. באופן אידיאלי, קוטר הקרן בהגדלה הרצויה צריך להיות קטן מספיק כדי לכסות את שטח הפחמן הסמוך לאזור החשיפה לאורך ציר ההטיה להגדרה אופטימלית ומהירה. בדרך זו, ניתן לרכוש אזורי עניין פוטנציאליים בכל חור.
מכיוון ששגרת הגובה האוצנטרית של התוכנה אינה חזקה כרגע, כגון שגרת SerialEM, העצות הבאות יכולות לעקוף בעיה זו. אם קביעת הגובה האוצנטרי נכשלת באמצעות הגדרת הגובה האוצנטרית המוגדרת מראש, ניתן להשתמש במקום זאת בקביעה המוגדרת מראש של הסקירה ולהפעיל מחדש את "Auto-eucentric by stage tilt"; זה יכול לפתור בעיות אם הגובה האוצנטרי רחוק מ-0. אם זה יצליח, אפשר להריץ מחדש את "Auto-eucentric by stage tilt" עם הגדרות קבועות מראש של "גובה אאוצנטרי" כדי לשפר את הדיוק. אם זה נכשל, ניתן להריץ "Auto-Eucentric על ידי הטיית קרן" עם הגובה eucentric preset ולאחר מכן להפעיל מחדש "Auto-Eucentric על ידי הטיה שלב" או להגדיר באופן ידני את גובה z מאוחד על ידי "Auto-Eucentric על ידי הטיית קרן" בממשק המשתמש TEM תחת הגדרות "שלב". במקרה שנעשה שימוש ברשתות עם תבנית חוזרת של חורים, הן עשויות למנוע זיהוי של שיא מתאם צולב יחיד. אפשר לנסות לשנות את הגובה האוצנטרי שנקבע מראש להיסט defocus נמוך יותר כגון −25 מיקרומטר ו/או זמן חשיפה קצר יותר כדי להפחית את המתאם הצולב מתבניות החורים. מצד שני, שימוש ברשתות שרוכים/לאמלה עשוי שלא לספק איתות מספיק לשיא קורלציה צולבת חזקה. אפשר לנסות לשנות את הגובה האוצנטרי שנקבע מראש להיסט הפחתה גדול יותר כגון −75 מיקרומטר ו/או זמן חשיפה ממושך כדי לשפר את שיא המתאם הצולב. אפשרות נוספת היא להתאים את הגדרות מסנן התמונה; הם יכולים להימצא בכרטיסייה "הכנה". ניתן להגדיר אפשרויות להתאמת קביעות המסנן לערך נמוך (סקירה כללית/Gridsquare), בינוני (גובה Eucentric) והגדלה גבוהה (מעקב/מיקוד) כדי למצוא את שיא המתאם הצולב האופטימלי עבור כל קביעה מוגדרת מראש. הקלט הנדרש הוא תמונה אחת, כלומר ב- 0° ואחת ב- 5°, ולאחר מכן לחיצה על השווה כדי להשוות בין שתי התמונות . הערך ההתחלתי המומלץ עבור אורך הגל הארוך ביותר הוא רבע מסרגל קנה המידה בתמונה ואורך הגל הקצר ביותר הוא רבע מסרגל קנה המידה. אם השיא אינו מזוהה היטב, ניתן לייעל את ההגדרות עד למציאת שיא משכנע. אין צורך לרכוש מחדש תמונות בכל פעם; פשוט לחיצה על "השווה" מספיק. אם TOMO עדיין לא מצליח למצוא באופן אוטומטי את הגובה האאוצנטרי, ניתן להשתמש בכיול הגובה האאוצנטרי הידני. יש להתרכז מעל גביש קרח גדול למדי בהגדלה כללית בכרטיסייה "הכנה", ואז לעבור ל"בקרת הבמה "של ממשק המשתמש של TEM, להגדיר אלפא ל-−30°, ולהתאים את ערך ה-z של השלב כדי למרכז מחדש את הגביש באמצעות תמונת המסך הפלואורסצנטית. בחירה בהגדרות "רזולוציה גבוהה" ו"ניגודיות גבוהה "בממשק המשתמש של TEM תהפוך את זה לפשוט (לחצנים בתחתית חלון המסך הפלואורסצנטי). לחלופין, אם יש גישה למצלמה עם מצב חי, אז זה יכול לשמש כדי לקבוע את הגובה eucentric; זה יהיה קל יותר מאשר על המסך פלואורסצנטי.
