Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
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Agradecemos a Diamond Light Source por el acceso y el apoyo a las instalaciones crio-EM en el Centro Nacional de Bio-Imágenes Electrónicas (eBIC) del Reino Unido, financiado por Wellcome Trust, MRC y BBRSC. También nos gustaría agradecer a Andrew Howe por la adquisición del tomograma de apoferritina (Película 1), a Ishika Kumar por la preparación y adquisición del tomograma neuronal (Película 2) y a Craig MacGregor-Chatwin por la tomagrama de laminillas de cianobacterias (Película 3).

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	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. 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Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Tomo5 La descripción del flujo de trabajo del software de tomografía destaca una forma potencial y más simplificada para una configuración de sesión de tomografía por lotes (remota). Si bien el software es fácil para principiantes, algo de experiencia inicial en crio-EM y comprensión básica de la tomografía puede ayudar con la configuración. Los pasos críticos se resaltan en el protocolo y deberían ayudar a solucionar problemas incluso si se ha utilizado un enfoque de configuración diferente. El avance del software facilitará la recopilación de datos (remota) y hará que la crio-ET sea más accesible para una amplia base de usuarios. A continuación se describen algunos consejos y trucos que pueden ayudar a solucionar problemas comunes.
Un punto importante a discutir es la elección de las cuadrículas porque, al inclinar la muestra a ±60°, las barras de cuadrícula en inclinaciones altas pueden oscurecer la vista (Figura 8). En una cuadrícula TEM, el tamaño de malla se refiere al número de cuadrados de cuadrícula por unidad de longitud de la cuadrícula. Los números de malla más grandes tienen más cuadrados de cuadrícula por unidad de longitud, una mayor densidad de cuadrados de cuadrícula y cuadrados de cuadrícula más pequeños, es decir, una cuadrícula de 400 mallas tiene cuadrados más pequeños que una cuadrícula de 200 mallas. Una buena opción de rejillas para la tomografía son las rejillas de malla 200 o 300. Como se muestra en la Figura 8, el área disponible para recolectar se reduce a medida que se inclina la cuadrícula. Con una inclinación de ±60°, una cuadrícula de malla 300 tendrá un pequeño campo de visión en el que se puede adquirir una tomografía completa. Las ventajas de las cuadrículas de malla 200 son que los cuadrados de cuadrícula más grandes hacen que la configuración de la tomografía molecular sea más rápida, y con el aumento del área cuadrada de la cuadrícula, un cuadrado probablemente será suficiente para una colección durante la noche. La desventaja es que las rejillas de malla 200 son más frágiles, por lo que el manejo y el recorte requieren más delicadeza.
Además, si se utiliza una película de soporte agujereada (consulte la Tabla de materiales) en rejillas EM, se debe considerar el espaciado del orificio para la configuración de la región de enfoque y seguimiento en relación con la región de exposición. Idealmente, el diámetro del haz con el aumento deseado debe ser lo suficientemente pequeño como para cubrir el área de carbono adyacente al área de exposición a lo largo del eje de inclinación para una configuración óptima y rápida. De esta manera, se pueden adquirir regiones potenciales de interés en cada hoyo.
