Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

私たちは、ウェルカムトラスト、MRC、およびBBRSCが資金提供する英国の国立電子バイオイメージングセンター(eBIC)のクライオEM施設へのアクセスとサポートについて、ダイヤモンド光源に感謝しています。また、アポフェリチン断層撮影(動画1)の取得についてアンドリュー・ハウ氏、ニューロン断層撮影(動画2)の作成と取得をしてくれたイシカ・クマール氏、シアノバクテリアラメラ断層撮影法(動画3)を撮影してくれたクレイグ・マクレガー・チャトウィン氏にも感謝します。

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	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. 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Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

著者には利益相反はありません。

トモ5 トモグラフィーソフトウェアのワークフローの説明は、(リモート)バッチ断層撮影セッションのセットアップのための1つの潜在的かつ最も合理化された方法を強調しています。このソフトウェアは初心者にとって簡単ですが、クライオEMの最初の経験と基本的な断層撮影の理解がセットアップに役立ちます。重要な手順はプロトコルで強調表示されており、別のセットアップアプローチが使用されている場合でもトラブルシューティングに役立ちます。ソフトウェアの進歩により、(リモート)データ収集が容易になり、幅広いユーザーベースがcryo-ETにアクセスしやすくなります。一般的に発生する問題のトラブルシューティングに役立ついくつかのヒントとコツを以下に説明します。
試験片を±60°に傾けると、高い傾斜のグリッドバーが視界を覆い隠す可能性があるため、考慮すべき重要なポイントの1つはグリッドの選択です(図8)。TEMグリッドでは、メッシュサイズはグリッドの単位長さあたりのグリッド正方形の数を指します。メッシュ数が大きいほど、単位長さあたりのグリッド正方形が多くなり、グリッド正方形の密度が高くなり、グリッド正方形が小さい、つまり、400メッシュグリッドは200メッシュグリッドよりも正方形が小さくなります。断層撮影用のグリッドの適切な選択は、200メッシュまたは300メッシュグリッドです。 図 8 に示すように、グリッドが傾くと、収集できる領域が減少します。±60°の傾斜では、300メッシュのグリッドは、完全な断層撮影を取得できる小さな視野を持ちます。200メッシュグリッドの利点は、グリッド正方形が大きいほど分子断層撮影のセットアップが速くなり、グリッド正方形の面積が増えると、一晩の収集には1つの正方形で十分になることです。欠点は、200メッシュグリッドはより壊れやすいため、取り扱いとクリッピングにはより多くのフィネスが必要になることです。
さらに、EMグリッドに穴のあるサポートフィルム( 材料表を参照)を使用する場合は、露光領域に対するフォーカス領域とトラッキング領域の設定に穴の間隔を考慮する必要があります。理想的には、最適な迅速なセットアップのために、所望の倍率でのビーム直径は、傾斜軸に沿って露光領域に隣接する炭素領域をカバーするのに十分小さくなければなりません。このようにして、各穴の潜在的な関心領域を取得できます。
ソフトウェアのユーセントリック高さルーチンは現在、serialEMルーチンほど堅牢ではないため、次のヒントでこの問題を回避できます。ユーセントリック高さプリセットを使用してユーセントリック高さの決定が失敗した場合は、代わりに概要プリセットを使用して、「ステージチルトによる自動ユーセントリック」を再実行できます。これにより、ユーセントリックの高さが 0 から遠く離れている場合の問題を解決できます。これが成功した場合は、「ユーセントリック高さ」プリセットを使用して「ステージチルトによる自動ユーセントリック」を再実行して、精度を向上させることができます。失敗した場合は、ユーセントリック高さプリセットを使用して「ビームチルトによる自動ユーセントリック」を実行してから、「ステージチルトによる自動ユーセントリック」を再実行するか、「ステージ」設定のTEMユーザーインターフェイスで「ビームチルトによる自動ユーセントリック」によって統合されたz高さを手動で設定できます。