Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Riconosciamo Diamond Light Source per l'accesso e il supporto delle strutture crio-EM presso l'Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) del Regno Unito, finanziato da Wellcome Trust, MRC e BBRSC. Vorremmo anche ringraziare Andrew Howe per l'acquisizione del tomogramma Apoferritina (Movie 1), Ishika Kumar per la preparazione e l'acquisizione del tomogramma neuronale (Movie 2) e Craig MacGregor-Chatwin per il tomogramma lamella-cianobacteria (Movie 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Tomo5 La descrizione del flusso di lavoro del software di tomografia evidenzia un modo potenziale e più semplificato per una configurazione della sessione di tomografia batch (remota). Mentre il software è facile per i principianti, una certa esperienza iniziale di crio-EM e la comprensione della tomografia di base possono aiutare con la configurazione. I passaggi critici sono evidenziati nel protocollo e dovrebbero aiutare a risolvere i problemi anche se è stato utilizzato un approccio di installazione diverso. L'avanzamento del software faciliterà la raccolta dei dati (remoti) e renderà la crio-ET più accessibile a un'ampia base di utenti. Di seguito sono descritti alcuni suggerimenti e trucchi che possono aiutare a risolvere i problemi più frequenti.
Un punto importante da discutere è la scelta delle griglie perché, quando si inclina il campione a ±60°, le barre della griglia ad inclinazioni elevate possono oscurare la vista (Figura 8). Su una griglia TEM, la dimensione della maglia si riferisce al numero di quadrati della griglia per unità di lunghezza della griglia. I numeri di mesh più grandi hanno più quadrati della griglia per lunghezza unitaria, una maggiore densità di quadrati della griglia e quadrati della griglia più piccoli, cioè una griglia a 400 maglie ha quadrati più piccoli di una griglia a 200 maglie. Una buona scelta di griglie per la tomografia è griglie a 200 o 300 maglie. Come mostrato nella Figura 8, l'area disponibile per raccogliere si riduce quando la griglia viene inclinata. Con un'inclinazione di ±60°, una griglia a 300 maglie avrà un piccolo campo visivo su cui è possibile acquisire un tomogramma completo. I vantaggi delle griglie a 200 maglie sono che i quadrati della griglia più grandi rendono più veloce la configurazione della tomografia molecolare e, con l'aumento dell'area del quadrato della griglia, un quadrato sarà probabilmente sufficiente per una raccolta notturna. Lo svantaggio è che le griglie a 200 maglie sono più fragili, quindi la manipolazione e il taglio richiedono più finezza.
Inoltre, se si utilizza una pellicola di supporto holey (vedi Tabella dei materiali) su griglie EM, la spaziatura dei fori deve essere considerata per l'impostazione della regione di messa a fuoco e di tracciamento in relazione alla regione di esposizione. Idealmente, il diametro del fascio all'ingrandimento desiderato dovrebbe essere abbastanza piccolo da coprire l'area di carbonio adiacente all'area di esposizione lungo l'asse di inclinazione per una configurazione ottimale e veloce. In questo modo, è possibile acquisire potenziali regioni di interesse in ciascun foro.
Poiché la routine di altezza eucentrica del software non è attualmente così robusta, come la routine serialEM, i seguenti suggerimenti possono aggirare il problema. Se la determinazione dell'altezza eucentrica fallisce utilizzando il preset di altezza eucentrica, è possibile utilizzare invece il preset di panoramica ed eseguire nuovamente "Auto-eucentrico per inclinazione dello stadio"; Questo può risolvere i problemi se l'altezza eucentrica è lontana da 0. Se ciò riesce, è possibile eseguire nuovamente "Auto-eucentric by stage tilt" con i preset "Eucentric Height" per migliorare la precisione. Se fallisce, è possibile eseguire "Auto-Eucentric by beam tilt" con il preset eucentric height e quindi ri-eseguire "Auto-Eucentric by stage tilt" o impostare manualmente l'altezza z consolidata da "Auto-Eucentric by beam tilt" nell'interfaccia utente TEM sotto le impostazioni "Stage". Nel caso in cui vengano utilizzate griglie con uno schema ripetuto di fori, possono impedire l'identificazione di un singolo picco di correlazione incrociata. Si può provare a modificare l'altezza eucentrica preimpostata con un offset di sfocatura inferiore come -25 μm e / o un tempo di esposizione più breve per ridurre la correlazione incrociata dai modelli di foro. D'altra parte, l'uso di griglie / lamelle lacey potrebbe non fornire un segnale sufficiente per un forte picco di correlazione incrociata. Si può provare a modificare l'altezza eucentrica preimpostata con un maggiore offset di sfocatura come -75 μm e / o un tempo di esposizione esteso per migliorare il picco di correlazione incrociata. Un'altra opzione è regolare le impostazioni del filtro immagine; possono essere trovati nella scheda "Preparazione". Le opzioni per regolare le impostazioni del filtro possono essere impostate per ingrandimento basso (Panoramica / Gridsquare), medio (altezza eucentrica) e alto (Tracking / Focus) per trovare il picco di correlazione incrociata ottimale per ciascun preset. L'input richiesto è un'immagine, cioè a 0° e una a 5°, seguita da Confronta per confrontare entrambe le immagini. Il valore iniziale consigliato per la lunghezza d'onda più lunga è un quarto della barra della scala nell'immagine e per la lunghezza d'onda più corta è un quarantesimo della barra della scala. Se il picco non è identificato in modo robusto, è possibile ottimizzare le impostazioni fino a quando non si trova un picco convincente. Non è necessario riacquisire immagini ogni volta; basta premere "Confronta". Se TOMO non riesce ancora a trovare automaticamente l'altezza eucentrica, è possibile utilizzare la calibrazione manuale dell'altezza eucentrica. Si dovrebbe centrare su un cristallo di ghiaccio ragionevolmente grande nell'ingrandimento generale nella scheda "Preparazione", quindi andare al "Controllo scenico" dell'interfaccia utente TEM, impostare alfa a -30 ° e regolare il valore z dello stadio per ricentrare il cristallo usando l'immagine dello schermo fluorescente. La selezione delle impostazioni "Alta risoluzione" e "Contrasto elevato" nell'interfaccia utente TEM renderà questo semplice (pulsanti nella parte inferiore della finestra dello schermo fluorescente). Opzionalmente, se c'è accesso a una telecamera con modalità live, questo può essere utilizzato per determinare l'altezza eucentrica; Sarà più facile che sullo schermo fluorescente.