המגבלות הגדולות ביותר בגרסאות Tomo5 לפני 5.8 הן מונטאז'ים חסרים של הגדלה בינונית, סכימה סימטרית במינון חסר ובעיות הקשורות למציאת גובה יוצנטרי. אלה קיימים ב- serialEM, תוכנה חופשית עם פיתוח מהיר ותמיכה קהילתית, שגרת גובה אאוצנטרית חזקה, ואפשרות לסקריפט, כלומר, סכימה סימטרית מינון שנבנתה בהתאמה אישית. מגרסה 5.8 ואילך ב-Tomo5, הבעיה הנפוצה ביותר למציאת הגובה האוצנטרי, כלומר לולאה לא מוצלחת סביב ערך z היעד, נפתרה על ידי יישום האפשרות לקבוע קריטריון קבלת גובה יוצנטרי. עם זאת, עם סוגי רשת ודגימות שונים, מומלץ מאוד להתאים את הגדרות מסנן התמונה כדי לשקף את תנאי ההדמיה הייחודיים של הפעלות בודדות ולתת את שיא המתאם הצולב הטוב ביותר האפשרי כדי למצוא את הגובה האאוצנטרי וכדי שאזור המיקוד והמעקב יעבוד באופן אמין במהלך רכישת טומוגרמה.

בסך הכל, מתקנים רבים הסתגלו במהירות להפעלה מרחוק במהלך המגיפה. תוכנת Tomo5 מספקת גישה קלה ומסלול ידידותי למשתמש לטומוגרפיה המתאימה היטב להפעלה מרחוק. ההתקדמות שנעשתה בתוכנה ללא ספק תמשיך להפוך את אוספי הנתונים המרוחקים ואת איסוף הטומוגרפיה באופן כללי למיינסטרים יותר בקהילה.
emClarity מכיוון ש-emClarity משתמשת בשיטת בחירת חלקיקים המבוססת על תבנית, היא זקוקה לתבנית עבור מושא העניין. ליקוט החלקיקים (שלב 2.6) רגיש מאוד ומפתח למבנה הסופי. לפני ממוצע ויישור (שלב 2.9), יש להקפיד לבדוק היטב ולהסיר ידנית את התוצאות החיוביות המוטעות. כאשר תבנית אינה זמינה, emClarity עשויה להיות לא קלה לשימוש, אך ניתן להשתמש בתוכנות אחרות, לדוגמה, Dynamo37 ו- PEET48, כדי ליצור מודל ראשוני.
עבור דוגמאות הטרוגניות, emClarity מצויד בשיטת סיווג המאפשרת למשתמשים להתמקד בתכונות ספציפיות עם קני מידה שונים. כדאי להריץ כמה מחזורים של יישורים לפני הסיווג ולהפעיל אותו בבינינג גבוה יותר (כגון סל 4 או סל 3).
הגרסה העדכנית של התוכנה (V1.5.3.11) כוללת עדכונים משמעותיים בהשוואה למהדורה הראשונה (V1.0)17. אלה כוללים, בין היתר, בדיקת יד במהלך הערכת CTF (שלב 2.3); סימטריה ליישורים (CX, I, I2, O); חישוב פונקציות דגימה תלת-ממדיות לכל חלקיק (3DSF); מעבר ל- MATLAB 2019a לתאימות ויציבות; ושחזור באמצעות תמונות ההקרנה הגולמיות (cisTEM). התוכנה תמשיך להשתפר עבור דוגמאות שונות, ואת ההכרזות החדשות ביותר ניתן למצוא באינטרנט ( ראה טבלת חומרים).