ホールの繰り返しパターンを持つグリッドが使用される場合、それらは単一の相互相関ピークの識別を妨げる可能性があります。ユーセントリック高さプリセットを-25μmなどの低いデフォーカスオフセットに変更したり、露光時間を短くしたりして、ホールパターンからの相互相関を減らすことができます。一方、レーシーグリッド/ラメラを使用すると、強い相互相関ピークに対して十分な信号が得られない場合があります。ユーセントリック高さプリセットを変更して、-75μmなどのより大きなデフォーカスオフセットや長時間の露光時間を変更して、相互相関ピークを強化することができます。別のオプションは、画像フィルター設定を調整することです。それらは「準備」タブにあります。フィルター設定を調整するオプションは、低(概観/グリッドスクエア)、中(ユーセントリック高さ)、高倍率(トラッキング/フォーカス)に設定して、各プリセットに最適な相互相関ピークを見つけることができます。必要な入力は、0°と5°の1つの画像で、その後に比較をクリックして両方の画像を 比較 します。最長波長の推奨開始値は画像内の縮尺記号の 4 分の 1 で、最短波長の推奨開始値は縮尺記号の 40 分の 1 です。ピークが確実に特定されない場合は、説得力のあるピークが見つかるまで設定を最適化できます。毎回画像を再取得する必要はありません。「比較」を押すだけで十分です。それでもTOMOがユーセントリック高さを自動的に見つけられない場合は、手動のユーセントリック高さキャリブレーションを使用できます。「準備」タブの概観倍率で適度に大きな氷の結晶を中央に配置し、TEMユーザーインターフェイスの「ステージコントロール」に移動し、アルファを-30°に設定し、ステージのz値を調整して、蛍光スクリーン画像を使用して結晶を再中心化します。TEMユーザーインターフェースで「高解像度」および「高コントラスト」設定を選択すると、これが簡単になります(蛍光スクリーンウィンドウの下部にあるボタン)。オプションで、ライブモードのカメラにアクセスできる場合は、これを使用してユーセントリックの高さを決定できます。蛍光スクリーンよりも簡単になります。
5.8より前のTomo5バージョンの最大の制限は、中倍率モンタージュの欠落、線量対称スキームの欠落、およびユーセントリック高さ検出に関連する問題です。これらは、迅速な開発とコミュニティサポートを備えたフリーウェアであるSerialEM、堅牢なユーセントリック高さルーチン、およびスクリプトのオプション、つまりカスタムビルドの線量対称スキームに存在します。Tomo5 のバージョン 5.8 以降では、ユーセントリック高さを見つける際に最もよく発生する問題、つまり目標 Z 値のループが失敗する問題は、ユーセントリック高さの許容基準を設定するオプションを実装することで解決されました。ただし、グリッドとサンプルの種類が異なる場合は、画像フィルター設定を調整して、個々のセッション固有のイメージング条件を反映し、ユーセントリックの高さを見つけるために可能な限り最良の相互相関ピークを提供し、トモグラム取得中にフォーカス領域とトラッキング領域が確実に機能することを強くお勧めします。

全体として、多くの施設はパンデミックの際にリモート操作に急速に適応しました。Tomo5ソフトウェアは、リモート操作に適したトモグラフィーへの簡単なアクセスとユーザーフレンドリーなルートを提供します。ソフトウェアの進歩により、リモートデータ収集とトモグラフィー収集が一般的にコミュニティでより主流になることは間違いありません。
エムクラリティ emClarityはテンプレートベースのパーティクルピッキング方法を使用するため、目的のオブジェクトのテンプレートが必要です。粒子ピッキング(ステップ2.6)は非常に敏感であり、最終的な構造の鍵となります。平均化とアライメント(ステップ2.9)の前に、誤検知を注意深くチェックし、手動で削除する必要があります。テンプレートが利用できない場合、emClarity は使い勝手が悪いかもしれませんが、Dynamo37 や PEET48 などの他のソフトウェアを使用して初期モデルを作成することは可能です。
異種サンプルの場合、emClarityには、ユーザーがさまざまなスケールの特定の特徴に集中できる分類方法が装備されています。分類の前に数サイクルの線形を実行し、より高いビン分割 (ビン 4 やビン 3 など) で実行すると便利です。