Le maggiori limitazioni nelle versioni Tomo5 precedenti alla 5.8 sono i montaggi di ingrandimento medio mancanti, lo schema simmetrico della dose mancante e i problemi relativi alla ricerca dell'altezza eucentrica. Questi esistono in serialEM, un freeware con rapido sviluppo e supporto della comunità, una robusta routine di altezza eucentrica e l'opzione di script, cioè uno schema simmetrico di dose personalizzato. Dalla versione 5.8 in poi in Tomo5, il problema più comunemente riscontrato per trovare l'altezza eucentrica, cioè un looping non riuscito attorno al valore z target, è stato risolto implementando l'opzione di impostare un criterio di accettazione dell'altezza eucentrica. Tuttavia, con diversi tipi di griglia e campione, si consiglia vivamente di regolare le impostazioni del filtro immagine per riflettere le condizioni di imaging uniche delle singole sessioni e per fornire il miglior picco di correlazione incrociata possibile per trovare l'altezza eucentrica e per far funzionare in modo affidabile la regione di messa a fuoco e di tracciamento durante l'acquisizione del tomogramma.

Nel complesso, molte strutture si sono rapidamente adattate al funzionamento remoto durante la pandemia. Il software Tomo5 fornisce un facile accesso e un percorso intuitivo alla tomografia che è adatto per il funzionamento remoto. I progressi compiuti nel software continueranno senza dubbio a rendere le raccolte di dati remoti e la raccolta di tomografie in generale più mainstream nella comunità.
emChiarezza Poiché emClarity utilizza un metodo di prelievo delle particelle basato su modelli, ha bisogno di un modello per l'oggetto di interesse. La raccolta delle particelle (fase 2.6) è molto sensibile e fondamentale per la struttura finale. Prima di calcolare la media e l'allineamento (passaggio 2.9), è necessario assicurarsi di controllare attentamente e rimuovere manualmente i falsi positivi. Quando un modello non è disponibile, emClarity potrebbe non essere facile da usare, ma è possibile utilizzare altri software, ad esempio Dynamo37 e PEET48, per creare un modello iniziale.
Per campioni eterogenei, emClarity è dotato di un metodo di classificazione che consente agli utenti di concentrarsi su caratteristiche specifiche con scale diverse. È utile eseguire alcuni cicli di allineamenti prima della classificazione ed eseguirli a un binning più alto (ad esempio bin 4 o bin 3).
La versione aggiornata del software (V1.5.3.11) presenta aggiornamenti significativi rispetto alla prima versione (V1.0)17. Questi includono, ma non sono limitati a, un controllo della mano durante la stima della CTF (fase 2.3); simmetria per allineamenti (CX, I, I2, O); calcolo delle funzioni di campionamento 3D per particella (3DSF); un passaggio a MATLAB 2019a per compatibilità e stabilità; e ricostruzione utilizzando le immagini di proiezione grezze (cisTEM). Il software continuerà a migliorare per vari campioni e gli annunci più recenti possono essere trovati online (vedi Tabella dei materiali).

La microscopia elettronica criogenica (crio-EM) è ampiamente nota per aver vissuto un periodo rinascimentale, accelerandolo per diventare uno strumento centrale e centrale utile nella biologia strutturale. Lo sviluppo e l'utilizzo di rivelatori di elettroni diretti 1,2,3, microscopi e sorgenti di elettroni migliorati 3,4,5, miglioramenti nell'automazione/throughput 6,7,8,9 e progressi computazionali nell'analisi di singole particelle10,11,12,13 ,14 e la tomografia15,16,17 sono tutti, in parte, responsabili del recente successo della tecnica. Questi driver tecnologici hanno sviluppato la capacità della crio-EM di risolvere strutture macromolecolari biologiche in condizioni criogeniche e native. Le risoluzioni facilmente ottenibili sono sufficienti per una modellazione atomicamente accurata e hanno portato la tecnica alla ribalta nell'arena della biologia strutturale. Un approccio riduzionista per esprimere e purificare un bersaglio biologico di interesse si è da tempo dimostrato efficace nella cristallografia macromolecolare (MX) per la ricerca biologica di base, la scoperta di farmaci e la scienza traslazionale. Con lo stesso approccio, la crio-EM può ora fornire risultati paralleli agli studi MX ad alta risoluzione. L'attuale grande successo nel ramo crio-EM della biologia strutturale è chiamato analisi a singola particella (SPA), che acquisisce immagini di proiezione 2D tipicamente di un campione di proteina purificata18 per ottenere migliaia di viste di una macromolecola biologica19. Queste immagini (1) contengono informazioni provenienti da una serie di viste che rappresentano pienamente gli orientamenti del target nello spazio 3D e (2) catturano l'eterogeneità conformazionale dell'oggetto, che può essere successivamente separata e studiata.