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) ידועה כמי שחוותה תקופת רנסנס, והאיצה אותה להיות כלי מרכזי ושימושי בביולוגיה מבנית. פיתוח ושימוש בגלאי אלקטרונים ישירים 1,2,3, שיפור מיקרוסקופים ומקורות אלקטרונים3,4,5, שיפורים באוטומציה/תפוקה 6,7,8,9, והתקדמות חישובית באנליזה של חלקיקים בודדים10,11,12,13 ,14 וטומוגרפיה15,16,17 אחראים, בין השאר, להצלחה האחרונה של הטכניקה. מניעים טכנולוגיים אלה פיתחו את היכולת של cryo-EM לפתור מבנים מקרומולקולריים ביולוגיים בתנאים קריוגניים וטבעיים. הרזולוציות הניתנות להשגה בקלות מספיקות למידול מדויק מבחינה אטומית והביאו את הטכניקה לחזית זירת הביולוגיה המבנית. גישה רדוקציוניסטית לביטוי וטיהור מטרה ביולוגית מעניינת הוכחה זה מכבר כמוצלחת בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית (MX) למחקר ביולוגי בסיסי, גילוי תרופות ומדע תרגומי. באותה גישה, cryo-EM יכול כעת לספק תוצאות מקבילות למחקרי MX ברזולוציה גבוהה. ההצלחה הגדולה הנוכחית בענף cryo-EM של ביולוגיה מבנית נקראת אנליזה של חלקיקים בודדים (SPA), אשר רוכשת תמונות הקרנה דו-ממדיות בדרך כלל של דגימת חלבון מטוהרת18 כדי לקבל אלפי צפיות של מקרומולקולה ביולוגית19. תמונות אלה (1) מכילות מידע ממגוון תצוגות המייצגות באופן מלא את הכיוונים של המטרה במרחב התלת-ממדי ו-(2) לוכדות את ההטרוגניות הקונפורמית של האובייקט, שמאוחר יותר ניתן להפריד ולחקור אותה.
גישה חלופית לרכישת תמונות הקרנה דו-ממדיות אלה של דגימות ביולוגיות, אפילו באתרן וללא טיהור, היא טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET). Cryo-ET מצלם סדרה של תמונות של אותו אובייקט בזוויות מוטות על ידי סיבוב מכני של הדגימה. לפיכך, ההקרנות הדו-ממדיות שנאספו ב-SPA, המייצגות את התנוחות הזוויתיות של המולקולה המעניינת, נאספות באופן אינהרנטי כחלק מניסוי ההדמיה cryo-ET20. סדרות הטיה טומוגרפיות משוחזרות לאחר מכן לטומוגרמה המכילה ייצוגים תלת-ממדיים של קומפלקסים מקרומולקולריים מצולמים. אופי איסוף הנתונים הטומוגרפיים אכן מקטין במידה מסוימת את ההסתמכות על ממוצע כדי להשיג ייצוג תלת-ממדי מלא של מולקולה מתוך אוסף של תמונות דו-ממדיות. עם זאת, בשל עיצובי השלבים הנוכחיים, הדגימה מוטה בדרך כלל מ- −60° ל- +60°, ומשאירה טריזחסר של 21 מידע בשחזור התלת-ממדי הטומוגרפי.
השחזורים התלת-ממדיים בטומוגרמה אחת כוללים טריז חסר של מידע ואות נמוך לרעש. מקרומולקולות בודדות עשויות להיות מופקות כתת-טומוגרמות וממוצען יחד כדי להתמודד עם זה. כאשר כל מקרומולקולה בתת-טומוגרמה נמצאת בכיוון שונה, הטריז החסר מכוון באופן שונה בכל תת-טומוגרמה של אובייקט המטרה, כך שממוצע על פני עותקים רבים ממלא מידע עקב הטריז החסר. ההתפתחויות האחרונות בעיבוד תמונה ניסו גם לאמן רשתות עצביות של בינה מלאכותית למלא את הטריז החסר בנתונים משמעותיים22. תהליך ממוצע זה גם מגביר את האות לרעש, בדומה למטרה של ממוצע בניתוח חלקיקים בודדים, כך שאיכות השחזור והרזולוציה שלו משתפרות. אם המולקולה המעניינת היא בעלת סימטריה, גם זה עשוי להיות מוגדר ומופעל במהלך הממוצע, מה שמשפר עוד יותר את רזולוציית השחזור. מיצוי נפחים תלת-ממדיים של מקרומולקולה מטומוגרמה לקבוצה של תת-טומוגרמות ועיבודן לאחר מכן נקרא תת-טומוגרמה ממוצעת (STA)23. כאשר כל תת-טומוגרמה מייצגת עותק ייחודי של המולקולה הנחקרת, ניתן לחקור כל הטרוגניות מבנית באמצעות זרימת העבודה של STA. כפי שמקובל להשתמש בתהליך העבודה של SPA, ניתן להשתמש בטכניקות סיווג במהלך STA כדי לנתח את המצבים הקונפורמיים של מכלול העניין. בנוסף ל-STA המאפשר שחזור ברזולוציה גבוהה ב-cryo-ET, גישה זו הופכת את הטכניקה לכלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים המבניים של מקרומולקולות בסביבה התאית הטבעית שלהן או של מטרות שלעתים קרובות אינן מקובלות על SPA24,25,26.
