Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Reconhecemos a Diamond Light Source para acesso e suporte às instalações crio-EM no Centro Nacional de Bioimagem eletrônica (eBIC) do Reino Unido, financiado pelo Wellcome Trust, MRC e BBRSC. Também gostaríamos de agradecer a Andrew Howe pela aquisição do tomograma de Apoferritina (Filme 1), Ishika Kumar pela preparação e aquisição do tomograma de neurônios (Filme 2), e Craig MacGregor-Chatwin para o Cyanobacteria lamella-tomogram (Filme 3).

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	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. 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MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Tomo5 A descrição do fluxo de trabalho do software de tomografia destaca uma maneira potencial e mais simplificada para uma configuração de sessão de tomografia em lote (remota). Embora o software seja fácil para iniciantes, alguma experiência crio-EM inicial e a compreensão da tomografia básica podem ajudar na configuração. As etapas críticas são destacadas no protocolo e devem ajudar a solucionar problemas mesmo que uma abordagem de configuração diferente tenha sido usada. O avanço do software facilitará a coleta de dados (remoto) e tornará o crio-ET mais acessível a uma ampla base de usuários. Algumas dicas e truques que podem ajudar a solucionar problemas comumente encontrados são descritos abaixo.
Um ponto importante a ser discutido é a escolha das grades porque, ao inclinar o espécime para ±60°, as barras de grade em inclinações altas podem obscurecer a visão (Figura 8). Em uma grade TEM, o tamanho da malha refere-se ao número de quadrados de grade por unidade de comprimento da grade. Números maiores de malha têm mais quadrados de grade por unidade de comprimento, maior densidade de quadrados de grade e quadrados de grade menores, ou seja, uma grade de 400 malha tem quadrados menores do que uma grade de 200 malhas. Uma boa escolha de grades para tomografia é grade de 200 malhas ou 300 malhas. Como mostrado na Figura 8, a área disponível para coleta é reduzida à medida que a grade é inclinada. Com ± 60° inclinação, uma grade de 300 malha terá um pequeno campo de visão no qual um tomograma completo pode ser adquirido. As vantagens das grades de 200 malhas são que os quadrados de grade maior tornam a configuração da tomografia molecular mais rápida, e com o aumento da área quadrada da grade, um quadrado provavelmente será suficiente para uma coleção noturna. A desvantagem é que as grades de 200 malhas são mais frágeis, por isso o manuseio e o recorte exigem mais finesse.
Além disso, se usar filme de suporte furado (ver Tabela de Materiais) nas grades EM, o espaçamento do orifício deve ser considerado para a configuração da região de foco e rastreamento em relação à região de exposição. Idealmente, o diâmetro do feixe na ampliação desejada deve ser pequeno o suficiente para cobrir a área de carbono adjacente à área de exposição ao longo do eixo de inclinação para uma configuração ideal e rápida. Dessa forma, podem ser adquiridas regiões potenciais de interesse em cada buraco.
Como a rotina de altura eucêntrica do software atualmente não é tão robusta, como a rotina serialEM, as seguintes dicas podem contornar esse problema. Se a determinação de altura eucêntrica falhar usando a predefinição de altura eucêntrica, pode-se usar a predefinição da visão geral e re-executar "Auto-eucentric por inclinação de palco"; isso pode resolver problemas se a altura eucêntrica estiver longe de 0. Se isso for bem sucedido, pode-se re-executar "Auto-eucentric by stage tilt" com predefinições "Eucentric Height" para melhorar a precisão. Se ele falhar, pode-se executar "Auto-Eucentric by beam tilt" com a predefinição de altura eucêntrica e, em seguida, re-executar "Auto-Eucentric by stage tilt" ou definir manualmente a altura z consolidada por "Auto-Eucentric by beam tilt" na interface do usuário TEM em configurações "Stage". No caso de grades com um padrão repetitivo de orifícios serem usadas, elas podem impedir a identificação de um único pico de correlação cruzada. Pode-se tentar alterar a predefinição de altura eucêntrica para um deslocamento de desfoco mais baixo, como −25 μm e/ou um tempo de exposição mais curto para reduzir a correlação cruzada dos padrões dos orifícios. Por outro lado, o uso de grades lacey/lamella pode não fornecer sinal suficiente para um forte pico de correlação cruzada. Pode-se tentar alterar a predefinição de altura eucêntrica para um maior deslocamento de desfoco, como −75 μm e/ou um tempo de exposição prolongado para melhorar o pico de correlação cruzada. Outra opção é ajustar as configurações do filtro de imagem; eles podem ser encontrados na guia "Preparação". As opções para ajustar as configurações do filtro podem ser definidas para baixo (Overview/Gridsquare), médio (Altura Eucêntrica) e alta ampliação (Rastreamento/Foco) para encontrar o pico de correlação cruzada ideal para cada predefinição. A entrada necessária é uma imagem, ou seja, a 0° e outra a 5°, seguida pelo clique em Comparar para comparar ambas as imagens. O valor inicial recomendado para o comprimento de onda mais longo é um quarto da barra de escala na imagem e para o comprimento de onda mais curto é um décimoninho da barra de escala. Se o pico não for identificado de forma robusta, pode-se otimizar as configurações até que um pico convincente possa ser encontrado. Não há necessidade de reaprodir imagens todas as vezes; simplesmente pressionar "Compare" é suficiente. Se o TOMO ainda não encontrar automaticamente a altura eucêntrica, a calibração manual de altura eucêntrica pode ser usada. Deve-se centralizar sobre um cristal de gelo razoavelmente grande na ampliação da visão geral na aba "Preparação", em seguida, ir para o "Controle de palco" da Interface do Usuário TEM, definir alfa para −30°, e ajustar o valor z estágio para recentar o cristal usando a imagem de tela fluorescente. Selecionar as configurações "Alta Resolução" e "Alto Contraste" na interface do usuário TEM tornará isso simples (botões na parte inferior da janela de tela fluorescente). Opcionalmente, se houver acesso a uma câmera com modo ao vivo, isso pode ser usado para determinar a altura eucêntrica; será mais fácil do que na tela fluorescente.
As maiores limitações nas versões de Tomo5 antes do 5.8 são as montagens de ampliação média ausentes, o esquema simétrico da dose ausente e os problemas relacionados à descoberta da altura eucêntrica. Estes existem no serialEM, um freeware com rápido desenvolvimento e suporte à comunidade, uma rotina robusta de altura eucêntrica e a opção de script, ou seja, um esquema simétrico de dose personalizada. A partir da versão 5.8 em diante em Tomo5, o problema mais encontrado para encontrar a altura eucêntrica, ou seja, um looping mal sucedido em torno do valor z alvo, foi resolvido implementando a opção de definir um critério de aceitação de altura eucêntrico. No entanto, com diferentes tipos de grade e amostra, é altamente recomendável ajustar as configurações do filtro de imagem para refletir as condições únicas de imagem de sessões individuais e dar o melhor pico de correlação transversal possível para encontrar a altura eucêntrica e para que a região de foco e rastreamento funcione de forma confiável durante a aquisição do tomograma.