Un approccio alternativo all'acquisizione di queste immagini di proiezione 2D di campioni biologici, anche in situ e senza purificazione, è la tomografia crioelettronica (cryo-ET). Cryo-ET scatta una serie di immagini dello stesso oggetto ad angoli inclinati ruotando meccanicamente il campione. Pertanto, le proiezioni 2D raccolte in SPA, che rappresentano le pose angolari della molecola di interesse, sono intrinsecamente raccolte come parte dell'esperimento di imaging crio-ET20. Le serie di inclinazioni tomografiche vengono quindi ricostruite in un tomogramma che contiene rappresentazioni 3D dei complessi macromolecolari ripresi. La natura della raccolta di dati tomografici diminuisce, in una certa misura, la dipendenza dalla media per ottenere una rappresentazione 3D completa di una molecola da una raccolta di immagini 2D. Tuttavia, a causa degli attuali progetti di stadio, il campione è tipicamente inclinato da -60 ° a + 60 °, lasciando un cuneo mancante21 di informazioni nella ricostruzione tomografica 3D.
Le ricostruzioni 3D in un singolo tomogramma hanno quindi un cuneo mancante di informazioni e un basso segnale al rumore. Le singole macromolecole possono essere estratte come sottotomogrammi e mediate insieme per affrontare questo problema. Dove ogni macromolecola in un sottotomogramma si trova con un orientamento diverso, il cuneo mancante è orientato in modo diverso in ogni sottotomogramma dell'oggetto bersaglio, quindi la media su molte copie riempie le informazioni a causa del cuneo mancante. I recenti sviluppi nell'elaborazione delle immagini hanno anche tentato di addestrare le reti neurali di intelligenza artificiale a riempire il cuneo mancante con dati significativi22. Questo processo di calcolo della media aumenta anche il rapporto segnale/rumore, simile all'obiettivo di fare la media nell'analisi delle singole particelle, in modo da migliorare la qualità e la risoluzione della ricostruzione. Se la molecola di interesse possiede simmetria, anche questa può essere definita e impiegata durante la media, migliorando ulteriormente la risoluzione della ricostruzione. L'estrazione di volumi 3D di una macromolecola da un tomogramma in un insieme di sottotomogrammi e la loro successiva elaborazione è nota come subtomogramma averaging (STA)23. Laddove ogni subtomogramma rappresenti una copia unica della molecola studiata, qualsiasi eterogeneità strutturale può essere interrogata utilizzando il flusso di lavoro STA. Come comunemente utilizzato nel flusso di lavoro SPA, le tecniche di classificazione possono essere impiegate durante STA per sezionare gli stati conformazionali del complesso di interesse. Oltre a consentire la ricostruzione ad alta risoluzione in crio-ET, questo approccio rende la tecnica un potente strumento per interrogare i meccanismi strutturali delle macromolecole nel loro ambiente cellulare nativo o di bersagli spesso non suscettibili di SPA24,25,26.
La tomografia elettronica ha una lunga storia di determinazione dell'ultrastruttura 3D di campioni cellulari a temperatura ambiente27. L'acquisizione di viste mediante inclinazione fisica del campione fornisce informazioni sufficienti per la ricostruzione 3D di un oggetto su scale di lunghezza cellulare ed è particolarmente importante quando le strutture cellulari non hanno la regolarità per la media. Le cellule possono anche essere congelate su substrati per l'imaging crio-ET ai bordi delle cellule dove il campione è abbastanza sottile da essere trasparente agli elettroni. In queste condizioni, STA può essere impiegato per determinare le strutture macromolecolari in un ambiente cellulare, anche se quando il campione è abbastanza sottile da essere trasparente agli elettroni28. Tuttavia, se combinato con ulteriori tecniche preparative, tra cui la microscopia crio-correlativa a luce ed elettronica (cryo-CLEM) e la fresatura a fascio ionico focalizzato (cryo-FIB), la crio-ET può essere utilizzata per visualizzare immagini all'interno di cellule intere in condizioni criogeniche29. Questo unisce il potere della crio-ET per studiare l'ultrastruttura cellulare con la potenza di STA per determinare le strutture dei complessi macromolecolari in situ identificando la loro posizione cellulare30 e fornendo istantanee di complessi impegnati in processi dinamici31. La capacità della tecnica di visualizzare campioni cellulari e impiegare STA in diversi studi ha evidenziato la potenza della tecnica per risolvere strutture macromolecolari in situ, anche a risoluzioni paragonabili a SPA32. Un ulteriore beneficio si riscontra nella conoscenza della posizione originaria della macromolecola, rappresentata dalla ricostruzione 3D classificata finale nel tomogramma30. Pertanto, la struttura macromolecolare può essere correlata con l'ultrastruttura cellulare. Queste osservazioni su scale di lunghezza porteranno presumibilmente a risultati importanti in cui i meccanismi strutturali possono essere correlati con i cambiamenti cellulari nel contesto degli studi funzionali.