Como la rutina de altura eucéntrica del software actualmente no es tan robusta, como la rutina serialEM, los siguientes consejos pueden solucionar ese problema. Si la determinación de altura eucéntrica falla usando el ajuste preestablecido de altura eucéntrica, se puede usar el ajuste preestablecido de vista general en su lugar y volver a ejecutar "Auto-eucéntrico por inclinación de etapa"; Esto puede resolver problemas si la altura eucéntrica está muy lejos de 0. Si esto tiene éxito, se puede volver a ejecutar "Auto-eucéntrico por inclinación de etapa" con ajustes preestablecidos de "Altura eucéntrica" para mejorar la precisión. Si falla, se puede ejecutar "Auto-Eucéntrico por inclinación del haz" con la altura eucéntrica preestablecida y luego volver a ejecutar "Auto-Eucéntrico por inclinación de la etapa" o establecer manualmente la altura z consolidada por "Auto-Eucéntrico por inclinación del haz" en la interfaz de usuario de TEM en la configuración de "Escenario". En caso de que se utilicen cuadrículas con un patrón repetitivo de agujeros, pueden impedir la identificación de un solo pico de correlación cruzada. Se puede intentar alterar el preajuste de altura eucéntrica a un desplazamiento de desenfoque más bajo, como -25 μm y / o un tiempo de exposición más corto para reducir la correlación cruzada de los patrones de agujeros. Por otro lado, el uso de rejillas / láminas de encaje puede no proporcionar suficiente señal para un fuerte pico de correlación cruzada. Se puede intentar alterar el preajuste de altura eucéntrica a un mayor desplazamiento de desenfoque, como −75 μm y / o un tiempo de exposición extendido para mejorar el pico de correlación cruzada. Otra opción es ajustar la configuración del filtro de imagen; se pueden encontrar en la pestaña "Preparación". Las opciones para ajustar la configuración del filtro se pueden establecer para baja (Descripción general / cuadrícula), media (altura eucéntrica) y aumento alto (seguimiento / enfoque) para encontrar el pico de correlación cruzada óptimo para cada ajuste preestablecido. La entrada requerida es una imagen, es decir, a 0° y otra a 5°, seguida de hacer clic en Comparar para comparar ambas imágenes. El valor inicial recomendado para la longitud de onda más larga es un cuarto de la barra de escala en la imagen y para la longitud de onda más corta es una cuadragésima parte de la barra de escala. Si el pico no se identifica de manera robusta, se puede optimizar la configuración hasta que se pueda encontrar un pico convincente. No hay necesidad de volver a adquirir imágenes cada vez; simplemente presionar "Comparar" es suficiente. Si TOMO sigue sin encontrar automáticamente la altura eucéntrica, se puede utilizar la calibración manual de altura eucéntrica. Uno debe centrarse sobre un cristal de hielo razonablemente grande en la ampliación general en la pestaña "Preparación", luego ir al "Control de escenario" de la interfaz de usuario TEM, establecer alfa en -30 ° y ajustar el valor z de la etapa para volver a centrar el cristal usando la imagen de pantalla fluorescente. Seleccionar los ajustes de "Alta resolución" y "Alto contraste" en la interfaz de usuario de TEM lo simplificará (botones en la parte inferior de la ventana de la pantalla fluorescente). Opcionalmente, si hay acceso a una cámara con modo en vivo, esto se puede usar para determinar la altura eucéntrica; Será más fácil que en la pantalla fluorescente.
Las mayores limitaciones en las versiones de Tomo5 anteriores a 5.8 son los montajes de aumento medio que faltan, el esquema simétrico de dosis faltante y los problemas relacionados con la búsqueda de altura eucéntrica. Estos existen en serialEM, un programa gratuito con rápido desarrollo y soporte de la comunidad, una robusta rutina de altura eucéntrica y la opción de script, es decir, un esquema simétrico de dosis personalizado. Desde la versión 5.8 en adelante en Tomo5, el problema más común para encontrar la altura eucéntrica, es decir, un bucle fallido alrededor del valor z objetivo, se ha resuelto implementando la opción de establecer un criterio de aceptación de altura eucéntrica. Sin embargo, con diferentes tipos de cuadrícula y muestra, se recomienda encarecidamente ajustar la configuración del filtro de imagen para reflejar las condiciones de imagen únicas de las sesiones individuales y para proporcionar el mejor pico de correlación cruzada posible para encontrar la altura eucéntrica y para que la región de enfoque y seguimiento funcione de manera confiable durante la adquisición del tomograma.