No geral, muitas instalações se adaptaram rapidamente à operação remota durante a pandemia. O software Tomo5 fornece uma rota fácil de acesso e fácil de usar para a tomografia que é bem adequada para operação remota. Os avanços feitos no software, sem dúvida, continuarão a tornar a coleta remota de dados e a coleta de tomografias em geral mais mainstream na comunidade.
emClaridade Como a emClarity usa um método de coleta de partículas baseada em modelo, ele precisa de um modelo para o objeto de interesse. A colheita de partículas (passo 2.6) é muito sensível e fundamental para a estrutura final. Antes da média e alinhamento (etapa 2.9), deve-se garantir verificar cuidadosamente e manualmente os falsos positivos. Quando um modelo não está disponível, a emClarity pode não ser fácil de usar, mas é possível usar outros softwares, por exemplo, Dynamo37 e PEET48, para criar um modelo inicial.
Para amostras heterogêneas, a emClarity é equipada com um método de classificação que permite que os usuários se concentrem em recursos específicos com diferentes escalas. É útil executar alguns ciclos de alinhamentos antes da classificação e executá-lo em um binning mais alto (como bin 4 ou bin 3).
A versão atualizada do software (V1.5.3.11) tem atualizações significativas em comparação com a primeira versão (V1.0)17. Estes incluem, mas não se limitam a, uma verificação de handedness durante a estimativa ctf (etapa 2.3); simetria para alinhamentos (CX, I, I2, O); cálculo das funções amostrais 3D por partícula (3DSF); uma mudança para o MATLAB 2019a para compatibilidade e estabilidade; e reconstrução utilizando as imagens de projeção bruta (cisTEM). O software continuará a melhorar para várias amostras, e os anúncios mais novos podem ser encontrados online (ver Tabela de Materiais).