לטומוגרפיה של אלקטרונים יש היסטוריה ארוכה של קביעת המבנה האולטרה-ממדי התלת-ממדי של דגימות תאיות בטמפרטורת החדר27. רכישת תצוגות על ידי הטיה פיזית של הדגימה מספקת מספיק מידע לשחזור תלת-ממדי של אובייקט בסקאלות באורך תאי, והיא חשובה במיוחד כאשר מבנים תאיים חסרים את הסדירות לממוצע. תאים עשויים גם להיות מוקפאים על מצעים לצורך הדמיה cryo-ET בקצוות התא שבהם הדגימה דקה מספיק כדי להיות שקופה אלקטרונים. בתנאים אלה, ניתן להשתמש ב-STA כדי לקבוע מבנים מקרומולקולריים בסביבה תאית, אם כי כאשר הדגימה דקה מספיק כדי להיות אלקטרון שקוף28. עם זאת, בשילוב עם טכניקות הכנה נוספות, כולל אור קריו-קורלטיבי ומיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-CLEM) וכרסום קרן יונים ממוקד (cryo-FIB), cryo-ET יכול לשמש להדמיה בתוך תאים שלמים בתנאים קריוגניים29. זה מפגיש את הכוח של cryo-ET לחקור את האולטרה-מבנה התאי עם הכוח של STA כדי לקבוע את המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים באתרם תוך זיהוי המיקום התאי שלהם30 ומתן תמונות של קומפלקסים העוסקים בתהליכים דינמיים31. היכולת של הטכניקה לדמות דגימות תאיות ולהשתמש ב-STA במספר מחקרים הדגישה את כוחה של הטכניקה לפתור מבנים מקרומולקולריים באתרם, אפילו ברזולוציות דומות ל-SPA32. יתרון נוסף נמצא בידע על המיקום המקורי של המקרומולקולה, המיוצג על ידי השחזור התלת-ממדי המסווג הסופי בטומוגרמה30. לכן, המבנה המקרומולקולרי יכול להיות מתואם עם אולטרה-מבנה התא. תצפיות אלה על פני סולמות אורך יובילו ככל הנראה לממצאים חשובים שבהם מנגנונים מבניים עשויים להיות מתואמים עם שינויים תאיים בהקשר של מחקרים פונקציונליים.
Cryo-ET ו- STA מאפשרים איסוף נתונים בשלוש זרימות עבודה עיקריות: טומוגרפיה מולקולרית, סלולרית ולמלה. המבנים של קומפלקסים מקרומולקולריים מטוהרים עשויים להיקבע על ידי cryo-ET על ידי טומוגרפיה מולקולרית. קביעת מבנים חלבוניים בסביבה התאית שלהם שבה התא דק מספיק עשויה להיות מתוארת כטומוגרפיה תאית. לאחרונה, עם התפתחות המיקוד והטחינה הקריוגניים, אותן טכניקות עשויות להיות מיושמות בתהליכי עבודה של טומוגרפיה של למלה כדי לקבוע את מבני החלבון בעומק התא בסביבתם הטבעית, תוך חשיפת ההקשר התאי שבו חלבונים אלה נצפים. ניתן להשתמש באסטרטגיות איסוף נתונים שונות בהתאם לחבילות התוכנה הזמינות, והכי חשוב, בהתאם לדרישת הדגימה. דגימות מולקולריות או לא דביקות ברשת TEM מנחושת של חלבון מטוהר דורשות בדרך כלל פחות טיפול, ולכן נשארות שטוחות ולא ניזוקות במקרים אידיאליים. ניתן להגדיר בקלות טומוגרמות אלקטרונים בסדרות על פני רשת פחמן חורים כדי להשיג במהירות עשרות עד מאות טומוגרמות באופן שיטתי. הדרך הפשוטה ביותר עבור משתמשים להגדיר דגימות טומוגרפיה מולקולרית שבהן חלבונים נמצאים בשפע