ソフトウェアの最新バージョン(V1.5.3.11)は、最初のリリース(V1.0)17と比較して大幅に更新されています。これらには、CTF推定中の利き手チェックが含まれますが、これらに限定されません(ステップ2.3)。アライメントの対称性(CX、I、I2、O)。粒子ごとの3Dサンプリング関数(3DSF)の計算。互換性と安定性のためのMATLAB 2019aへの切り替え。生の投影画像(cisTEM)を使用した再構成。ソフトウェアはさまざまなサンプルで改善を続けており、最新の発表はオンラインで見つけることができます(材料表を参照)。

極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、ルネッサンス期を経験したことが広く知られており、構造生物学の中核的かつ中心的に有用なツールになるのを加速しています。直接電子検出器の開発と利用 1,2,3, 改良型顕微鏡・電子源 3,4,5, 自動化・スループットの向上 6,7,8,9, 単粒子解析における計算の進歩10,11,12,13、14および断層撮影15、16、17はすべて、部分的には、この技術の最近の成功に責任があります。これらの技術的推進力は、極低温およびネイティブ条件下で生物学的高分子構造を解明するクライオEMの能力を開発しました。容易に得られる解像度は、原子レベルで正確なモデリングに十分であり、この技術を構造生物学の分野の最前線にもたらしました。目的の生物学的標的を発現および精製するための還元主義的アプローチは、基礎生物学研究、創薬、およびトランスレーショナルサイエンスのための高分子結晶学(MX)で長い間成功していることが証明されています。同じアプローチで、クライオEMは高解像度MX研究と同等の結果を提供できるようになりました。構造生物学のクライオ電子顕微鏡分野における現在の大きな成功は、単粒子分析(SPA)と呼ばれ、精製されたタンパク質標本18の典型的な2D投影画像を取得して、生物学的高分子19の数千ビューを取得します。これらの画像には、(1)3D空間でのターゲットの向きを完全に表すさまざまなビューからの情報が含まれており、(2)オブジェクトのコンフォメーションの不均一性をキャプチャし、後で分離して調査できます。
生物学的サンプルのこれらの2D投影画像を取得するための代替アプローチは、その 場 で精製することなく、クライオ電子線トモグラフィー(cryo-ET)です。クライオETは、試料を機械的に回転させることにより、同じ物体の一連の画像を傾斜角度で撮影します。したがって、SPAで収集された2D突起は、関心のある分子の角度姿勢を表し、クライオETイメージング実験20の一部として本質的に収集される。次に、トモグラフィーチルトシリーズは、画像化された高分子複合体の3D表現を含む断層撮影に再構築されます。断層撮影データ収集の性質は、2D画像のコレクションから分子の完全な3D表現を達成するために、平均化への依存度をある程度減らします。ただし、現在のステージ設計により、標本は通常-60°から+60°に傾いており、断層撮影3D再構成で欠落したウェッジ21 の情報が残ります。
単一の断層撮影での3D再構成では、情報のくさびが欠落し、信号対雑音比が低くなります。個々の高分子をサブトモグラムとして抽出し、一緒に平均してこれに取り組むことができます。サブトモグラム内の各高分子が異なる方向で見つかる場合、欠落したウェッジはターゲットオブジェクトの各サブトモグラムで異なる方向を向いているため、多くのコピーにわたって平均化すると、欠落したウェッジによる情報が埋められます。画像処理における最近の開発はまた、意味のあるデータ22で欠けているくさびを埋めるために人工知能ニューラルネットワークを訓練することを試みた。この平均化プロセスは、単粒子分析での平均化の目標と同様に、信号対ノイズも増加するため、再構成の品質と分解能が向上します。目的の分子が対称性を有する場合、それも平均化中に定義および採用され、再構成分解能がさらに向上する。トモグラムからサブトモグラムのセットへの高分子の3Dボリュームの抽出とその後の処理は、サブトモグラム平均化(STA)23として知られています。各サブトモグラムが研究対象の分子の固有のコピーを表す場合、STAワークフローを使用して構造的不均一性を調べることができます。SPAワークフローで一般的に利用されるように、分類技術は、目的の複合体の立体配座状態を解剖するためにSTA中に採用され得る。クライオETでの高分解能再構成を可能にするSTAに加えて、このアプローチにより、この手法は、天然の細胞環境における高分子またはSPA24,25,26に従わないことが多い標的の構造メカニズムを調べるための強力なツールになります。