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) é amplamente conhecida por ter experimentado um período renascentista, acelerando-a para se tornar uma ferramenta central e centralmente útil na biologia estrutural. O desenvolvimento e utilização de detectores eletrônicos diretos 1,2,3, microscópios melhorados e fontes eletrônicas 3,4,5, melhorias na automação/throughput 6,7,8,9 e avanços computacionais na análise de partículas únicas 10,11,12,13 14 e tomografia 15,16,17 são, em parte, responsáveis pelo sucesso recente da técnica. Esses drivers tecnológicos desenvolveram a capacidade da crio-EM de resolver estruturas macromoleculares biológicas sob condições criogênicas e nativas. As resoluções prontamente obtidas são suficientes para modelagem atomicamente precisa e trouxeram a técnica para a vanguarda da arena de biologia estrutural. Uma abordagem reducionista para expressar e purificar um alvo biológico de interesse tem se mostrado há muito bem sucedida na cristalografia macromolecular (MX) para pesquisa biológica básica, descoberta de medicamentos e ciência translacional. Na mesma abordagem, o crio-EM agora pode fornecer resultados que os estudos paralelos de MX de alta resolução. O grande sucesso atual no ramo crio-EM da biologia estrutural é chamado de análise de partículas únicas (SPA), que adquire imagens de projeção 2D tipicamente de um espécime de proteína purificado18 para obter milhares de visualizações de uma macromolécula biológica19. Essas imagens (1) contêm informações de uma gama de visualizações que representam plenamente as orientações do alvo no espaço 3D e (2) capturam a heterogeneidade conformacional do objeto, que pode ser posteriormente separada e investigada.
Uma abordagem alternativa para a aquisição dessas imagens de projeção 2D de amostras biológicas, mesmo in situ e sem purificação, é a tomografia crio-elétron (crio-ET). Cryo-ET tira uma série de imagens do mesmo objeto em ângulos inclinados girando mecanicamente o espécime. Assim, as projeções 2D coletadas em SPA, representando as poses angulares da molécula de interesse, são inerentemente coletadas como parte do experimento de imagem crio-ET20. As séries de inclinação tomográfica são então reconstruídas em um tomograma que contém representações 3D dos complexos macromoleculares imaged. A natureza da coleta de dados tomográficos, em grau, diminui a dependência da média para alcançar uma representação 3D completa de uma molécula a partir de uma coleção de imagens 2D. No entanto, devido aos desenhos de estágio atuais, o espécime é tipicamente inclinado de −60° a +60°, deixando uma cunha faltando21 de informações na reconstrução 3D tomográfica.
As reconstruções 3D em um único tomograma têm uma cunha de informação faltando e baixo sinal para ruído. Macromoléculas individuais podem ser extraídas como subtomogramas e mediadas juntas para lidar com isso. Quando cada macromolécula em um subtomograma é encontrada em uma orientação diferente, a cunha ausente é orientada de forma diferente em cada subtomograma do objeto alvo, portanto, a média de muitas cópias preenche informações devido à cunha faltante. Desenvolvimentos recentes no processamento de imagens também tentaram treinar redes neurais de inteligência artificial para preencher a cunha faltante com dados significativos22. Esse processo de média também aumenta o sinal para ruído, semelhante ao objetivo de média na análise de partículas únicas, para que a qualidade e resolução da reconstrução melhorem. Se a molécula de interesse possui simetria, isso também pode ser definido e empregado durante a média, melhorando ainda mais a resolução da reconstrução. A extração de volumes 3D de uma macromolécula de um tomograma em um conjunto de subtomogramas e seu processamento subsequente é conhecido como média de subtomograma (STA)23. Quando cada subtomograma representa uma cópia única da molécula em estudo, qualquer heterogeneidade estrutural pode ser interrogada usando o fluxo de trabalho STA. Como comumente utilizado no fluxo de trabalho spa, as técnicas de classificação podem ser empregadas durante a STA para dissecar os estados conformais do complexo de interesse. Além da STA permitir a reconstrução de alta resolução no crio-ET, essa abordagem torna a técnica uma ferramenta poderosa para interrogar os mecanismos estruturais das macromoléculas em seu ambiente celular nativo ou de alvos muitas vezes não permitidos ao SPA 24,25,26.
A tomografia eletrônica tem uma longa história de determinar a ultraestrutura 3D de espécimes celulares à temperatura ambiente27. A aquisição de vistas por inclinação física da amostra fornece informações suficientes para a reconstrução 3D de um objeto em escalas de comprimento celular e é particularmente importante quando as estruturas celulares não têm regularidade para a média. As células também podem ser congeladas em substratos para imagens crio-ET nas bordas celulares onde o espécime é fino o suficiente para ser transparente por elétrons. Nessas condições, a STA pode ser empregada para determinar estruturas macromoleculares em um ambiente celular, embora quando o espécime é fino o suficiente para ser elétron transparente28. No entanto, quando combinado com técnicas preparatórias adicionais, incluindo luz crio-correlativa e microscopia eletrônica (crio-CLEM) e moagem de feixe de íons focalizada (crio-FIB), o crio-ET pode ser usado para imagem dentro de células inteiras sob condições criogênicas29. Isso reúne o poder do crio-ET de estudar a ultraestrutura celular com o poder de STA para determinar as estruturas dos complexos macromoleculares in situ , identificando sua localização celular30 e fornecendo instantâneos de complexos envolvidos em processos dinâmicos31. A capacidade da técnica de imagem de amostras celulares e empregar STA em diversos estudos tem destacado o poder da técnica para resolver estruturas macromoleculares in situ, mesmo em resoluções comparáveis ao SPA32. Outro benefício é encontrado no conhecimento da localização original da macromolécula, representada pela reconstrução 3D classificada final no tomograma30. Portanto, a estrutura macromolecular pode ser correlacionada com a ultraestrutura celular. Essas observações em escalas de comprimento presumivelmente levarão a importantes achados onde mecanismos estruturais podem estar correlacionados com mudanças celulares no contexto de estudos funcionais.
