Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Мы благодарим Diamond Light Source за доступ и поддержку крио-ЭМ-установок в Национальном центре электронной биовизуализации Великобритании (eBIC), финансируемом Wellcome Trust, MRC и BBRSC. Мы также хотели бы поблагодарить Эндрю Хоу за приобретение томограммы Апоферритина (Фильм 1), Ишику Кумар за подготовку и приобретение томограммы нейронов (Фильм 2) и Крейга Макгрегора-Чатвина за ламельно-томограмму Цианобактерий (Фильм 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Томо5 Описание рабочего процесса программного обеспечения томографии выделяет один потенциальный и наиболее оптимизированный способ настройки (удаленного) сеанса периодической томографии. Хотя программное обеспечение легко для начинающих, некоторый первоначальный опыт крио-ЭМ и базовое понимание томографии могут помочь с настройкой. Критические шаги выделены в протоколе и должны помочь в устранении неполадок, даже если был использован другой подход к установке. Развитие программного обеспечения облегчит (удаленный) сбор данных и сделает крио-ET более доступным для широкой пользовательской базы. Ниже описано несколько советов и рекомендаций, которые могут помочь в устранении часто встречающихся проблем.
Одним из важных моментов для обсуждения является выбор сеток, потому что при наклоне образца на ±60° полосы сетки при высоких наклонах могут скрывать вид (рисунок 8). В сетке ТЕА размер сетки относится к количеству квадратов сетки на единицу длины сетки. Большие числа сетки имеют больше квадратов сетки на единицу длины, более высокую плотность квадратов сетки и меньшие квадраты сетки, то есть сетка из 400 ячеек имеет меньшие квадраты, чем сетка из 200 ячеек. Хорошим выбором сеток для томографии являются 200-сетчатые или 300-сетчатые сетки. Как показано на рисунке 8, доступная площадь для сбора уменьшается по мере наклона сетки. При наклоне ±60° 300-сетчатая сетка будет иметь небольшое поле зрения, на котором можно получить полную томограмму. Преимущества 200-сетчатых сеток заключаются в том, что большие квадраты сетки ускоряют установку молекулярной томографии, а с увеличением площади квадрата сетки одного квадрата, вероятно, будет достаточно для ночного сбора. Недостатком является то, что 200-сетчатые сетки более хрупкие, поэтому обработка и обрезка требуют большей тонкости.
Кроме того, при использовании дырявой опорной пленки (см. Таблицу материалов) на эм-сетках необходимо учитывать расстояние между отверстиями для настройки фокусировки и области отслеживания по отношению к области экспозиции. В идеале диаметр луча при желаемом увеличении должен быть достаточно мал, чтобы покрыть область углерода, прилегающую к зоне воздействия вдоль оси наклона, для оптимальной и быстрой настройки. Таким образом, могут быть приобретены потенциальные области интереса в каждом отверстии.
Поскольку процедура эвцентрической высоты программного обеспечения в настоящее время не так надежна, как процедура serialEM, следующие советы могут обойти эту проблему. Если определение высоты эйцентрика не удается с помощью предустановки высоты эйцентрика, можно вместо этого использовать предустановку обзора и повторно запустить «Автоматический эйцентрический наклон по наклону ступени»; это может решить проблемы, если высота эвцентрика находится далеко от 0. Если это удастся, можно повторно запустить «Auto-eucentric by stage tilt» с предустановками «Eucentric Height» для повышения точности. Если это не удается, можно запустить «Auto-Eucentric by beam tilt» с предустановленной высотой эйцентрика, а затем повторно запустить «Auto-Eucentric by stage tilt» или вручную установить z-высоту, консолидированную «Auto-Eucentric by beam tilt» в пользовательском интерфейсе TEM в настройках «Stage». В случае использования сеток с повторяющимся рисунком отверстий они могут препятствовать выявлению одного пика перекрестной корреляции. Можно попробовать изменить предустановленную высоту эйцентрика на более низкое смещение расфокусировки, такое как -25 мкм и / или более короткое время экспозиции, чтобы уменьшить перекрестную корреляцию от паттернов отверстий. С другой стороны, использование кружевных сеток/ламелей может не обеспечить достаточный сигнал для сильного пика перекрестной корреляции. Можно попробовать изменить предустановленную эйцентрическую высоту на большее смещение расфокусировки, такое как −75 мкм и/или увеличенное время экспозиции, чтобы усилить пик перекрестной корреляции. Другим вариантом является настройка параметров фильтра изображений; их можно найти во вкладке «Подготовка». Параметры настройки фильтра можно задать для низкого (Обзор/Квадрат сетки), среднего (Эйцентровая высота) и высокого увеличения (Отслеживание/Фокус), чтобы найти оптимальный пик перекрестной корреляции для каждого пресета. Требуемым входом является одно изображение, т.е. под углом 0° и одно при 5°, за которым следует нажатие кнопки Сравнить, чтобы сравнить оба изображения. Рекомендуемое начальное значение для самой длинной длины волны составляет одну четверть шкалы на изображении, а для самой короткой длины волны — одну сороковую часть шкалы. Если пик не идентифицирован надежно, можно оптимизировать настройки до тех пор, пока не будет найден убедительный пик. Нет необходимости каждый раз повторно получать изображения; достаточно просто нажать «Сравнить». Если TOMO по-прежнему не удается автоматически найти высоту эйцентрика, можно использовать ручную калибровку высоты эйцентрика. Следует сосредоточиться на достаточно большом кристалле льда в обзорном увеличении на вкладке «Подготовка», затем перейти к «Управлению сценой» пользовательского интерфейса TEM, установить альфа-канал на −30° и настроить z-значение ступени, чтобы перецентрировать кристалл с помощью флуоресцентного изображения экрана. Выбор настроек «Высокое разрешение» и «Высокая контрастность» в пользовательском интерфейсе TEM сделает это простым (кнопки в нижней части окна флуоресцентного экрана). Опционально, если есть доступ к камере с режимом live, то это можно использовать для определения эйцентрической высоты; это будет проще, чем на флуоресцентном экране.
Самыми большими ограничениями в версиях Tomo5 до 5.8 являются отсутствующие монтажи среднего увеличения, отсутствующая симметричная схема дозы и проблемы, связанные с поиском эвцентрической высоты. Они существуют в serialEM, бесплатном программном обеспечении с быстрой разработкой и поддержкой сообщества, надежной эйцентрической рутиной высоты и возможностью написания сценариев, то есть пользовательской симметричной схемой дозы. Начиная с версии 5.8 в Tomo5, наиболее часто встречающаяся проблема нахождения эйцентрической высоты, т.е. неудачная зацикливание вокруг целевого z-значения, была решена путем реализации опции установки критерия принятия эйцентрической высоты. Тем не менее, при различных типах сетки и образцов настоятельно рекомендуется настроить параметры фильтра изображения, чтобы отразить уникальные условия визуализации отдельных сеансов и дать наилучший возможный пик перекрестной корреляции, чтобы найти высоту эйцентрика и чтобы область фокусировки и отслеживания надежно работали во время получения томограммы.