En general, muchas instalaciones se han adaptado rápidamente a la operación remota durante la pandemia. El software Tomo5 proporciona un acceso fácil y una ruta fácil de usar a la tomografía que es muy adecuada para la operación remota. Los avances realizados en el software sin duda continuarán haciendo que las recopilaciones de datos remotas y la recopilación de tomografía en general sean más comunes en la comunidad.
emClarity Como emClarity utiliza un método de selección de partículas basado en plantillas, necesita una plantilla para el objeto de interés. La selección de partículas (paso 2.6) es muy sensible y clave para la estructura final. Antes de promediar y alinearse (paso 2.9), uno debe asegurarse de verificar cuidadosamente y eliminar manualmente los falsos positivos. Cuando una plantilla no está disponible, emClarity puede no ser fácil de usar, pero es posible utilizar otro software, por ejemplo, Dynamo37 y PEET48, para crear un modelo inicial.
Para muestras heterogéneas, emClarity está equipado con un método de clasificación que permite a los usuarios centrarse en características específicas con diferentes escalas. Es útil ejecutar algunos ciclos de alineaciones antes de la clasificación y ejecutarlo en un binning más alto (como el contenedor 4 o el contenedor 3).
La versión actualizada del software (V1.5.3.11) tiene actualizaciones significativas en comparación con la primera versión (V1.0)17. Estos incluyen, pero no se limitan a, una verificación de mano durante la estimación de CTF (paso 2.3); simetría para alineaciones (CX, I, I2, O); cálculo de las funciones de muestreo 3D por partícula (3DSF); un cambio a MATLAB 2019a para compatibilidad y estabilidad; y reconstrucción utilizando las imágenes de proyección en bruto (cisTEM). El software continuará mejorando para varias muestras, y los anuncios más recientes se pueden encontrar en línea (consulte la Tabla de materiales).

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) es ampliamente conocida por haber experimentado un período de renacimiento, acelerándolo para convertirse en una herramienta central y centralmente útil en biología estructural. El desarrollo y la utilización de detectores de electrones directos 1,2,3, microscopios y fuentes de electrones mejorados 3,4,5, mejoras en la automatización/rendimiento 6,7,8,9 y avances computacionales en el análisis de partículas individuales10,11,12,13 14 y la tomografía15,16,17 son, en parte, responsables del reciente éxito de la técnica. Estos impulsores tecnológicos han desarrollado la capacidad de crio-EM para resolver estructuras macromoleculares biológicas en condiciones criogénicas y nativas. Las resoluciones que se pueden obtener fácilmente son suficientes para el modelado atómicamente preciso y han llevado la técnica a la vanguardia del campo de la biología estructural. Un enfoque reduccionista para expresar y purificar un objetivo biológico de interés ha demostrado ser exitoso en cristalografía macromolecular (MX) para la investigación biológica básica, el descubrimiento de fármacos y la ciencia traslacional. En el mismo enfoque, la crio-EM ahora puede ofrecer resultados paralelos a los estudios MX de alta resolución. El mayor éxito actual en la rama crio-EM de la biología estructural se llama análisis de partículas individuales (SPA), que adquiere imágenes de proyección 2D típicamente de una muestra de proteína purificada18 para obtener miles de vistas de una macromolécula biológica19. Estas imágenes (1) contienen información de una gama de vistas que representan completamente las orientaciones del objetivo en el espacio 3D y (2) capturan la heterogeneidad conformacional del objeto, que luego se puede separar e investigar.
Un enfoque alternativo para adquirir estas imágenes de proyección 2D de muestras biológicas, incluso in situ y sin purificación, es la criotomografía electrónica (crio-ET). Cryo-ET toma una serie de imágenes del mismo objeto en ángulos inclinados girando mecánicamente la muestra. Por lo tanto, las proyecciones 2D recogidas en SPA, que representan las poses angulares de la molécula de interés, se recopilan inherentemente como parte del experimento de imágenes crio-ET20. Las series de inclinación tomográfica se reconstruyen en un tomograma que contiene representaciones 3D de los complejos macromoleculares fotografiados. La naturaleza de la recopilación de datos tomográficos disminuye, hasta cierto punto, la dependencia del promedio para lograr una representación 3D completa de una molécula a partir de una colección de imágenes 2D. Sin embargo, debido a los diseños actuales de la etapa, el espécimen generalmente se inclina de -60 ° a + 60 °, dejando una cuña faltantede 21 de información en la reconstrucción tomográfica 3D.