Cryo-ET e STA permitem a coleta de dados em três grandes fluxos de trabalho: tomografia molecular, celular e lamella. As estruturas dos complexos macromoleculares purificados podem ser determinadas por crio-ET por tomografia molecular. Determinar estruturas proteicas em seu ambiente celular onde a célula é fina o suficiente pode ser descrito como tomografia celular. Mais recentemente, com o desenvolvimento da segmentação criogênica e da fresagem, essas mesmas técnicas podem ser aplicadas em fluxos de trabalho de tomografia lamella para determinar as estruturas proteicas no interior da célula em seu ambiente nativo, ao mesmo tempo em que revelam o contexto celular em que essas proteínas são observadas. Diferentes estratégias de coleta de dados podem ser usadas dependendo dos pacotes de software disponíveis e, o mais importante, dependendo da exigência da amostra. Amostras moleculares ou não aderentes em uma grade TEM de cobre de uma proteína purificada normalmente requerem menos manuseio e, portanto, permanecem planas e não danificadas em casos ideais. Os tomogramas de elétrons podem ser facilmente configurais em série através de uma grade de carbono furado para adquirir rapidamente dezenas a centenas de tomogramas de forma sistemática. A maneira mais simples para os usuários configurarem amostras de tomografia molecular onde as proteínas estão abundantemente presentes na rede seria usar o Tomo5 (software para tomografia eletrônica 3D usado no presente estudo, ver Tabela de Materiais). Outros softwares de tomografia, como Leginon9 e serialEM6, também estão disponíveis; eles oferecem mais opções de configuração para abordagens mais personalizadas para coleta de dados, mas são mais complexas e, consequentemente, podem ser mais difíceis de navegar, especialmente para usuários novos para tomografia e usuários acessando sua sessão remotamente. Para uma instalação com uma grande e diversificada base de usuários, o Tomo5 é fácil de operar em um ambiente remoto e treinar os usuários. Para células aderentes, as grades normalmente requerem mais etapas de manuseio, e a necessidade de usar grades de ouro frágeis aumenta a necessidade de um melhor cuidado nas estratégias de manuseio e coleta de dados. Para facilitar encontrar uma região celular de interesse e evitar a oclusão da própria rede em ângulos de inclinação alta, também é benéfico usar tamanhos de malha maiores, mas ao custo de que eles são inerentemente mais frágeis. Para as amostras de lamella, a fragilidade da amostra é determinada pela qualidade da lamella, que pode ser variável. Esses fatores aumentam o tempo de configuração e considerações, mas o aumento da adaptabilidade e robustez tornam o Tomo5 adequado para esse tipo de coleta de dados. No entanto, existem cenários especializados de coleta de dados para cada fluxo de trabalho. BISECT e PACE-tomo (ambos executados em SerialEM) introduz a possibilidade de mudança de imagem de feixe roteirizada durante a aquisição da tomografia para aumentar a velocidade de coleta de tomograma28, particularmente na tomografia molecular. Montagens médias de ampliação (MMM) em SerialEM 6,7,33 podem identificar melhor e direcionar com precisão características moleculares em todos os fluxos de trabalho, embora, no momento da escrita, essas características estejam começando a ser implementadas no Tomo5.
Assim como o SPA, o crio-ET e o STA estão se tornando cada vez mais acessíveis através das melhorias feitas no software de aquisição e uma riqueza de pacotes disponíveis para subtomograma, com média de 16,17,32,34,35,36,37,38. Além disso, durante a pandemia, permitir o acesso remoto à instrumentação crio-EM tornou-se essencial para a operação contínua de instalações nacionais como o Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) na Diamond Light Source (DLS), Reino Unido. Esses desenvolvimentos tornaram o crio-ET mais acessível e robusto para pesquisadores que desejam utilizar a técnica. Uma vez adquiridos dados, o STA é uma ferramenta essencial para analisar objetos recorrentes para obter a reconstrução máxima da resolução e permitir a classificação da heterogeneidade macromolecular. O protocolo atual visa fornecer um passo-a-passo detalhado da preparação de um microscópio crio-TEM para coleta de dados crio-ET e como realizar a média do subtomograma usando a emClaridade em um conjunto de dados de tomografia molecular de apoferritina como exemplo. O uso de emClarity (software para tomografia crio-elétron de alta resolução e média de subtomograma, ver Tabela de Materiais) requer a execução de scripts da linha de comando, de modo que um nível de familiaridade com sistemas Linux/UNIX é assumido.
A conexão remota depende do ambiente de rede em cada instituto/instalação. No eBIC, o sistema remoto usa programas que permitem a coleta remota de dados na configuração específica da rede usada na Diamond. A conexão remota com o microscópio é facilitada por duas plataformas: NoMachine e TeamViewer (ver Tabela de Materiais). Usando o programa NoMachine, o usuário pode entrar em uma área de trabalho remota do Windows. A área de trabalho remota do Windows fornecida pelo NoMachine reside na mesma rede do microscópio e, portanto, atua como um PC de suporte virtual para o microscópio. A partir do PC de suporte virtual, o usuário se conecta ao microscópio via TeamViewer fornecendo acesso direto e controle ao pc de microscópio executando TUI e Tomo.
O presente protocolo consiste em duas partes (etapa 1 e etapa 2). A etapa 1 se concentra na aquisição remota de dados crio-ET usando o Tomo5 (software para tomografia eletrônica 3D). O passo a passo para uma sessão (remota) captura imagens em ampliações cada vez mais altas para, em última análise, permitir que o usuário direcione o software de tomografia para direcionar áreas de espécimes para coleta de dados tomográficos. A Figura 1 resume esse processo. A etapa 2 detalha o processamento de dados crio-ET STA usando emClarity (software para tomografia crio-elétron de alta resolução e média de subtomograma). A Figura 9 resume esse processo.
O protocolo é destinado a uma audiência remota. Ele assume que a pessoa fisicamente no microscópio e carregando as amostras fez os alinhamentos diretos e cuidou da sintonia da câmera e ganhar aquisição de referência. Para este protocolo, um sistema de lente de três condensadores com um carregador automático é assumido. Para obter mais diretrizes detalhadas sobre o software de tomografia, um manual detalhado do fabricante está disponível no botão Windows Start de onde o software foi carregado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