電子線トモグラフィーは、室温で細胞標本の3D微細構造を決定してきた長い歴史があります27。標本の物理的な傾きによるビューの取得は、細胞長スケールでの物体の3D再構成に十分な情報を提供し、細胞構造が平均化のための規則性を欠いている場合に特に重要です。細胞は、試料が電子透過性であるのに十分薄い細胞端でクライオETイメージングのために基板上に凍結することもできます。これらの条件下では、STAは、標本が電子透過性であるのに十分薄い場合でも、細胞環境における高分子構造を決定するために使用され得る28。ただし、クライオ相関光および電子顕微鏡(クライオCLEM)および集束イオンビームミリング(クライオ-FIB)などの追加の分取技術と組み合わせると、クライオETを使用して極低温条件下で細胞全体の内部をイメージングできます29。これは、細胞の微細構造を研究するクライオETの力とSTAの力を組み合わせて、高分子複合体の構造をその場で決定し、それらの細胞位置を特定し30、動的プロセスに関与する複合体のスナップショットを提供する31。細胞標本を画像化し、いくつかの研究でSTAを採用する技術の能力は、SPA32に匹敵する解像度であっても、その場で高分子構造を解決する技術の力を浮き彫りにしました。さらなる利点は、断層図30における最終的に分類された3D再構成によって表される巨大分子の元の位置の知識に見出される。したがって、高分子構造は細胞の超微細構造と相関させることができる。長さスケールにわたるこれらの観察は、おそらく、機能研究の文脈における構造メカニズムが細胞の変化と相関している可能性がある重要な発見につながるでしょう。
Cryo-ETおよびSTAは、分子、細胞、ラメラ断層撮影の3つの主要なワークフローでデータ収集を可能にします。精製高分子複合体の構造は、分子断層撮影法によるクライオETにより決定することができる。細胞が十分に薄い細胞環境におけるタンパク質構造を決定することは、細胞断層撮影として説明され得る。最近では、極低温ターゲティングとミリングの開発に伴い、これらの同じ技術をラメラ断層撮影ワークフローに適用して、天然環境の細胞深部にあるタンパク質構造を決定し、それらのタンパク質が観察される細胞状況を明らかにすることができます。利用可能なソフトウェアパッケージに応じて、そして最も重要なことに、試料の要件に応じて、異なるデータ収集戦略を使用することができます。精製タンパク質の銅TEMグリッド上の分子または非付着性サンプルは、通常、取り扱いが少なくて済むため、理想的な場合には平坦で損傷を受けません。電子断層撮影は、ホールカーボングリッドを横切って簡単に直列に設定でき、数十から数百のトモグラムを体系的に迅速に取得できます。タンパク質がグリッド上に豊富に存在する分子トモグラフィーサンプルをセットアップする最も簡単な方法は、Tomo5を使用することです(本研究で使用される3D電子線トモグラフィー用のソフトウェア、材料表を参照)。レギノン9やシリアルEM6などの他の断層撮影ソフトウェアも利用できます。これらは、データ収集のためのよりパーソナライズされたアプローチのためのより多くのセットアップオプションを提供しますが、より複雑であり、その結果、特にトモグラフィーに不慣れなユーザーやセッションにリモートでアクセスするユーザーにとっては、ナビゲートが難しくなる可能性があります。大規模で多様なユーザーベースを持つ施設の場合、Tomo5はリモート環境での操作とユーザーのトレーニングが簡単です。接着細胞の場合、グリッドは通常、より多くの取り扱いステップを必要とし、壊れやすい金グリッドを使用する必要があるため、取り扱いおよびデータ収集戦略におけるケアを改善する必要性が高まります。細胞の関心領域を見つけやすくし、高い傾斜角でグリッド自体からの閉塞を回避するために、より大きなメッシュサイズを使用することも有益ですが、本質的に壊れやすいという犠牲を払っています。ラメラサンプルの場合、サンプルの脆弱性はラメラの品質によって決定され、これは変動する可能性があります。これらの要因により、セットアップ時間と考慮事項が増加しますが、適応性と堅牢性の向上により、Tomo5はこのタイプのデータ収集に適しています。ただし、ワークフローごとに特殊なデータ収集シナリオが存在します。BISECTとPACE-tomo(どちらもSerialEMで実行)は、特に分子断層撮影において、断層撮影における断層撮影速度28を向上させるために、断層撮影中にスクリプト化されたビーム画像シフトの可能性を導入します。SerialEM 6,7,33の中倍率モンタージュ(MMM)は、すべてのワークフローで分子の特徴をよりよく識別し、正確にターゲットにすることができますが、執筆時点では、これらの特徴はTomo5で実装され始めています。