ברשת היא להשתמש ב- Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדית המשמשת במחקר הנוכחי, ראה טבלת חומרים). תוכנות טומוגרפיה אחרות כגון Leginon9 ו- serialEM6 זמינות גם כן; הם מציעים אפשרויות הגדרה רבות יותר לגישות מותאמות אישית יותר לאיסוף נתונים, אך הם מורכבים יותר וכתוצאה מכך יכולים להיות קשים יותר לניווט, במיוחד עבור משתמשים חדשים בטומוגרפיה ומשתמשים הניגשים להפעלה שלהם מרחוק. עבור מתקן עם בסיס משתמשים גדול ומגוון, Tomo5 קל לתפעול בסביבה מרוחקת ולהכשרת משתמשים פנימה. עבור תאים דבקים, רשתות דורשות בדרך כלל יותר שלבי טיפול, והצורך להשתמש ברשתות זהב שבריריות מגביר את הצורך בטיפול משופר באסטרטגיות טיפול ואיסוף נתונים. כדי להקל על מציאת אזור סלולרי מעניין ולמנוע חסימה מהרשת עצמה בזוויות הטיה גבוהות, כדאי גם להשתמש בגדלים גדולים יותר של רשת, אך במחיר שהם שבירים יותר מטבעם. עבור דגימות lamella, השבריריות של המדגם נקבעת על ידי איכות lamella, אשר יכול להיות משתנה. גורמים אלה מגדילים את זמן ההתקנה ואת השיקולים, אך יכולת ההסתגלות והחוסן המוגברים שוב הופכים את Tomo5 למתאים לסוג זה של איסוף נתונים. עם זאת, קיימים תרחישי איסוף נתונים מיוחדים עבור כל זרימת עבודה. BISECT ו- PACE-tomo (שניהם פועלים ב- SerialEM) מציגים את האפשרות של הזזת תמונת קרן סקריפטית במהלך רכישת טומוגרפיה כדי להגביר את מהירות איסוף הטומוגרמה28, במיוחד בטומוגרפיה מולקולרית. מונטאז'ים של הגדלה בינונית (MMM) ב- SerialEM 6,7,33 יכולים לזהות טוב יותר ולמקד במדויק תכונות מולקולריות בכל זרימות העבודה, אם כי, בזמן הכתיבה, תכונות אלה מתחילות להיות מיושמות ב- Tomo5.
כמו SPA, cryo-ET ו- STA הופכים לנגישים יותר ויותר באמצעות השיפורים שבוצעו בתוכנת הרכישה ושפע של חבילות זמינות עבור תת-טומוגרמה בממוצע 16,17,32,34,35,36,37,38. בנוסף, במהלך המגפה, מתן גישה מרחוק למכשור cryo-EM הפך חיוני להמשך פעולתם של מתקנים לאומיים כמו מרכז הביו-הדמיה של אלקטרונים (eBIC) במקור אור יהלום (DLS), בריטניה. התפתחויות אלה הפכו את cryo-ET לנגיש וחזק יותר עבור חוקרים המעוניינים להשתמש בטכניקה. לאחר רכישת הנתונים, STA הוא כלי חיוני לניתוח אובייקטים חוזרים ונשנים כדי להשיג שחזור ברזולוציה מקסימלית ולאפשר סיווג של הטרוגניות מקרומולקולרית. הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק סקירה מפורטת של הכנת מיקרוסקופ cryo-TEM לאיסוף נתוני cryo-ET וכיצד לבצע ממוצע תת-טומוגרמה באמצעות emClarity על מערך נתוני טומוגרפיה מולקולרית של אפופריטין כדוגמה. השימוש ב-emClarity (תוכנה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה וממוצע תת-טומוגרמה, ראו טבלת חומרים) דורש הרצת סקריפטים משורת הפקודה, כך שמניחים רמה של היכרות עם מערכות לינוקס/UNIX.