A tomografia crio-elétron (crio-ET) vem ganhando força nos últimos anos, especialmente desde a introdução de detectores de elétrons diretos, estratégias de aquisição automatizadas aprimoradas, técnicas preparatórias que expandem as possibilidades do que o microscópio eletrônico pode imaginar em alta resolução usando crio-ET e novo software de média de subtomograma. Além disso, a aquisição de dados tem se tornado cada vez mais simplificada, tornando-a mais acessível a muitos usuários. A pandemia SARS-CoV-2 acelerou ainda mais a coleta remota de dados de microscopia crio-elétron (crio-EM), especialmente para crio-EM de partículas únicas, em muitas instalações em todo o mundo, fornecendo acesso ininterrupto ao usuário a instrumentos de última geração durante a pandemia. Com os recentes avanços no Tomo5 (software para tomografia eletrônica 3D), a coleta remota de dados crio-ET tornou-se robusta e fácil de manusear de qualquer lugar do mundo. Este artigo tem como objetivo fornecer um passo a passo detalhado, a partir da configuração de coleta de dados no software de tomografia para o processo de uma sessão (remota) de coleta de dados crio-ET com solução detalhada de problemas. O protocolo de coleta de dados (remoto) é ainda mais complementado com o fluxo de trabalho para determinação da estrutura em resolução quase atômica por subtomograma em média com a emClaridade, usando a apoferritina como exemplo.