SPAと同様に、クライオETとSTAは、取得ソフトウェアの改善と、平均16、17、32、34、35、36、37、38のサブトモグラム用の豊富な利用可能なパッケージを通じて、ますますアクセスしやすくなっています。さらに、パンデミックの間、クライオEM装置へのリモートアクセスを可能にすることは、英国のダイヤモンド光源(DLS)にある電子バイオイメージングセンター(eBIC)などの国家施設の継続的な運用に不可欠になりました。これらの開発により、クライオETは、この技術を利用したい研究者にとって、よりアクセスしやすく堅牢になりました。データが取得されると、STAは、最大の分解能再構成を取得し、高分子の不均一性の分類を可能にするために、再発オブジェクトを分析するための不可欠なツールです。現在のプロトコルは、クライオETデータ収集用のクライオTEM顕微鏡の準備と、例としてアポフェリチンの分子断層撮影データセットでemClarityを使用してサブトモグラム平均化を実行する方法の詳細なウォークスルーを提供することを目的としています。emClarity(高分解能クライオ電子線トモグラフィーおよびサブトモグラム平均化のためのソフトウェア、資料表を参照)を使用するには、コマンドラインからスクリプトを実行する必要があるため、Linux/UNIXシステムに精通していることを前提としています。
リモート接続は、各機関/施設のネットワーク環境によって異なります。eBIC では、リモートシステムは、Diamond で使用される特定のネットワーク設定でリモートデータ収集を可能にするプログラムを使用します。顕微鏡へのリモート接続は、NoMachineとTeamViewerの2つのプラットフォームによって容易になります( 材料表を参照)。プログラムNoMachineを使用して、ユーザーはリモートのWindowsデスクトップにログオンできます。NoMachineが提供するリモートWindowsデスクトップは、顕微鏡と同じネットワーク上にあるため、顕微鏡の仮想サポートPCとして機能します。仮想サポートPCから、ユーザーはTeamViewerを介して顕微鏡に接続し、TUIおよびTomoを実行している顕微鏡PCに直接アクセスして制御します。
本プロトコルは、2つの部分(ステップ1およびステップ2)からなる。ステップ1では、Tomo5(3D電子線トモグラフィー用ソフトウェア)を使用したリモートクライオETデータ取得に焦点を当てています。(リモート)セッションのウォークスルーは、ますます高い倍率で画像をキャプチャし、最終的にユーザーが断層撮影データ収集のために標本領域をターゲットにするように断層撮影ソフトウェアに指示できるようにします。 図 1 は、このプロセスをまとめたものです。ステップ2では、emClarity(高分解能クライオ電子線トモグラフィーおよびサブトモグラム平均化のためのソフトウェア)を使用したクライオET STAデータ処理について詳しく説明します。 図 9 に、このプロセスをまとめます。
このプロトコルは、リモートの視聴者を対象としています。これは、顕微鏡で物理的にサンプルをロードしている人が直接位置合わせを行い、カメラのチューニングとゲインリファレンスの取得を処理したことを前提としています。このプロトコルでは、オートローダーを備えた3コンデンサーレンズシステムが想定されています。断層撮影ソフトウェアの詳細なガイドラインについては、製造元による詳細なマニュアルが、ソフトウェアがロードされたWindowsの[スタート]ボタンで入手できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)は、特に直接電子検出器の導入、自動取得戦略の改善、クライオETを使用して電子顕微鏡が高解像度で画像化できるものの可能性を広げる分取技術、および新しいサブトモグラム平均化ソフトウェア。さらに、データ取得はますます合理化され、多くのユーザーにとってよりアクセスしやすくなっています。