Cryo-ET e STA consentono la raccolta dei dati in tre flussi di lavoro principali: tomografia molecolare, cellulare e lamellare. Le strutture dei complessi macromolecolari purificati possono essere determinate mediante crio-ET mediante tomografia molecolare. Determinare le strutture proteiche nel loro ambiente cellulare in cui la cellula è abbastanza sottile può essere descritto come tomografia cellulare. Più recentemente, con lo sviluppo del targeting criogenico e della macinazione, queste stesse tecniche possono essere applicate nei flussi di lavoro della tomografia a lamella per determinare le strutture proteiche profonde all'interno della cellula nel loro ambiente nativo, rivelando il contesto cellulare in cui tali proteine sono osservate. È possibile utilizzare diverse strategie di raccolta dati a seconda dei pacchetti software disponibili e, soprattutto, a seconda delle esigenze del campione. I campioni molecolari o non aderenti su una griglia TEM di rame di una proteina purificata richiedono in genere meno manipolazione e, quindi, rimangono piatti e non danneggiati nei casi ideali. I tomogrammi elettronici possono essere facilmente impostati in serie su una griglia holey-carbonio per acquisire rapidamente da decine a centinaia di tomogrammi in modo sistematico. Il modo più semplice per gli utenti di impostare campioni di tomografia molecolare in cui le proteine sono abbondantemente presenti sulla griglia sarebbe quello di utilizzare Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D utilizzato nel presente studio, vedi Tabella dei materiali). Sono disponibili anche altri software di tomografia come Leginon9 e serialEM6; Offrono più opzioni di configurazione per approcci più personalizzati per la raccolta dei dati, ma sono più complessi e di conseguenza possono essere più difficili da navigare, in particolare per gli utenti nuovi alla tomografia e gli utenti che accedono alla loro sessione da remoto. Per una struttura con una base di utenti ampia e diversificata, Tomo5 è facile da utilizzare in un ambiente remoto e da addestrare gli utenti. Per le celle aderenti, le griglie richiedono in genere più passaggi di gestione e la necessità di utilizzare fragili griglie d'oro aumenta la necessità di una maggiore cura nella gestione e nelle strategie di raccolta dei dati. Per facilitare la ricerca di una regione cellulare di interesse ed evitare l'occlusione dalla griglia stessa ad angoli di inclinazione elevati, è anche utile utilizzare maglie di dimensioni maggiori, ma al costo che siano intrinsecamente più fragili. Per i campioni di lamelle, la fragilità del campione è determinata dalla qualità della lamella, che può essere variabile. Questi fattori aumentano i tempi di configurazione e le considerazioni, ma la maggiore adattabilità e robustezza rendono Tomo5 adatto a questo tipo di raccolta dati. Tuttavia, esistono scenari di raccolta dati specializzati per ogni flusso di lavoro. BISECT e PACE-tomo (entrambi eseguiti in SerialEM) introducono la possibilità di uno spostamento del fascio di immagini durante l'acquisizione della tomografia per aumentare la velocità di raccolta del tomogramma28, in particolare nella tomografia molecolare. I montaggi a medio ingrandimento (MMM) in SerialEM 6,7,33 possono identificare meglio e indirizzare con precisione le caratteristiche molecolari in tutti i flussi di lavoro, anche se, al momento della scrittura, queste funzionalità stanno iniziando a essere implementate in Tomo5.
Come SPA, cryo-ET e STA stanno diventando sempre più accessibili attraverso i miglioramenti apportati al software di acquisizione e una vasta gamma di pacchetti disponibili per subtomogrammi con una media di 16,17,32,34,35,36,37,38. Inoltre, durante la pandemia, consentire l'accesso remoto alla strumentazione crio-EM è diventato essenziale per il funzionamento continuo di strutture nazionali come l'Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) presso Diamond Light Source (DLS), Regno Unito. Questi sviluppi hanno reso la crio-ET più accessibile e robusta per i ricercatori che desiderano utilizzare la tecnica. Una volta acquisiti i dati, STA è uno strumento essenziale per analizzare oggetti ricorrenti per ottenere la massima risoluzione di ricostruzione e consentire la classificazione dell'eterogeneità macromolecolare. L'attuale protocollo mira a fornire una procedura dettagliata della preparazione di un microscopio crio-TEM per la raccolta dei dati crio-ET e di come eseguire la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity su un set di dati di tomografia molecolare di apoferritina come esempio. L'uso di emClarity (software per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione e la media dei sottotomogrammi, vedi Tabella dei materiali) richiede l'esecuzione di script dalla riga di comando, quindi si presuppone un livello di familiarità con i sistemi Linux / UNIX.
La connessione remota dipende dall'ambiente di rete in ciascun istituto/struttura. In eBIC, il sistema remoto utilizza programmi che consentono la raccolta remota dei dati sulla specifica configurazione di rete utilizzata da Diamond. La connessione remota al microscopio è facilitata da due piattaforme: NoMachine e TeamViewer (vedi Tabella dei materiali). Utilizzando il programma NoMachine, l'utente può accedere a un desktop remoto di Windows. Il desktop remoto di Windows fornito da NoMachine risiede sulla stessa rete del microscopio e, quindi, funge da PC di supporto virtuale al microscopio. Dal PC di supporto virtuale, l'utente si collega al microscopio tramite TeamViewer fornendo accesso diretto e controllo al PC del microscopio che esegue TUI e Tomo.
Il presente protocollo si compone di due parti (fase 1 e fase 2). La fase 1 si concentra sull'acquisizione remota dei dati cryo-ET utilizzando Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D). Il walk-through per una sessione (remota) cattura le immagini a ingrandimenti sempre più elevati per consentire all'utente di dirigere il software di tomografia verso le aree dei campioni per la raccolta dei dati tomografici. Nella Figura 1 viene riepilogato questo processo. La fase 2 descrive in dettaglio l'elaborazione dei dati cryo-ET STA utilizzando emClarity (software per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione e la media dei sottotomogrammi). Nella Figura 9 viene riepilogato questo processo.