Para amostras de celular e lamella, a estratégia de coleta de dados depende em grande parte da amostra e do objetivo do estudo de imagem (Figura 1). A abordagem de alvo depende se o alvo molecular está in situ ou preparado a partir do complexo macromolecular purificado para espécimes de reconstrução de alta resolução contendo alvos moleculares. Para complexos purificados vitrificados em redes furadas (carbono), o alvo pode ser simplesmente baseado em imagens nos orifícios do filme de suporte (carbono). Para o trabalho in situ , a abordagem de direcionamento requer conhecimento da localização da entidade molecular com base em dados correlativos ou marcos celulares conhecidos de baixa ampliação. Os marcos celulares seriam idealmente identificáveis ao tirar imagens de visão geral e, se suficientes para localizar aproximadamente regiões de interesse, podem fornecer uma maneira rápida de confirmar a identidade do alvo com uma imagem de pesquisa. No entanto, se os eventos observáveis forem raros, então imagens médias de pesquisa de ampliação podem ser necessárias para qualificar o alvo está correto. Mapas de pesquisa são montagens de ampliação média de imagens de pesquisa e podem, assim, tornar a localização do alvo muito mais fácil, onde elas podem ser adquiridas em uma ampliação na qual a característica de interesse é visível. Os mapas de pesquisa podem então ser selecionados para encontrar e configurar posições de lote alvo. Para espécimes contendo características celulares para reconstrução ultraestrutural, a abordagem de segmentação é semelhante, embora igualmente dependente da visibilidade do evento celular em várias ampliações e sua prevalência na amostra.
A estratégia de aquisição de dados também deve ser considerada; em todos os casos, o objetivo do estudo determina em grande parte como os dados são coletados. Para a reconstrução da ultraestrutura celular, uma baixa ampliação (20-5 Å/px) e um grande campo de visão podem ser apropriados, mas altas ampliações são necessárias para reconstruir detalhes moleculares ou de alta resolução (5-1 Å/px). Um conjunto de dados coletado a 1,5 Å/px em condições ideais só poderá produzir fisicamente uma reconstrução na frequência nyquist de 3,0 Å/px; no entanto, na realidade, muitos fatores, incluindo, mas não se limitando à espessura, tamanho e heterogeneidade do espécime, todos afetam a qualidade da reconstrução obtida. Os parâmetros exatos de imagem também equilibram a ampliação com base no objetivo do estudo com o campo de visão para conter informações suficientes. Este artigo apresenta um caso de média de subtomograma que atinge 2,86 Å, mas estudos adicionais 17,42,43,44,45 são apresentados na Tabela 1 para ilustrar os parâmetros de coleta associados a estudos que visam diferentes desfechos 17,42,45,46.
Uma vez estabelecido um regime de fluxo de trabalho e aquisição de dados para crio-ET, a coleta de dados de muitos tipos de amostra diferentes é possível. São apresentados tomogramas representativos de uma variedade de espécimes: amostras moleculares como apoferritina (Filme 1), processos celulares finos (Filme 2) e lamella moída fib da espessa amostra celular (Filme 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral da configuração do fluxo de trabalho da tomografia. O fluxo de trabalho de imagem crio-ET descrito no protocolo é mostrado como um fluxograma. As imagens previstas para serem adquiridas são mostradas para o fluxo de trabalho celular e molecular. A nomeação apresentada segue a convenção Tomo5, embora a maioria dos softwares de aquisição de tomografias compartilhe princípios comuns para a coleta dessas imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Figura 2: Guia de preparação e condições de predefinição de pesquisa. (A) Imagem de visão geral de toda a guia. As predefinições de condição de imagem são definidas nesta guia, e as "Calibrar a mudança de imagem" e as "Configurações do filtro de imagem" podem ser encontradas na queda de "Tarefas". (B) Zoom-in da queda de "Predefinições", onde cada predefinição pode ser selecionada para a configuração de condições individuais de imagem. (C) Imagem que retrata uma ampliação adequada para encaixar tanto a exposição quanto a área "Foco e Rastreamento" no campo de visão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figura 3: Cálculos de dose. Exemplos de cálculos de dose para possíveis esquemas de aquisição de tomogramas onde a taxa de dose foi medida sobre o vácuo. Os dois cálculos determinam o tempo de exposição (s) para cada inclinação, seja visando uma dose ideal por inclinação ou uma dose total ideal para a série de inclinação completa. Na média do subtomograma, é prática comum direcionar uma dose ideal por imagem inclinada na faixa de 3,0-3,5 e-/Å2. Em ambos os casos, as "Frações (Nr.)" são definidas como 6 para alcançar ~0,5 e-/Å2 de dose por quadro de filme da inclinação para sinal suficiente para realizar a correção de movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Figura 4: Guia Atlas. Imagem de visão geral da guia "Atlas". A imagem foi cortada para evitar espaços vazios de posição da grade. O menu "Tarefas" contém preferências de configuração de sessão e espaços de seleção de grade para seleção individual de todas as grades inventariadas e uma opção para adquirir um único atlas após a retirada do do carregador automático. Uma grade selecionada pode ser redefinida e depois reaprida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Figura 5: Mudanças de imagem calibradas. A imagem retrata uma imagem de exposição e pesquisa. A cruz vermelha na imagem de pesquisa é o marcador deslocado para corrigir o deslocamento entre exposição e pesquisa. Deve-se refazer as calibrações de mudança de imagem no início da sessão ou depois de alterar as predefinições da condição de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Figura 6: Funções automáticas e aberturas. (A) A guia "Funções automáticas" retrata a queda de "Predefinições" e a seleção "Tarefa". Sublinhado em azul está o predefinição "Thon Ring" necessário para "Autostigmate" (também sublinhado em azul) e "Autocoma". Deve-se selecionar as respectivas predefinições para cada tarefa e, em seguida, pressionar o botão Iniciar . (B) As aberturas são encontradas na interface de usuário TEM. Selecione a "abertura objetiva" desejada após a execução das funções automáticas e execute "Autostigmate" com a abertura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Figura 7: Visão geral da guia tomografia. As imagens mostram a interface de usuário Tomo 5.8. (A) Posições em lote. As últimas funções retratadas na imagem: a opção "Adquirir mapa de pesquisa"; as posições do tomograma são mostradas na exibição