החיבור מרחוק תלוי בסביבת הרשת בכל מכון/מתקן. ב- eBIC, המערכת המרוחקת משתמשת בתוכניות המאפשרות איסוף נתונים מרחוק בתצורת הרשת הספציפית המשמשת ב- Diamond. חיבור מרחוק למיקרוסקופ מתאפשר על ידי שתי פלטפורמות: NoMachine ו- TeamViewer (ראה טבלת חומרים). באמצעות התוכנית NoMachine, המשתמש יכול להיכנס לשולחן עבודה מרוחק של Windows. שולחן העבודה המרוחק של Windows המסופק על ידי NoMachine שוכן באותה רשת כמו המיקרוסקופ, ובכך פועל כמחשב תמיכה וירטואלי למיקרוסקופ. ממחשב התמיכה הווירטואלי, המשתמש מתחבר למיקרוסקופ באמצעות TeamViewer ומספק גישה ובקרה ישירה למחשב המיקרוסקופ שבו פועל TUI ו-Tomo.
הפרוטוקול הנוכחי מורכב משני חלקים (שלב 1 ושלב 2). שלב 1 מתמקד בקליטת נתונים מרחוק של cryo-ET באמצעות Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדיים). ההדרכה עבור הפעלה (מרוחקת) לוכדת תמונות בהגדלות גבוהות יותר ויותר כדי לאפשר בסופו של דבר למשתמש לכוון את תוכנת הטומוגרפיה להתמקד באזורי דגימה לאיסוף נתונים טומוגרפיים. איור 1 מסכם את התהליך הזה. שלב 2 מפרט עיבוד נתונים של cryo-ET STA באמצעות emClarity (תוכנה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה וממוצע תת-טומוגרמה). איור 9 מסכם את התהליך הזה.
הפרוטוקול מיועד לקהל מרוחק. היא מניחה שהאדם שנמצא פיזית במיקרוסקופ וטעינת הדגימות עשה את היישורים הישירים ודאג לכוונון המצלמה ולרכישת ייחוס. עבור פרוטוקול זה, מערכת עדשה של שלושה קונדנסור עם autoloader הוא הניח. לקבלת הנחיות מפורטות נוספות על תוכנת הטומוגרפיה, מדריך מפורט של היצרן זמין בלחצן התחל של Windows שממנו נטענה התוכנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים (cryo-ET) צוברת תאוצה בשנים האחרונות, במיוחד מאז כניסתם של גלאי אלקטרונים ישירים, אסטרטגיות רכישה אוטומטיות משופרות, טכניקות הכנה המרחיבות את האפשרויות של מה שמיקרוסקופ האלקטרונים יכול לדמות ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-ET ותוכנה חדשה לחישוב תת-טומוגרמה. בנוסף, רכישת נתונים הפכה ליעילה יותר ויותר, מה שהופך אותם לנגישים יותר למשתמשים רבים. מגיפת SARS-CoV-2 האיצה עוד יותר את איסוף הנתונים של מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים מרחוק (cryo-EM), במיוחד עבור cryo-EM של חלקיקים בודדים, במתקנים רבים ברחבי העולם, ומספקת למשתמש גישה ללא הפרעה למכשירים חדישים במהלך המגיפה. עם ההתקדמות האחרונה ב- Tomo5 (תוכנה לטומוגרפיה של אלקטרונים תלת-ממדיים), איסוף נתוני cryo-ET מרחוק הפך חזק וקל לטיפול מכל מקום בעולם. מאמר זה נועד לספק הדרכה מפורטת, החל מהגדרת איסוף הנתונים בתוכנת הטומוגרפיה לתהליך של מפגש איסוף נתונים (מרחוק) cryo-ET עם פתרון בעיות מפורט. פרוטוקול איסוף הנתונים (המרוחק) משלים עוד יותר את זרימת העבודה לקביעת מבנה ברזולוציה כמעט אטומית על ידי תת-טומוגרמה ממוצעת עם emClarity, תוך שימוש באפוסטריטין כדוגמה.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