В целом, многие объекты быстро адаптировались к дистанционной работе во время пандемии. Программное обеспечение Tomo5 обеспечивает легкий доступ и удобный маршрут к томографии, который хорошо подходит для удаленной работы. Достижения, достигнутые в области программного обеспечения, несомненно, будут и впредь делать дистанционный сбор данных и сбор томографий в целом более распространенными в сообществе.
EmClarity Поскольку emClarity использует метод выбора частиц на основе шаблона, ему необходим шаблон для интересующего объекта. Отбор частиц (шаг 2.6) очень чувствителен и является ключом к конечной структуре. Перед усреднением и выравниванием (шаг 2.9) необходимо тщательно проверить и вручную удалить ложные срабатывания. Когда шаблон недоступен, emClarity может быть непрост в использовании, но для создания исходной модели можно использовать другое программное обеспечение, например Dynamo37 и PEET48.
Для гетерогенных образцов emClarity оснащен методом классификации, который позволяет пользователям сосредоточиться на конкретных характеристиках с различными масштабами. Полезно запустить несколько циклов выравниваний перед классификацией и запустить его при более высоком биннинге (например, bin 4 или bin 3).
Актуальная версия программного обеспечения (V1.5.3.11) имеет значительные обновления по сравнению с первым выпуском (V1.0)17. К ним относятся, но не ограничиваются ими, проверка ручной работы в ходе оценки CTF (этап 2.3); симметрия для выравниваний (CX, I, I2, O); расчет функций выборки 3D на частицу (3DSF); переход на MATLAB 2019a для совместимости и стабильности; и реконструкция с использованием необработанных проекционных изображений (cisTEM). Программное обеспечение будет продолжать совершенствоваться для различных образцов, а последние объявления можно найти в Интернете (см. Таблицу материалов).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