atlas com a opção zoom-in; destacado no canto superior direito é "Seleções posições"; abaixo todas as quatro posições foram selecionadas para parâmetros de "Atualizar defoco". (B) Três posições são selecionadas no mapa de pesquisa, com o rótulo 1, 2 e 3. A posição 1 não será um problema quando "Refinar Tudo" for executado. No entanto, se em um ajuste de alta densidade de alvo, como quando as posições lamellae são selecionadas, como descrito para a posição 2 e a posição 3, então "Refinar Tudo" executará a rotina "Rastreamento" e "Foco" na região de "Exposição" da posição 2, expondo o alvo antes que o tomograma seja adquirido. O tipo de grade é R1.2/1.3. Barra de escala = 1,2 μm. (C) Aquisição de dados. A configuração de posições selecionadas em "Posições em Lote" agora pode ser adquirida individualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Figura 8: Definindo o ângulo máximo de inclinação. A figura retrata uma abordagem passo a passo para determinar a faixa máxima de inclinação para aquisições de tomogramas. (A) visão geral de 0° e um mapa de pesquisa no centro da grade quadrada. Para testar a faixa de inclinação, o ângulo pode ser definido no software de tomografia com "Definir inclinação (°)" digitando o valor desejado e, em seguida, pressionando o conjunto. (B) O estágio foi inclinado para −60°, mostrando que um canto do mapa de pesquisa não seria totalmente adquirido a −60°. (C) O palco foi inclinado para 60°. Contando os buracos que desapareceram em ±60°, pode-se ter uma ideia sobre a faixa de inclinação de um quadrado de grade. Barras de escala = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Figura 9: fluxograma de emClaridade. O fluxograma descreveu os vários passos para a média do sub-tomograma criogênico. Barras de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Figura 10: Correspondência de modelos usando emClarity. (A) Um micrografo típico de apoferritina em uma grade revestida de grafeno. Defoco: −3.430 μm. (B) Uma fatia do tomograma sobreposto com pontos de modelo após a pesquisa do modelo. (C) Uma visão superior e (D) de projeção lateral dos pontos do modelo, indicando uma única camada plana de partículas de apoferritina monodispersada. Barras de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figura 11: Crio-ET STA de apoferritina. (A) O mapa final após 21 ciclos de alinhamento sub-tomograma. (B) O gráfico de correlação de conchas Fourier (FSC) do mapa final com uma resolução relatada de 2,86 Å, contendo mapas de densidade representativa de 38 cones (C) (equipados com modelo PDB 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Amostra</td>
			<td>Tipo Cryo-ET</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Faixa de inclinação (+/-)</td>
			<td>Passo de inclinação (°)</td>
			<td>Alcance de defocus (μm)</td>
			<td>Dose total (e-/Å2)</td>
			<td>Resolução</td>
			<td>Dados brutos</td>
			<td>Referência</td>
		</tr><tr><td>Apoferritina</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 e este papel</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 Gag</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribossoma</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Pico SARS-CoV-2</td>
			<td>Lamella/Molecular (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Estrutura do axônio neurônio</td>
			<td>Celular (ultraestrutural)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Parâmetros de coleta para diversos estudos crio-ET. Estudos voltados à reconstrução de detalhes moleculares a partir de proteínas purificadas ou in situ em comparação com um estudo com o objetivo de resolver e segmentar as características celulares ultraestruturais.
Filme 1: Um tomograma de amostras de apoferritina em uma grade EM normal e, em seguida, imagedo com um crio-TEM equipado com uma câmera de ultra-alta resolução com um filtro compatível. As séries tilt foram adquiridas com um esquema simétrico de dose, com um comprimento de inclinação de 54° e uma dose total de 134 e-/A2 no software de tomografia eletrônica. Barra de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Filme.</a>
Filme 2: Um tomograma de um neurônio primário cultivado em uma grade EM e, em seguida, diretamente imagedo com um crio-TEM equipado com uma câmera de ultra-alta resolução com um filtro compatível. A série de inclinação foi adquirida com um esquema simétrico de dose, com um comprimento de inclinação de 60° e uma dose total de 120 e-/A2 no software de tomografia eletrônica. Barra de escala = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Filme.</a>
Filme 3: Um tomograma de uma Cianobactéria em uma grade EM, submetido à fresagem FIB e, em seguida, imagedo com um crio-TEM equipado com uma câmera de alta velocidade e um filtro compatível. A série inclinação foi adquirida com um esquema simétrico de dose, com um comprimento de inclinação de 50° e uma dose total de 120 e-/A2 no software de tomografia eletrônica. Barra de escala = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Filme.</a>
Arquivo suplementar 1: O modelo de arquivo do parâmetro para estimar o desfoco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Tabela suplementar 1: Detalhes de coleta de dados e configuração de microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela Complementar 2: Lista de comandos na ordem de execução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Este protocolo fornece uma rota de fácil acesso ao mundo cada vez mais popular, mas complexo da tomografia crio eletrônica. Seis espécimes celulares podem ser imagens. Instituto em um estado próximo ao estado nativo.As micromoléculas podem então ser resolvidas em alta resolução em seu ambiente celular nativo usando crow, ET e média de sub átomos. Comece iniciando o software Tomo five do pc servidor TEM. Inicie a sessão configurada ajustando os parâmetros de aquisição de imagem na guia de preparação, em predefinições.Copie os parâmetros de aquisição de imagens para todas as outras predefinições de alta ampliação. Pressione Set"para definir a exposição ao microscópio e obter as configurações de exposição a todas as outras altas ampliações depois de selecioná-las individualmente. Para coletar um atlas, clique na aba Nova Sessão"na guia Atlas".Defina as preferências da sessão. Digite o caminho de armazenamento e o formato de saída e pressione aplicar. Selecione Screening"e marque todos os atlases a serem adquiridos.Selecione Fechar válvulas de chamada"Se o microscópio não for supervisionado, isso fechará as válvulas da coluna. Em seguida, para iniciar a triagem, pressione o botão iniciar. Inspecione os atlas únicos ou vários para obter alvos clicando na grade do painel esquerdo em Configuração de sessão"Em