Il protocollo è destinato a un pubblico remoto. Presuppone che la persona fisicamente al microscopio e che carichi i campioni abbia eseguito gli allineamenti diretti e si sia occupata della sintonizzazione della fotocamera e dell'acquisizione dei riferimenti di guadagno. Per questo protocollo, si presume un sistema di lenti a tre condensatori con un caricatore automatico. Per ulteriori linee guida dettagliate sul software di tomografia, un manuale dettagliato del produttore è disponibile nel pulsante Start di Windows da cui è stato caricato il software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

La tomografia crioelettronica (cryo-ET) ha guadagnato slancio negli ultimi anni, soprattutto dopo l'introduzione di rivelatori di elettroni diretti, strategie di acquisizione automatizzate migliorate, tecniche preparative che espandono le possibilità di ciò che il microscopio elettronico può visualizzare ad alta risoluzione utilizzando crio-ET e nuovi software di media dei sottotomogrammi. Inoltre, l'acquisizione dei dati è diventata sempre più snella, rendendola più accessibile a molti utenti. La pandemia di SARS-CoV-2 ha ulteriormente accelerato la raccolta di dati di crio-microscopia elettronica remota (cryo-EM), in particolare per la crio-EM a singola particella, in molte strutture a livello globale, fornendo agli utenti l'accesso ininterrotto a strumenti all'avanguardia durante la pandemia. Con i recenti progressi in Tomo5 (software per la tomografia elettronica 3D), la raccolta di dati crio-ET remoti è diventata robusta e facile da gestire da qualsiasi parte del mondo. Questo articolo ha lo scopo di fornire una procedura dettagliata a partire dalla configurazione della raccolta dati nel software di tomografia per il processo di una sessione di raccolta dati crio-ET (remota) con risoluzione dettagliata dei problemi. Il protocollo di raccolta dati (remoto) è ulteriormente integrato con il flusso di lavoro per la determinazione della struttura a risoluzione quasi atomica mediante media di sottotomogrammi con emClarity, utilizzando l'apoferritina come esempio.

Per i campioni cellulari e lamelle, la strategia di raccolta dei dati dipende in gran parte dal campione e dall'obiettivo dello studio di imaging (Figura 1). L'approccio mirato dipende dal fatto che il bersaglio molecolare sia in situ o preparato dal complesso macromolecolare purificato per campioni di ricostruzione ad alta risoluzione contenenti bersagli molecolari. Per i complessi purificati vetrificati su griglie di holey (carbonio), il targeting può essere semplicemente basato sull'imaging nei fori del film di supporto (carbonio). Per il lavoro in situ , l'approccio di targeting richiede la conoscenza della posizione dell'entità molecolare sulla base di dati correlati o punti di riferimento cellulari noti a basso ingrandimento. I punti di riferimento cellulari sarebbero idealmente identificabili quando si scattano immagini panoramiche e, se sufficienti a localizzare approssimativamente le regioni di interesse, possono fornire un modo rapido per confermare l'identità di destinazione con un'immagine di ricerca. Tuttavia, se gli eventi osservabili sono rari, potrebbero essere necessarie immagini di ricerca a medio ingrandimento per qualificare il target corretto. Le mappe di ricerca sono montaggi di ingrandimento medio delle immagini di ricerca e possono, quindi, rendere molto più facile la ricerca del bersaglio, dove possono essere acquisite a un ingrandimento in cui è visibile la caratteristica di interesse. Le mappe di ricerca possono quindi essere sottoposte a screening per trovare e impostare le posizioni batch di destinazione. Per i campioni contenenti caratteristiche cellulari per la ricostruzione ultrastrutturale, l'approccio di targeting è simile, sebbene ugualmente dipendente dalla visibilità dell'evento cellulare a vari ingrandimenti e dalla sua prevalenza nel campione.
Anche la strategia di acquisizione dei dati deve essere considerata; In tutti i casi, l'obiettivo dello studio determina in gran parte il modo in cui i dati vengono raccolti. Per la ricostruzione dell'ultrastruttura cellulare, un basso ingrandimento (20-5 Å/px) e un ampio campo visivo possono essere appropriati, ma sono necessari ingrandimenti elevati per ricostruire dettagli molecolari o ad alta risoluzione (5-1 Å/px). Un set di dati raccolto a 1,5 Å/px in condizioni ideali sarà fisicamente in grado di produrre solo una ricostruzione alla frequenza di Nyquist di 3,0 Å/px; Tuttavia, in realtà, molti fattori, inclusi ma non limitati allo spessore, alle dimensioni e all'eterogeneità del campione, influenzano tutti la qualità della ricostruzione ottenuta. I parametri di imaging esatti bilanciano anche l'ingrandimento in base all'obiettivo dello studio con il campo visivo per contenere informazioni sufficienti. Questo articolo presenta un caso medio di sottotomogramma che raggiunge 2,86 Å, ma ulteriori studi 17,42,43,44,45 sono presentati nella Tabella 1 per illustrare i parametri di raccolta associati agli studi mirati a risultati diversi17,42,45,46.