Las reconstrucciones 3D en un solo tomograma tienen una cuña faltante de información y baja señal de ruido. Las macromoléculas individuales pueden extraerse como subtomogramas y promediarse juntas para abordar esto. Cuando cada macromolécula en un subtomograma se encuentra en una orientación diferente, la cuña faltante está orientada de manera diferente en cada subtomograma del objeto objetivo, por lo que promediar muchas copias completa la información debido a la cuña faltante. Los desarrollos recientes en el procesamiento de imágenes también han intentado entrenar redes neuronales de inteligencia artificial para llenar la cuña faltante con datos significativos22. Este proceso de promedio también aumenta la señal al ruido, similar al objetivo de promediar en el análisis de partículas individuales, por lo que la calidad y la resolución de la reconstrucción mejoran. Si la molécula de interés posee simetría, eso también puede definirse y emplearse durante el promedio, mejorando aún más la resolución de la reconstrucción. La extracción de volúmenes 3D de una macromolécula de un tomograma en un conjunto de subtomogramas y su posterior procesamiento se conoce como promedio de subtomografía (STA)23. Cuando cada subtomografía representa una copia única de la molécula que se está estudiando, cualquier heterogeneidad estructural puede ser interrogada utilizando el flujo de trabajo STA. Como se utiliza comúnmente en el flujo de trabajo de SPA, las técnicas de clasificación se pueden emplear durante STA para diseccionar los estados conformacionales del complejo de interés. Además de STA que permite la reconstrucción de alta resolución en crio-ET, este enfoque hace que la técnica sea una herramienta poderosa para interrogar los mecanismos estructurales de las macromoléculas en su entorno celular nativo o de objetivos a menudo no susceptibles de SPA24,25,26.
La tomografía electrónica tiene una larga historia de determinación de la ultraestructura 3D de muestras celulares a temperatura ambiente27. La adquisición de vistas por inclinación física del espécimen proporciona suficiente información para la reconstrucción 3D de un objeto a escalas de longitud celular y es particularmente importante cuando las estructuras celulares carecen de la regularidad para promediar. Las células también pueden congelarse en sustratos para obtener imágenes crio-ET en los bordes celulares donde la muestra es lo suficientemente delgada como para ser transparente a los electrones. Bajo estas condiciones, STA puede ser empleado para determinar estructuras macromoleculares en un ambiente celular, aunque cuando la muestra es lo suficientemente delgada como para ser transparente a loselectrones 28. Sin embargo, cuando se combina con técnicas preparativas adicionales, incluyendo microscopía criocorrelativa de luz y electrónica (crio-CLEM) y fresado de haz de iones enfocado (crio-FIB), la crio-ET puede ser utilizada para obtener imágenes dentro de células enteras en condiciones criogénicas29. Esto reúne el poder de la crio-ET para estudiar la ultraestructura celular con el poder de STA para determinar las estructuras de complejos macromoleculares in situ , identificando su ubicación celular30 y proporcionando instantáneas de complejos involucrados en procesos dinámicos31. La capacidad de la técnica para obtener imágenes de muestras celulares y emplear STA en varios estudios ha puesto de relieve el poder de la técnica para resolver estructuras macromoleculares in situ, incluso a resoluciones comparables a SPA32. Otro beneficio se encuentra en el conocimiento de la ubicación original de la macromolécula, representada por la reconstrucción 3D clasificada final en el tomograma30. Por lo tanto, la estructura macromolecular se puede correlacionar con la ultraestructura celular. Estas observaciones a través de escalas de longitud presumiblemente conducirán a hallazgos importantes donde los mecanismos estructurales pueden correlacionarse con cambios celulares en el contexto de estudios funcionales.