seguida, clique e arraste o mouse para se mover e rolar do meio para ampliar e sair.Escolha a grade para a configuração de destino. Selecione-o e clique em Amostra de carga", de dentro do software. Para executar a calibração da mudança de imagem, na guia Funções automáticas, ajuste a predefinição para "Eucentric Height"Navegar para auto-eucentric", por inclinação do palco e pressione a partida.Se o recurso permaneceu centrado durante o direcionamento, pule as calibrações de mudança de imagem. Caso contrário, vá para a guia Preparação para calibrar a mudança de imagem selecione Calibrar o Deslocamento de Imagem" e pressione o início. Isso alinhará ampliações mais baixas ao recurso centrado na ampliação da exposição.Para a tomografia, inicie uma nova sessão em Configuração de Sessão", para amostras biológicas. Escolha a laje como "como o tipo de amostra e selecione Batch" e "Low Dose" Em seguida, selecione a pasta formato de saída e armazenamento.. Opcionalmente, adicione um destinatário de e-mail e pressione Aplicar"Para configurar os alvos, vá até a seta atlas, encontre uma região de interesse e mova-se selecionando as opções que aparecem com um clique com o mouse direito.Faça uma imagem geral para confirmar uma boa posição para ajuste de altura eucêntrico. Em seguida, pressione autoeucêntrico"para executar a rotina de inclinação de palco eucêntrica, readquira uma nova imagem de visão geral para atualizar a altura eucêntrica. Inspecione a visão geral quadrada ou o mapa de pesquisa adquirido.Mude-se para uma região de interesse e a imprensa adquira pesquisa. Em seguida, inspecione a imagem de pesquisa se a região de interesse não estiver centrada, clique com o botão direito do mouse na posição desejada e repita o estágio Move aqui"e adquira imagem. Ajuste as áreas de foco e rastreamento.Clique à esquerda para arrastar as áreas de rastreamento e foco. Uma vez definidos os parâmetros pressione Adicionar posição"Para executar funções automáticas, verifique as configurações para executar os alinhamentos através da guia Funções Automáticas, navegando o atlas para uma área de carbono. Leve essa área à altura eucêntrica e siga a ordem dos alinhamentos conforme descrito no manuscrito do texto.Em seguida, inicie a aquisição automatizada da guia de tomografia. Selecione a laje de aquisição de dados e defina os parâmetros desejados. Configure parâmetros de aquisição de dados:etapa de inclinação, ângulo positivo máximo, ângulo negativo máximo, esquema de rastreamento.Em seguida, selecione Válvulas de coluna fechada"para o esquema de altura eucêntrico. Comece com a preparação de arquivos de entrada e diretórios. Estabeleça uma pasta de projeto sob a pasta Projeto".Faça outra nova pasta de pilhas fixas e prepare os arquivos de entrada. Tilt série uma inclinação fixa série 1. XF e inclinação série 1.tlt.Para calcular o desfoco, atualize o arquivo do parâmetro com os parâmetros de microscópio e imagem. Copie um arquivo de parâmetro para a pasta do projeto. Mude seu nome para param_CTF.M e executar o comando indicado. Em seguida, confira os resultados de estimativas da CTF. Para cada pilha, verifique as pilhas alinhadas usando mod 3D e certifique-se de que as contas fiduciárias sejam apagadas corretamente.Certifique-se de que a mão está correta executando o comando indicado. Em seguida, verifique o valor do desfoque e certifique-se de que corresponde à estimativa teórica do CTF. Para definir as sub-regiões, gere uma dobra de tomograma.Na pasta do projeto, execute o comando indicado. Determine os limites escolhendo seis pontos Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin e Zmax, para criar uma sub-região sob a caixa de pasta10, executar o comando indicado. Em seguida, execute a colheita de partículas para cada sub-região.Para o conjunto de dados de apoferritina, realize uma pesquisa de modelo na bin six. Modifique o ângulo de sublinhar o modelo. Pesquise parâmetros para determinar o ângulo, alcance e intervalos para em plano ou fora da busca de avião em graus.Na pasta do projeto execute o comando indicado. Remova as partículas incorretas usando mod 3D sob a pasta. Convmap_wedge_Type2_bin6. Execute o comando indicado.Em seguida, inicialize o projeto. Na pasta de projeto, execute o comando indicado para criar um banco de dados para clareza EM, AppoF.mat. Realize a reconstrução do tomograma antes da média e alinhamento do sub-tomo para gerar tomogramas de sub-região corrigidos pelo CTF na bin4, execute o comando indicado.Em seguida, para realizar a média e alinhamento do sub tomo, realize a média usando os sub telegramas corrigidos pelo CTF a partir de bin4. Na pasta do projeto, execute o comando indicado. Continue fazendo alinhamentos e execute o comando.Limpe as partículas sobrepostas executando o comando indicado. Realize a reconstrução final combinando os dois conjuntos de dados de metade. Na pasta do projeto execute os comandos indicados.Visão geral do fluxo de trabalho da tomografia para a tomografia celular e molecular são mostradas aqui para amostras de celular e lamella, a estratégia de coleta de dados depende em grande parte da amostra e do objetivo do estudo de imagem. Os parâmetros de coleta para vários estudos de CRIO ET são mostrados aqui. Tomogramas representativos de amostras moleculares como apoferritina, processos celulares finos e lamella moída de feixe de íons focalado da espessa amostra celular são mostrados aqui.A análise estrutural de alta resolução pode ajudar a revelar locais vinculativos para alvos de drogas e tomografia e média sub-tomogral também têm ajudado o desenvolvimento de vacinas contra sars-cov-2.

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A amostragem da água do mar e Cobrança

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

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Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

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Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

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Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Coleta e Identificação de Pólen das Colônias de Abelhas

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Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

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Coleta de dados microscópicos de iluminação crioesticamente estruturadas de células criogenicamente preservadas

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

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Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

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Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...