Una volta stabilito un flusso di lavoro di targeting e un regime di acquisizione dati per crio-ET, è possibile la raccolta di dati di molti tipi di campioni diversi. I tomogrammi rappresentativi di una varietà di campioni sono presentati qui: campioni molecolari come l'apoferritina (Movie 1), i processi cellulari sottili (Movie 2) e la lamella fresata FIB del campione cellulare spesso (Movie 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica dell'impostazione del flusso di lavoro della tomografia. Il flusso di lavoro di imaging cryo-ET descritto nel protocollo viene mostrato come diagramma di flusso. Le immagini che ci si aspetta di acquisire sono mostrate per il flusso di lavoro cellulare e molecolare. La denominazione presentata segue la convenzione Tomo5, sebbene la maggior parte dei software di acquisizione della tomografia condivida principi comuni per la raccolta di queste immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Figura 2: Scheda Preparazione e condizioni preimpostate di ricerca . (A) Immagine panoramica dell'intera scheda. I predefiniti delle condizioni di imaging sono impostati in questa scheda e "Calibra spostamento immagine" e "Impostazioni filtro immagine" sono disponibili nel menu a discesa "Attività". (B) Zoom avanti del menu a discesa "Preset" in cui ogni preset può essere selezionato per l'impostazione delle singole condizioni di imaging. (C) Immagine raffigurante un ingrandimento adeguato per adattare sia l'esposizione che l'area "Focus and Tracking" nel campo visivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figura 3: Calcolo della dose. Esempi di calcoli di dose per possibili schemi di acquisizione di tomogrammi in cui l'intensità di dose è stata misurata sotto vuoto. I due calcoli determinano il tempo o i tempi di esposizione per ciascuna inclinazione, sia che si tratti di una dose ottimale per inclinazione o di una dose totale ottimale per la serie completa di inclinazione. Nella media dei sottotomogrammi, è pratica comune mirare a una dose ottimale per immagine inclinata nell'intervallo 3,0-3,5 e-/Å2. In entrambi i casi, le "Frazioni (Nr.)" sono impostate su 6 per ottenere ~ 0,5 e-/Å2 di dose per fotogramma filmato dell'inclinazione per un segnale sufficiente per eseguire la correzione del movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Figura 4: scheda Atlante. Immagine panoramica della scheda "Atlante". L'immagine è stata ritagliata per evitare spazi vuoti nella posizione della griglia. Il menu "Attività" contiene le preferenze di impostazione della sessione e gli spazi di selezione della griglia per la selezione individuale di tutte le griglie inventariate e un'opzione per acquisire un singolo atlante dopo che la cassetta è stata rimossa dal caricatore automatico. Una griglia selezionata può essere reimpostata e quindi riacquisita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Figura 5: Spostamenti calibrati dell'immagine. L'immagine raffigura un'immagine di esposizione e ricerca. La croce rossa nell'immagine di ricerca è l'indicatore spostato per correggere l'offset tra esposizione e ricerca. Si dovrebbero ripetere le calibrazioni dello spostamento dell'immagine all'inizio della sessione o dopo aver modificato i preset delle condizioni di imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Figura 6: Funzioni automatiche e diaframmi. (A) La scheda "Funzioni automatiche" mostra il menu a discesa "Predefiniti" e la selezione "Attività". Sottolineato in blu è il preset "Thon Ring" richiesto per "Autostigmate" (sottolineato anche in blu) e "Autocoma". È necessario selezionare i rispettivi preset per ogni attività e quindi premere il pulsante Start. (B) Le aperture si trovano nell'interfaccia utente TEM. Selezionare "Apertura obiettivo" desiderata dopo che le funzioni automatiche sono state eseguite ed eseguire "Autostigmate" con l'apertura in. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Figura 7: Panoramica della scheda Tomografia. Le immagini mostrano l'interfaccia utente di Tomo 5.8. (A) Posizioni dei lotti. Le ultime funzioni raffigurate nell'immagine: l'opzione "Acquisisci mappa di ricerca"; Le posizioni dei tomogrammi vengono visualizzate nella vista Atlante con l'opzione di zoom; evidenziato in alto a destra è "Seleziona posizioni"; di seguito sono state selezionate tutte e quattro le posizioni per i parametri "Aggiorna defocus". (B) Sulla mappa di ricerca sono selezionate tre posizioni, etichettate 1, 2 e 3. La posizione 1 non rappresenta un problema quando viene eseguito "Perfeziona tutto". Tuttavia, se in un'impostazione ad alta densità del bersaglio, come quando vengono selezionate le posizioni delle lamelle, come illustrato per la posizione 2 e la posizione 3, "Perfeziona tutto" eseguirà la routine "Tracking" e "Focus" sulla regione "Esposizione" della posizione 2, esponendo il target prima che il tomogramma venga acquisito. Il tipo di griglia è R1.2/1.3. Barra di scala = 1,2 μm. (C) Acquisizione dati. Le posizioni selezionate impostate in "Posizioni batch" possono ora essere acquisite individualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Figura 8: Definizione dell'angolo di inclinazione massimo. La figura illustra un approccio passo-passo per determinare l'intervallo di inclinazione massimo per le acquisizioni di tomogrammi. (A) Panoramica 0° e una mappa di ricerca al centro del quadrato della griglia. Per testare l'intervallo di inclinazione, l'angolo può essere impostato nel software di tomografia con "Set Tilt (°)" digitando il valore desiderato e quindi premendo Set. (B) Il palco è stato inclinato a -60°, mostrando che un angolo della mappa di ricerca non sarebbe completamente acquisito a -60°. (C) Il palco è stato inclinato di 60°. Contando i fori che sono scomparsi a ±60°, si può avere un'idea del campo di inclinazione di un quadrato della griglia. Barre di scala = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Figura 9: diagramma di flusso emClarity. Il diagramma di flusso descriveva le varie fasi per la media del subtomogramma criogenico. Barre della