SARS-CoV-2のパンデミックは、世界中の多くの施設で、特に単粒子クライオEMのリモートクライオ電子顕微鏡(クライオEM)データ収集をさらに加速し、パンデミックの間、最先端の機器への中断のないユーザーアクセスを提供しました。Tomo5(3D電子線トモグラフィー用ソフトウェア)の最近の進歩により、リモートクライオETデータ収集は堅牢になり、世界中のどこからでも簡単に処理できるようになりました。この記事は、詳細なトラブルシューティングを伴う(リモート)クライオETデータ収集セッションのプロセスのための断層撮影ソフトウェアのデータ収集セットアップから始めて、詳細なウォークスルーを提供することを目的としています。(リモート)データ収集プロトコルは、例としてアポフェリチンを使用して、emClarityによるサブトモグラム平均化による原子分解能に近い構造決定のワークフローでさらに補完されます。

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Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86 Åの分解能でクライオET構造を達成するための詳細なステップバイステップのプロセスを説明するための例として使用されています。

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

このプロトコルは、ますます普及しているが複雑なクライオ電子線トモグラフィーの世界への簡単なアクセスルートを提供します。6つの細胞標本を画像化することができる。ネイティブに近い状態で研究所。微小分子は、CROW、ET、および亜原子平均化を使用して、天然の細胞環境で高解像度で分離できます。まずはTEMサーバPCからトモファイブソフトウェアを起動します。プリセットの下にある準備タブで画像取得パラメータを調整して、セッションのセットアップを開始します。画像取得のパラメータを他のすべての高倍率プリセットにコピーします。[設定]を押して顕微鏡への露出を設定し、[取得]を押して、個別に選択した後、他のすべての高倍率への露出設定を取得します。アトラスを収集するには、をクリックします新しいセッション「アトラス内」タブ。セッション設定を行います。ストレージパスと出力形式を入力し、適用を押します。スクリーニング」を選択し、取得するすべてのアトラスにチェックマークを付けます。「コールバルブを閉じる」を選択します」顕微鏡が教師なしの場合、カラムバルブを閉じます。次に、スクリーニングを開始するには、開始ボタンを押します。[セッション設定]の下の左側のパネルのグリッドをクリックして、単一または複数のアトラスでターゲットを調べます「次に、マウスを左クリックしてドラッグし、中央スクロールしてズームインおよびズームアウトします。ターゲット設定のグリッドを選択します。それを選択し、をクリックします サンプルをロードする」ソフトウェア内から。画像シフトキャリブレーションを実行するには、自動機能「タブプリセットをユーセントリック高さに設定する」ステージチルトで自動ユーセントリックにナビゲートし、スタートを押します。ターゲティング中に特徴量が中央に配置されたままの場合は、画像シフトの調整をスキップします。それ以外の場合は、準備「画像シフトを調整するためのタブ選択画像シフトの調整」と開始を押します。これにより、露出倍率を中心としたフィーチャに低倍率が整列します。トモグラフィーの設定については、生物学的サンプル用の「セッション設定」で新しいセッションを開始します。のようなスラブを選択してください」サンプルタイプとしてバッチを選択します」と低用量「次に、出力形式とストレージ「フォルダ。オプションで、電子メール受信者を追加してを押します申し込み「ターゲットを設定するには、アトラス矢印に移動し、関心のある領域を見つけて、マウスの右クリックでポップアップするオプションを選択して移動します。概観画像を撮影して、ユーセントリックの高さ調整に適した位置を確認します。次に、オートユーセントリック」を押して、ステージチルトルーチンでユーセントリックを実行し、新しいオーバービュー画像を再取得してユーセントリック高さを更新します。正方形の概観または取得した検索マップを調べます。関心のある領域に移動し、[検索の取得]を押します。次に、関心領域が中央に配置されていない場合は検索画像を調べ、目的の位置を右クリックして、 ステージをここに移動」を繰り返して画像を取得します。フォーカス領域とトラッキング領域を調整します。