פרוטוקול זה מספק נתיב גישה קל לעולם הפופולרי יותר ויותר אך המורכב של טומוגרפיה של אלקטרונים קריו. ניתן לדמות שש דגימות תאיות. מכון קרוב למדינת מולדת.לאחר מכן ניתן לפתור מיקרומולקולות ברזולוציה גבוהה בסביבה התאית הטבעית שלהן באמצעות ממוצע CROW, ET ותת-אטומים. התחל על ידי הפעלת תוכנת Tomo חמש ממחשב שרת TEM. התחל את הגדרת ההפעלה על-ידי התאמת הפרמטרים של רכישת התמונה בכרטיסיית ההכנה, תחת קביעות מוגדרות מראש.העתיקו את הפרמטרים של רכישת תמונה לכל שאר קביעות ההגדלה הגבוהות המוגדרות מראש. לחץ על Set"כדי להגדיר חשיפה למיקרוסקופ ועל Get" כדי לקבל את הגדרות החשיפה לכל ההגדלות הגבוהות האחרות לאחר בחירתן בנפרד. כדי לאסוף אטלס, לחץ על ההפעלה החדשה"בכרטיסייה אטלס".הגדר את העדפות ההפעלה. הזן את נתיב האחסון ואת פורמט הפלט ולחץ על apply. בחר הקרנה"וסמן את כל האטלסים שיירכשו.בחר שסתומי קריאה סגורים"אם המיקרוסקופ אינו מפוקח זה יסגור את שסתומי העמודה. לאחר מכן כדי להתחיל את ההקרנה, לחץ על לחצן התחל. בדוק את האטלסים הבודדים או המרובים לאיתור מטרות על-ידי לחיצה על הרשת בחלונית השמאלית תחת Session Setup"לאחר מכן לחץ שמאלה וגרור את העכבר כדי לנוע ולגלול באמצע כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה.בחר את הרשת להגדרת היעד. בחר אותו ולחץ על טען דוגמה"מתוך התוכנה. כדי לבצע כיול הזזת תמונה, בכרטיסייה "פונקציות אוטומטיות" הגדר את הקביעה המוגדרת מראש לגובה Eucentric"נווט ל- Auto-Eucentric" לפי הטיית שלב, ולחץ על התחל.אם התכונה נשארה ממורכזת במהלך המיקוד, דלג על כיול הזזת התמונה. אחרת, עבור אל הכרטיסייה "הכנה" לכיול הזזת תמונה בחר כיול Image Shift" ולחץ על התחל. פעולה זו תתאים את ההגדלה הנמוכה יותר לתכונה המרוכזת בהגדלת החשיפה.עבור הגדרת טומוגרפיה, התחל הפעלה חדשה ב- Session Setup"עבור דגימות ביולוגיות. בחר Slab כמו"כסוג המדגם ובחר אצווה "ומינון נמוך"ואז בחר את פורמט הפלט ואת תיקיית האחסון". לחלופין, הוסף נמען דוא"ל ולחץ על החל"כדי להגדיר יעדים, עבור אל חץ האטלס, מצא אזור עניין ועבור על ידי בחירת האפשרויות שצצות בלחיצת עכבר ימין.צלם תמונת סקירה כדי לאשר מיקום טוב להתאמת גובה Eucentric. לאחר מכן לחץ על autoeucentric"כדי להפעיל את שגרת ההטיה של eucentric על ידי שלב, קבל מחדש תמונת סקירה חדשה כדי לעדכן את הגובה eucentric. בדוק את הסקירה המרובעת או את מפת החיפוש שנרכשה.עבור לאזור עניין ולחץ על חיפוש רכישה. לאחר מכן בדוק את תמונת החיפוש אם אזור העניין אינו ממורכז, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני במיקום הרצוי וחזור על שלב ההזזה כאן"ורכוש תמונה. התאם את אזורי המיקוד והמעקב.לחץ לחיצה שמאלית כדי לגרור את אזורי המעקב והמיקוד. לאחר הגדרת כל הפרמטרים לחץ על הוסף מיקום"כדי לבצע פונקציות אוטומטיות בדוק את ההגדרות לביצוע היישורים באמצעות הכרטיסייה פונקציות אוטומטיות על ידי ניווט האטלס לאזור של פחמן. הביאו את האזור הזה לגובה האוצנטרי ועקבו אחר סדר היישורים כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.לאחר מכן, התחל את הרכישה האוטומטית של הכרטיסייה טומוגרפיה. בחר את לוח איסוף הנתונים"sboard החוצה ולהגדיר את הפרמטרים הרצויים. הגדר פרמטרים לרכישת נתונים: צעד הטיה, זווית חיובית מקסימלית, זווית שלילית מקסימלית, ערכת מעקב.