scala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Figura 10: Corrispondenza del modello utilizzando emClarity . (A) Una tipica micrografia di apoferritina su una griglia rivestita di grafene. Sfocatura: −3,430 μm. (B) Una fetta del tomogramma sovrapposta ai punti del modello dopo la ricerca del modello. (C) Una vista superiore e (D) una vista di proiezione laterale dei punti del modello, che indica un singolo strato piatto di particelle di apoferritina monodisperse. Barre della scala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figura 11: Cryo-ET STA dell'apoferritina . (A) La mappa finale dopo 21 cicli di allineamento del sub-tomogramma. (B) Il grafico di correlazione della shell di Fourier (FSC) della mappa finale con una risoluzione riportata di 2,86 Å, contenente 38 FSC a cono. (C) Mappe di densità rappresentative (equipaggiate con modello PDB 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Campione</td>
			<td>Tipo Cryo-ET</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Intervallo di inclinazione (+/-)</td>
			<td>Passo di inclinazione (°)</td>
			<td>Intervallo di sfocatura (μm)</td>
			<td>Dose totale (e-/Å2)</td>
			<td>Risoluzione</td>
			<td>Dati grezzi</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr><tr><td>Apoferritina</td>
			<td>Purificato/molecolare (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & questo documento</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 Gag</td>
			<td>Purificato/molecolare (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosoma</td>
			<td>Purificato/molecolare (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Picco SARS-CoV-2</td>
			<td>Lamella/Molecolare (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Struttura dell'assone del neurone</td>
			<td>Cellulare (ultrastrutturale)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Parametri di raccolta per diversi studi crio-ET. Studi mirati alla ricostruzione di dettagli molecolari da proteine purificate o in situ rispetto a uno studio che mira a risolvere e segmentare le caratteristiche cellulari ultrastrutturali.
Filmato 1: Un tomogramma di campioni di apoferritina su una normale griglia EM e poi ripresi con un crio-TEM dotato di una telecamera ad altissima risoluzione con un filtro compatibile. Le serie Tilt sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 54° e una dose totale di 134 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra di scala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>
Filmato 2: Un tomogramma di un neurone primario cresciuto su una griglia EM e poi ripreso direttamente con un crio-TEM dotato di una telecamera ad altissima risoluzione con un filtro compatibile. Le serie tilt sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 60° e una dose totale di 120 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra di scala = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>
Filmato 3: Un tomogramma di un cianobatterio su una griglia EM, sottoposto a fresatura FIB e quindi ripreso con un crio-TEM dotato di una telecamera ad alta velocità e di un filtro compatibile. Le serie di inclinazione sono state acquisite con uno schema simmetrico di dose, con un intervallo di inclinazione di 50° e una dose totale di 120 e-/A2 nel software di tomografia elettronica. Barra della scala = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo film.</a>
File supplementare 1: il modello di file di parametri per la stima della sfocatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Raccolta dei dati e dettagli di configurazione del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: Elenco dei comandi in ordine di esecuzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Il presente protocollo descrive l'acquisizione remota dei dati della tomografia crioelettronica ad alta risoluzione utilizzando Tomo5 e la successiva elaborazione dei dati e la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity. L'apoferritina è usata come esempio per illustrare dettagliati processi passo-passo per ottenere una struttura crio-ET con una risoluzione di 2,86 Å.

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Questo protocollo fornisce un facile accesso al mondo sempre più popolare ma complesso della tomografia crioelettronica. È possibile visualizzare sei campioni cellulari. Istituto in uno stato vicino allo stato nativo.Le micromolecole possono quindi essere risolte ad alta risoluzione nel loro ambiente cellulare nativo utilizzando la media CROW, ET e sub atom. Inizia avviando il software Tomo five dal pc server TEM. Avviare la configurazione della sessione regolando i parametri di acquisizione delle immagini nella scheda preparazione, sotto i predefiniti.Copiare i parametri di acquisizione dell'immagine in tutti gli altri preset ad alto ingrandimento. Premere Set per impostare l'esposizione al microscopio e Get" per ottenere le impostazioni di esposizione a tutti gli altri ingrandimenti elevati dopo averli selezionati singolarmente. Per raccogliere un atlante, fare clic sulla scheda Nuova sessione nella scheda Atlante.Impostare le preferenze di sessione. Immettere il percorso di archiviazione e il formato di output e premere Applica. Seleziona Screening" e spunta tutti gli atlanti da acquisire.Selezionare Chiudi valvole di chiamata"Se il microscopio non è supervisionato, questo chiuderà le valvole a colonna. Quindi, per avviare lo screening, premere il pulsante di avvio. Ispeziona gli atlanti singoli o multipli per le destinazioni facendo clic sulla griglia nel pannello di sinistra sotto Configurazione sessione"Quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse e trascina il mouse per spostarti e scorri verso il centro per ingrandire e rimpicciolire.Scegliere la griglia per l'impostazione di destinazione. Selezionalo e fai clic su "Carica campione" dall'interno del software. Per eseguire la calibrazione dello spostamento dell'immagine, nella scheda "Funzioni automatiche" impostare il predefinito su Altezza eucentrica"Passare ad Auto-Eucentrico" inclinazione dello stage e premere