Криоэлектронная томография (крио-ET) набирает обороты в последние годы, особенно с момента внедрения прямых электронных детекторов, улучшенных автоматизированных стратегий сбора, подготовительных методов, которые расширяют возможности того, что электронный микроскоп может изобразить с высоким разрешением с использованием крио-ET и нового программного обеспечения для усреднения субтомограмм. Кроме того, сбор данных становится все более упорядоченным, что делает его более доступным для многих пользователей. Пандемия SARS-CoV-2 еще больше ускорила сбор данных дистанционной криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), особенно для крио-ЭМ с одной частицей, во многих учреждениях по всему миру, обеспечив непрерывный доступ пользователей к самым современным приборам во время пандемии. Благодаря недавним достижениям в Tomo5 (программное обеспечение для 3D-электронной томографии), удаленный сбор крио-ET данных стал надежным и простым в обращении из любой точки мира. Эта статья призвана предоставить подробное пошаговое руководство, начиная с настройки сбора данных в программном обеспечении томографии для процесса (удаленного) сеанса сбора крио-ET данных с подробным устранением неполадок. (Удаленный) протокол сбора данных дополнительно дополняется рабочим процессом определения структуры при почти атомарном разрешении путем усреднения субтомограммы с emClarity, используя в качестве примера апоферритин.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Настоящий протокол описывает удаленный сбор данных криоэлектронной томографии высокого разрешения с использованием Tomo5 и последующую обработку данных и усреднение субтомограмм с использованием emClarity. Апоферритин используется в качестве примера для иллюстрации подробных пошаговых процессов для достижения крио-ET структуры с разрешением 2,86 Å.