לאחר מכן בחר סגור שסתומי עמודה"עבור ערכת הגובה האוצנטרית. התחל בהכנת קבצי קלט וספריות. צור תיקיית פרוייקט תחת התיקיה "פרוייקט".צור ערימות תיקיות קבועות חדשות נוספות והכן את קבצי הקלט. סדרת הטיה אחת קבועה סדרת הטיה 1. XF וסדרת הטיה 1.tlt.כדי לחשב את defocus, עדכן את קובץ הפרמטרים עם המיקרוסקופ ופרמטרי ההדמיה. העתק קובץ פרמטר לתיקיית הפרוייקט. שנה את שמו ל- param_CTF.M והפעל את הפקודה המצוינת. לאחר מכן, בדוק את תוצאות הערכת ה- CTF. עבור כל ערימה, בדוק את הערימות המיושרות באמצעות מוד תלת-ממדי וודא שהחרוזים הפידוקיאליים נמחקים כהלכה.ודא שהיד נכונה על-ידי הפעלת הפקודה שצוינה. לאחר מכן בדוק את ערך ההפחתה וודא שהוא תואם לאומדן CTF התיאורטי. כדי להגדיר את אזורי המשנה, צור טומוגרמה מכופפת.בתיקיית הפרוייקט, הפעל את הפקודה שצוינה. קבע את הגבולות על-ידי בחירת שש נקודות Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin ו- Zmax, כדי ליצור אזור משנה אחד מתחת לסל התיקיות10, הפעל את הפקודה שצוינה. לאחר מכן, הפעל את בחירת החלקיקים עבור כל תת-אזור.עבור מערך הנתונים apoferritin לבצע חיפוש תבנית בפח שש. שנה את זווית הקו התחתון של התבנית. פרמטרי חיפוש כדי לקבוע את הזווית, הטווח והמרווחים עבור חיפוש במישור או מחוץ למישור במעלות.בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודה שצוינה. הסר את החלקיקים השגויים באמצעות מוד תלת-ממדי מתחת לתיקייה. Convmap_wedge_Type2_bin6. הפעל את הפקודה שצוינה.לאחר מכן, אתחל את הפרויקט. בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודה המצוינת כדי ליצור מסד נתונים לבהירות EM, AppoF.mat. בצע שחזור טומוגרמה לפני תת-טומו ממוצע ויישור כדי ליצור טומוגרמות תת-אזור מתוקנות CTF ב- bin4, הפעל את הפקודה שצוינה.לאחר מכן, כדי לבצע ממוצע ויישור תת-טומו, בצע את הממוצע באמצעות מברק המשנה המתוקן CTF החל מ- bin4. בתיקיית הפרוייקט, הפעל את הפקודה שצוינה. המשך לבצע יישורים והפעל את הפקודה.נקה את החלקיקים החופפים על-ידי הפעלת הפקודה שצוינה. בצע שחזור סופי על-ידי שילוב שתי ערכות הנתונים למחצה. בתיקיית הפרויקט הפעל את הפקודות שצוינו.סקירה כללית של תהליך הטומוגרפיה עבור הטומוגרפיה התאית והמולקולרית מוצגת כאן עבור דגימות תאיות ולמלה, אסטרטגיית איסוף הנתונים תלויה במידה רבה בדגימה ובמטרה של מחקר ההדמיה. פרמטרי איסוף עבור מספר מחקרי cryo ET מוצגים כאן. טומוגרמות מייצגות של דגימות מולקולריות כגון אפופריטין, תהליכים תאיים דקים וקרן יונים ממוקדת טחונה למלה של דגימת התא העבה מוצגות כאן.ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה יכול לעזור לחשוף אתרי קשירה למטרות תרופות וטומוגרפיה וממוצע תת-טומוגראלי סייעו גם בפיתוח חיסון נגד SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

מי ים דגימה אוסף

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

איסוף וזיהוי אבקה ממושבות דבורי דבש

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

בניית מודל שלד סוסים מציאותי, שלם,שלם, תלת-ממדי, באמצעות נתוני טומוגרפיה ממוחשבים

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...