start.Se la funzione è rimasta centrata durante il targeting, saltare le calibrazioni dello spostamento dell'immagine. Altrimenti, vai alla scheda Preparazione per calibrare lo spostamento dell'immagine, seleziona "Calibra spostamento immagine" e premi start. Ciò allineerà gli ingrandimenti inferiori alla caratteristica centrata sull'ingrandimento dell'esposizione.Per la configurazione della tomografia, avviare una nuova sessione in Impostazione sessione" per campioni biologici. Scegli Slab like "come tipo di campione e seleziona Batch" e Low Dose"Quindi seleziona la cartella Formato di output e archiviazione. Facoltativamente, aggiungi un destinatario e-mail e premi "Per impostare gli obiettivi, vai alla freccia dell'atlante, trova una regione di interesse e spostati selezionando le opzioni che appaiono con un clic destro del mouse.Scatta un'immagine panoramica per confermare una buona posizione per la regolazione Eucentric dell'altezza. Quindi premere autoeucentric" per eseguire la routine eucentrica per inclinazione dello stadio, riacquisire una nuova immagine panoramica per aggiornare l'altezza eucentrica. Ispeziona la panoramica della piazza o la mappa di ricerca acquisita.Spostarsi in un'area di interesse e premere acquisisci ricerca. Quindi ispezionare l'immagine di ricerca se la regione di interesse non è centrata, fare clic con il pulsante destro del mouse nella posizione desiderata e ripetere la fase di spostamento qui" e acquisire l'immagine. Regola le aree di messa a fuoco e di tracciamento.Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per trascinare le aree di tracciamento e messa a fuoco. Una volta impostati tutti i parametri, premere Aggiungi posizione "Per eseguire le funzioni automatiche, controllare le impostazioni per eseguire gli allineamenti tramite la scheda Funzioni automatiche" navigando nell'atlante verso un'area di carbonio. Porta quell'area all'altezza eucentrica e segui l'ordine degli allineamenti come descritto nel manoscritto testuale.Quindi, avviare l'acquisizione automatica della scheda tomografia. Selezionare la lastra di acquisizione dati e impostare i parametri desiderati. Imposta i parametri di acquisizione dati: passo di inclinazione, angolo positivo massimo, angolo negativo massimo, schema di tracciamento.Quindi selezionare "Chiudi valvole colonna" per lo schema di altezza eucentrico. Iniziare con la preparazione dei file di input e delle directory. Stabilire una cartella di progetto nella cartella Project".Crea un'altra nuova cartella fissa stack e prepara i file di input. Tilt serie one fixed tilt series 1. XF e tilt serie 1.tlt.Per calcolare la sfocatura, aggiornare il file dei parametri con i parametri del microscopio e dell'imaging. Copiare un file di parametri nella cartella del progetto. Cambia il suo nome in param_CTF.M ed eseguire il comando indicato. Quindi, controlla i risultati della stima CTF. Per ogni pila, controlla le pile allineate usando la mod 3D e assicurati che le perline fiduciali vengano cancellate correttamente.Assicurarsi che la maneggevolezza sia corretta eseguendo il comando indicato. Quindi controlla il valore di sfocatura e assicurati che corrisponda alla stima teorica CTF. Per definire le sottoregioni, generate un tomogramma di piegatura.Nella cartella del progetto, eseguire il comando indicato. Determinare i limiti scegliendo sei punti Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin e Zmax, per creare una sottoregione nella cartella bin10, eseguire il comando indicato. Quindi, esegui il prelievo delle particelle per ogni sottoregione.Per il set di dati dell'apoferritina effettuare una ricerca nel modello al cestino sei. Modificare l'angolo di sottolineatura del modello. Parametri di ricerca per determinare l'angolo, l'intervallo e gli intervalli per la ricerca in piano o fuori piano in gradi.Nella cartella del progetto eseguire il comando indicato. Rimuovi le particelle errate usando la mod 3D sotto la cartella. Convmap_wedge_Type2_bin6. Eseguire il comando indicato.Quindi, inizializzare il progetto. Nella cartella del progetto eseguire il comando indicato per creare un database per la chiarezza EM, AppoF.mat. Eseguire la ricostruzione del tomogramma prima della media e dell'allineamento del sub tomo per generare tomogrammi della sottoregione corretti CTF in bin4, eseguire il comando indicato.Successivamente, per eseguire la media e l'allineamento del sub tomo, effettuare la media utilizzando i sottotelegrammi corretti CTF a partire da bin4. Nella cartella del progetto, eseguire il comando indicato. Continuare a eseguire gli allineamenti ed eseguire il comando.Pulire le particelle sovrapposte eseguendo il comando indicato. Eseguire la ricostruzione finale combinando i due set di dati a metà. Nella cartella del progetto eseguire i comandi indicati.Panoramica del flusso di lavoro della tomografia per la tomografia cellulare e molecolare sono mostrati qui per campioni cellulari e lamelle, la strategia di raccolta dei dati dipende in gran parte dal campione e dall'obiettivo dello studio di imaging. I parametri di raccolta per diversi studi di crio ET sono mostrati qui. Qui sono mostrati tomogrammi rappresentativi di campioni molecolari come apoferritina, processi cellulari sottili e lamelle fresate a fascio ionico focalizzato del campione cellulare spesso.L'analisi strutturale ad alta risoluzione può aiutare a rivelare i siti di legame per i bersagli farmacologici e la tomografia e la media sub-tomograle hanno anche aiutato lo sviluppo del vaccino contro SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

Campionamento di acqua di mare e di raccolta

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Ricerca

Biologia

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Raccolta e identificazione del polline dalle colonie di api da miele

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Costruzione di un modello scheletrico equino realistico, a tutto corpo e tridimensionale utilizzando dati di tomografia computerizzata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...