Cryo-ET y STA permiten la recopilación de datos en tres flujos de trabajo principales: tomografía molecular, celular y laminar. Las estructuras de los complejos macromoleculares purificados pueden determinarse mediante crio-ET mediante tomografía molecular. La determinación de las estructuras de proteínas en su entorno celular donde la célula es lo suficientemente delgada puede describirse como tomografía celular. Más recientemente, con el desarrollo de la orientación criogénica y la molienda, estas mismas técnicas se pueden aplicar en los flujos de trabajo de tomografía de láminas para determinar las estructuras de proteínas en el interior de la célula en su entorno nativo mientras se revela el contexto celular en el que se observan esas proteínas. Se pueden utilizar diferentes estrategias de recopilación de datos dependiendo de los paquetes de software disponibles y, lo más importante, dependiendo del requisito de la muestra. Las muestras moleculares o no adherentes en una rejilla TEM de cobre de una proteína purificada generalmente requieren menos manipulación y, por lo tanto, permanecen planas y sin daños en casos ideales. Los tomogramas electrónicos se pueden configurar fácilmente en serie a través de una rejilla de carbono agujereado para adquirir rápidamente decenas o cientos de tomogramas de manera sistemática. La forma más sencilla para que los usuarios configuren muestras de tomografía molecular donde las proteínas estén abundantemente presentes en la cuadrícula sería usar Tomo5 (software para tomografía electrónica 3D utilizado en el presente estudio, ver Tabla de materiales). Otro software de tomografía como Leginon9 y serialEM6 también están disponibles; Ofrecen más opciones de configuración para enfoques más personalizados para la recopilación de datos, pero son más complejos y, en consecuencia, pueden ser más difíciles de navegar, especialmente para los usuarios nuevos en la tomografía y los usuarios que acceden a su sesión de forma remota. Para una instalación con una base de usuarios grande y diversa, Tomo5 es fácil de operar en un entorno remoto y de capacitar a los usuarios. Para las células adherentes, las cuadrículas generalmente requieren más pasos de manejo, y la necesidad de usar frágiles rejillas doradas aumenta la necesidad de un mejor cuidado en las estrategias de manejo y recopilación de datos. Para facilitar la búsqueda de una región celular de interés y evitar la oclusión de la propia cuadrícula en ángulos de inclinación altos, también es beneficioso utilizar tamaños de malla más grandes, pero a costa de que son inherentemente más frágiles. Para las muestras de láminas, la fragilidad de la muestra está determinada por la calidad de la lámina, que puede ser variable. Estos factores aumentan el tiempo de configuración y las consideraciones, pero la mayor adaptabilidad y robustez nuevamente hacen que Tomo5 sea adecuado para este tipo de recopilación de datos. Sin embargo, existen escenarios de recopilación de datos especializados para cada flujo de trabajo. BISECT y PACE-tomo (ambos ejecutados en SerialEM) introducen la posibilidad de un cambio de imagen de haz guionado durante la adquisición de la tomografía para aumentar la velocidad de recolección del tomógrafo28, particularmente en tomografía molecular. Los montajes de magnificación media (MMM) en SerialEM 6,7,33 pueden identificar mejor y apuntar con precisión a las características moleculares en todos los flujos de trabajo, aunque, en el momento de escribir este artículo, estas características están comenzando a implementarse en Tomo5.
Al igual que SPA, cryo-ET y STA son cada vez más accesibles a través de las mejoras realizadas en el software de adquisición y una gran cantidad de paquetes disponibles para subtomografías con un promedio de 16,17,32,34,35,36,37,38. Además, durante la pandemia, permitir el acceso remoto a la instrumentación crioelectromagnética se volvió esencial para el funcionamiento continuo de instalaciones nacionales como el Centro de Bioimágenes de electrones (eBIC) en Diamond Light Source (DLS), Reino Unido. Estos desarrollos han hecho que la crio-ET sea más accesible y robusta para los investigadores que desean utilizar la técnica. Una vez adquiridos los datos, STA es una herramienta esencial para analizar objetos recurrentes para obtener la máxima resolución de reconstrucción y permitir la clasificación de la heterogeneidad macromolecular. El protocolo actual tiene como objetivo proporcionar un recorrido detallado de la preparación de un microscopio crio-TEM para la recopilación de datos crio-ET y cómo realizar el promedio de subtomografía utilizando emClarity en un conjunto de datos de tomografía molecular de apoferritina como ejemplo. El uso de emClarity (software para tomografía crioelectrónica de alta resolución y promedio de subtomograma, consulte la Tabla de materiales) requiere ejecutar scripts desde la línea de comandos, por lo que se asume un nivel de familiaridad con los sistemas Linux / UNIX.