Удаленный сбор данных криоэлектронной томографии и усреднение субтомограмм

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Этот протокол обеспечивает легкий доступ в все более популярный, но сложный мир криоэлектронной томографии. Шесть клеточных образцов могут быть визуализированы. Институт в близком к родном штату.Затем микромолекулы могут быть разрешены с высоким разрешением в их родной клеточной среде с использованием усреднения CROW, ET и субатомов. Начните с запуска программного обеспечения Tomo five с пк сервера TEM. Начните настройку сеанса, настроив параметры получения изображения на вкладке подготовки в разделе настроек.Скопируйте параметры получения изображения во все остальные пресеты высокого увеличения. Нажмите Set", чтобы установить экспозицию микроскопа, и Get", чтобы получить настройки экспозиции для всех других высоких увеличений после их индивидуального выбора. Чтобы собрать атлас, нажмите на вкладку «Новая сессия» во вкладке «Атлас».Задайте настройки сеанса. Введите путь к хранилищу и выходной формат и нажмите кнопку «Применить». Выберите «Скрининг» и отметьте все атласы, которые будут получены.Выберите «Закрыть клапаны вызова»Если микроскоп находится без присмотра, это закроет клапаны колонны. Затем, чтобы начать показ, нажмите кнопку запуска. Проверьте один или несколько атласов на предмет целей, щелкнув по сетке на левой панели в разделе «Настройка сеанса»Затем щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы перемещаться, и среднюю прокрутку, чтобы увеличить и уменьшить масштаб.Выберите сетку для целевой установки. Выберите его и нажмите «Загрузить образец» внутри программного обеспечения. Чтобы выполнить калибровку сдвига изображения, на вкладке «Автофункции» установите для шаблона настроек «Высота эйцентрика» «Перейти к автоевцентрическому» по наклону ступени и нажмите кнопку «Пуск».Если объект оставался центрированным во время таргетинга, пропустите калибровку сдвига изображения. В противном случае перейдите на вкладку «Подготовка» для калибровки сдвига изображения выберите «Откалибровать сдвиг изображения» и нажмите «Пуск». Это приведет к выравниванию более низких увеличений с объектом, центрированным на увеличении экспозиции.Для настройки томографии начните новый сеанс в Session Setup" для биологических образцов. Выберите Slab like"в качестве типа образца и выберите Batch" и Low Dose"Затем выберите выходной формат и папку "storage". При необходимости добавьте получателя электронной почты и нажмите Применить"Чтобы настроить цели, перейдите к стрелке атласа, найдите интересующую область и переместите ее, выбрав параметры, которые появляются при щелчке правой кнопкой мыши.Сделайте обзорное изображение, чтобы подтвердить хорошее положение для регулировки высоты Эйцентрика. Затем нажмите «автоэвцентрический», чтобы запустить процедуру наклона эйцентрика по ступеням, повторно приобретите новое обзорное изображение, чтобы обновить высоту эйцентрика. Изучите обзор квадрата или полученную карту поиска.Перейдите в интересующий регион и нажмите получить поиск. Затем осмотрите изображение поиска, если интересующая область не центрирована, щелкните правой кнопкой мыши в нужном положении и повторите этап «Переместить здесь» и получите изображение. Отрегулируйте фокусировку и области отслеживания.Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы перетащить области отслеживания и фокусировки. После того, как все параметры установлены, нажмите «Добавить позицию» Для выполнения автоматических функций проверьте настройки для выполнения выравнивания через вкладку «Автоматические функции», перейдя по атласу в область углерода. Доведите эту область до эвцентрической высоты и следуйте порядку выравниваний, как описано в текстовой рукописи.Далее запустите автоматическое получение вкладки томографии. Выберите плиту Сбора данных и задайте нужные параметры. Настройка параметров сбора данных: шаг наклона, максимальный положительный угол, максимальный отрицательный угол, схема отслеживания.Затем выберите «Закрыть клапаны колонны» для схемы высоты эйцентрика. Начните с подготовки входных файлов и каталогов. Установите папку проекта в папке Project".Создайте еще одну новую папку фиксированных стеков и подготовьте входные файлы. Серия Tilt один фиксированный наклон серии 1. Серии XF и Tilt 1.tlt.Чтобы рассчитать расфокусировку, обновите файл параметров с помощью микроскопа и параметров визуализации. Скопируйте файл параметров в папку проекта. Измените его имя на param_CTF.M и выполните указанную команду. Затем проверьте результаты оценки CTF. Для каждого стека проверьте выровненные стеки с помощью 3D-мода и убедитесь, что фидуциальные бусины стерты правильно.Убедитесь в правильности ручной передачи, выполнив указанную команду. Затем проверьте значение расфокусировки и убедитесь, что оно соответствует теоретической оценке CTF. Для определения субрегионов сгенерируйте изгиб томограмму.В папке проекта выполните указанную команду. Определите границы, выбрав шесть точек Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin и Zmax, чтобы создать один субрегион под папкой bin10, выполните указанную команду. Затем запустите выбор частиц для каждого субрегиона.Для набора данных апоферритина выполните поиск шаблона в bin six. Измените угол подчеркивания шаблона. Параметры поиска для определения угла, диапазона и интервалов поиска в плоскости или вне плоскости в градусах.В папке проекта выполните указанную команду. Удалите некорректные частицы с помощью 3D мода под папку. Convmap_wedge_Type2_bin6. Выполните указанную команду.Затем инициализируйте проект. В папке проекта выполните указанную команду, чтобы создать базу данных для ясности EM, AppoF.mat. Выполните реконструкцию томограммы перед субтомоусреднением и выравниванием для генерации томограмм с коррекцией CTF субрегиона в bin4, выполните указанную команду.Затем, чтобы выполнить усреднение и выравнивание subtomo, выполните усреднение с помощью CTF скорректированных субтелеграмм, начинающихся с bin4. В папке проекта выполните указанную команду. Продолжайте выполнять выравнивания и выполните команду.Очистите перекрывающиеся частицы, выполнив указанную команду. Выполните окончательную реконструкцию, объединив два половинных набора данных. В папке проекта выполните указанные команды.Обзор рабочего процесса томографии для клеточной и молекулярной томографии показан здесь для образцов клеток и ламелей, стратегия сбора данных во многом зависит от образца и цели исследования визуализации. Параметры сбора для нескольких криоэт-исследований показаны здесь. Здесь показаны репрезентативные томограммы молекулярных образцов, таких как апоферритин, тонкие клеточные процессы и фрезерованная пластинка с фокусированным ионным пучком толстого клеточного образца.Структурный анализ с высоким разрешением может помочь выявить места связывания для мишеней лекарств, а томография и субтомогральное усреднение также помогают разработке вакцины против SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

Отбор проб морской воды и сбор

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Крио-электронной микроскопии Изготовление образцов с помощью электронного луча, сфокусированного

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Визуализация ДНК уплотнения в цианобактерий, томография высокого напряжения крио электрон

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Сбор и идентификация пыльцы из пчелиных семей

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Криоструктурированное освещение Микроскопический сбор данных из криогенно сохраненных клеток

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Построение реалистичной трехмерной модели скелета лошадей всего тела с использованием данных компьютерной томографии

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Подготовка образцов методом 3D-коррелятивного фрезерования сфокусированного ионного пучка для криоэлектронной томографии высокого разрешения

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...