左クリックして、トラッキング領域とフォーカス領域をドラッグします。すべてのパラメータが設定されたら、を押します位置を追加「自動機能を実行するには、アトラスを炭素の領域に移動して、自動機能を介して位置合わせを実行するための設定を確認します」タブ。その領域をユーセントリックの高さにし、テキスト原稿に記載されている位置合わせの順序に従います。次に、断層撮影タブの自動取得を開始します。データ収集のスラブアウトを選択し、必要なパラメータを設定します。データ収集パラメータを設定します:チルトステップ、最大正角、最大負角度、追跡スキーム。次に、ユーセントリック高さスキームの「コラムバルブを閉じる」を選択します。入力ファイルとディレクトリの準備から始めます。プロジェクト」フォルダの下にプロジェクトフォルダを設定します。別の新しいフォルダーを固定スタックにし、入力ファイルを準備します。チルトシリーズ1固定チルトシリーズ1。XFおよびチルトシリーズ1.tlt。焦点ぼけを計算するには、顕微鏡とイメージングのパラメータでパラメータファイルを更新します。パラメーター ファイルをプロジェクト フォルダーにコピーします。名前を param_CTF に変更します。M を実行し、示されたコマンドを実行します。次に、CTF推定結果を確認します。スタックごとに、3D modを使用して位置合わせされたスタックをチェックし、基準ビーズが正しく消去されていることを確認します。示されたコマンドを実行して、利き手が正しいことを確認します。次に、焦点ぼけの値を確認し、理論上のCTF推定値と一致することを確認します。サブ領域を定義するには、ベンドトモグラムを生成します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。Xmin Xmax Ymin、Ymax、Zmin、およびZmaxの6つのポイントを選択して境界を決定し、フォルダーbin10の下に1つのサブ領域を作成するには、指定されたコマンドを実行します。次に、各サブ領域に対してパーティクル ピッキングを実行します。アポフェリチンデータセットについては、ビン6でテンプレート検索を実行します。テンプレートの下線の角度を変更します。検索パラメータを使用して、平面内または平面外検索の角度、範囲、および間隔を度単位で決定します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。フォルダの下の3D modを使用して、誤ったパーティクルを削除します。Convmap_wedge_Type2_bin6。示されたコマンドを実行します。次に、プロジェクトを初期化します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行して、EM を明確にするためのデータベース AppoF.mat を作成します。サブトモ平均化とアライメントの前にトモグラム再構成を実行して、bin4でCTF補正されたサブ領域トモグラムを生成し、指定されたコマンドを実行します。次に、サブトモ平均化とアライメントを実行するために、bin4から始まるCTF補正サブテレグラムを使用して平均化を実行します。プロジェクト フォルダーで、指定されたコマンドを実行します。位置合わせを続行し、コマンドを実行します。指定されたコマンドを実行して、重なり合ったパーティクルをクリーンアップします。2 つのハーフ データ セットを組み合わせて最終的な再構成を実行します。プロジェクトフォルダで、指定されたコマンドを実行します。細胞および分子断層撮影のための断層撮影ワークフローの概要は、細胞およびラメラサンプルについてここに示されており、データ収集戦略は、サンプルおよびイメージング研究の目標に大きく依存する。いくつかのクライオET研究の収集パラメータがここに示されています。ここでは、アポフェリチンなどの分子サンプルの代表的な断層撮影、薄い細胞プロセス、および厚い細胞標本の集束イオンビーム粉砕ラメラを示します。高分解能構造解析は、薬物標的の結合部位を明らかにするのに役立ち、断層撮影とサブトモグラール平均化もSARS-CoV-2に対するワクチン開発を支援しています。

Research

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Biology

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