La conexión remota depende del entorno de red en cada instituto/instalación. En eBIC, el sistema remoto utiliza programas que permiten la recopilación remota de datos en la configuración de red específica utilizada en Diamond. La conexión remota al microscopio se facilita mediante dos plataformas: NoMachine y TeamViewer (consulte la Tabla de materiales). Con el programa NoMachine, el usuario puede iniciar sesión en un escritorio remoto de Windows. El escritorio remoto de Windows proporcionado por NoMachine reside en la misma red que el microscopio y, por lo tanto, actúa como una PC de soporte virtual para el microscopio. Desde el PC de soporte virtual, el usuario se conecta al microscopio a través de TeamViewer proporcionando acceso directo y control al PC microscopio que ejecuta TUI y Tomo.
El presente protocolo consta de dos partes (paso 1 y paso 2). El paso 1 se centra en la adquisición remota de datos crio-ET utilizando Tomo5 (software para tomografía electrónica 3D). El recorrido para una sesión (remota) captura imágenes con aumentos cada vez más altos para permitir al usuario dirigir el software de tomografía a las áreas de muestras para la recolección de datos tomográficos. La figura 1 resume este proceso. El paso 2 detalla el procesamiento de datos cryo-ET STA utilizando emClarity (software para tomografía crioelectrónica de alta resolución y promedio de subtomograma). La figura 9 resume este proceso.
El protocolo está destinado a una audiencia remota. Asume que la persona físicamente en el microscopio y la carga de las muestras ha hecho las alineaciones directas y se ha encargado de la sintonización de la cámara y la adquisición de referencias. Para este protocolo, se asume un sistema de lentes de tres condensadores con un cargador automático. Para obtener instrucciones más detalladas sobre el software de tomografía, un manual detallado del fabricante está disponible en el botón Inicio de Windows desde donde se cargó el software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

La criotomografía electrónica (crio-ET) ha ido ganando impulso en los últimos años, especialmente desde la introducción de detectores de electrones directos, estrategias de adquisición automatizadas mejoradas, técnicas preparativas que amplían las posibilidades de lo que el microscopio electrónico puede visualizar a alta resolución utilizando crio-ET y nuevo software de promedio de subtomograma. Además, la adquisición de datos se ha simplificado cada vez más, haciéndola más accesible para muchos usuarios. La pandemia de SARS-CoV-2 ha acelerado aún más la recopilación remota de datos de criomicroscopía electrónica (crio-EM), especialmente para crio-EM de una sola partícula, en muchas instalaciones a nivel mundial, proporcionando acceso ininterrumpido de los usuarios a instrumentos de última generación durante la pandemia. Con los recientes avances en Tomo5 (software para tomografía electrónica 3D), la recopilación remota de datos crio-ET se ha vuelto robusta y fácil de manejar desde cualquier parte del mundo. Este artículo tiene como objetivo proporcionar un recorrido detallado, a partir de la configuración de recopilación de datos en el software de tomografía para el proceso de una sesión de recopilación de datos crio-ET (remota) con solución de problemas detallada. El protocolo de recopilación de datos (remoto) se complementa con el flujo de trabajo para la determinación de la estructura a una resolución casi atómica mediante un promedio de subtomograma con emClarity, utilizando apoferritina como ejemplo.

Para las muestras celulares y láminas, la estrategia de recolección de datos depende en gran medida de la muestra y del objetivo del estudio de imagen (Figura 1). El enfoque de focalización depende de si el objetivo molecular está in situ o preparado a partir del complejo macromolecular purificado para muestras de reconstrucción de alta resolución que contienen objetivos moleculares. Para complejos purificados vitrificados en rejillas agujereadas (carbono), la focalización puede basarse simplemente en imágenes en los orificios de la película de soporte (carbono). Para el trabajo in situ , el enfoque de focalización requiere el conocimiento de la ubicación de la entidad molecular basado en datos correlativos o puntos de referencia celulares conocidos de bajo aumento. Los puntos de referencia celulares idealmente serían identificables al tomar imágenes generales y, si son suficientes para localizar aproximadamente las regiones de interés, pueden proporcionar una forma rápida de confirmar la identidad del objetivo con una imagen de búsqueda. Sin embargo, si los eventos observables son raros, entonces las imágenes de búsqueda de aumento medio pueden ser necesarias para calificar el objetivo es correcto. Los mapas de búsqueda son montajes de aumento medio de imágenes de búsqueda y, por lo tanto, pueden facilitar mucho la búsqueda de objetivos, donde se pueden adquirir con un aumento en el que la característica de interés es visible. Los mapas de búsqueda se pueden filtrar para encontrar y configurar las posiciones de los lotes de destino. Para las muestras que contienen características celulares para la reconstrucción ultraestructural, el enfoque de focalización es similar, aunque igualmente depende de la visibilidad del evento celular a varios aumentos y su prevalencia en la muestra.
También debe considerarse la estrategia de adquisición de datos; En todos los casos, el objetivo del estudio determina en gran medida cómo se recopilan los datos. Para la reconstrucción de la ultraestructura celular, un bajo aumento (20-5 Å / px) y un gran campo de visión pueden ser apropiados, pero se requieren aumentos altos para reconstruir detalles moleculares o de alta resolución (5-1 Å / px). Un conjunto de datos recopilado a 1,5 Å/px en condiciones ideales sólo será físicamente capaz de producir una reconstrucción a la frecuencia de Nyquist de 3,0 Å/px; Sin embargo, en realidad, muchos factores, incluyendo pero no limitado al grosor, tamaño y heterogeneidad de la muestra, todos afectan la calidad de reconstrucción obtenida. Los parámetros exactos de imagen también equilibran la ampliación basada en el objetivo del estudio con el campo de visión para contener suficiente información. Este artículo presenta un subtomografía con un promedio de casos que alcanza 2,86 Å, pero estudios adicionales 17,42,43,44,45 se presentan en la Tabla 1 para ilustrar los parámetros de recolección asociados con estudios dirigidos a diferentes resultados17,42,45,46.
Una vez que se establece un flujo de trabajo de focalización y un régimen de adquisición de datos para crio-ET, es posible la recopilación de datos de muchos tipos de muestras diferentes. Aquí se presentan tomogramas representativos de una variedad de especímenes: muestras moleculares como apoferritina (Película 1), procesos celulares delgados (Película 2) y láminas fresadas FIB de la muestra celular gruesa (Película 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de la configuración del flujo de trabajo de tomografía. El flujo de trabajo de imágenes crio-ET descrito en el protocolo se muestra como un diagrama de flujo. Las imágenes que se espera adquirir se muestran para el flujo de trabajo celular y molecular. El nombre presentado sigue la convención Tomo5, aunque la mayoría del software de adquisición de tomografía comparte principios comunes para recopilar estas imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Figura 2: Pestaña de preparación y condiciones preestablecidas de búsqueda . (A) Imagen general de toda la pestaña. Los ajustes preestablecidos de condición de imagen se establecen en esta pestaña, y "Calibrar desplazamiento de imagen" y "Configuración de filtro de imagen" se pueden encontrar en el menú desplegable "Tareas". (B) Zoom del menú desplegable "Presets" donde se puede seleccionar cada ajuste preestablecido para la configuración de condiciones de imagen individuales. (C) Imagen que representa un aumento adecuado para ajustar tanto la exposición como el área de "Enfoque y seguimiento" en el campo de visión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figura 3: Cálculos de dosis. Ejemplos de cálculos de dosis para posibles esquemas de adquisición de tomografías donde la tasa de dosis se ha medido en vacío. Los dos cálculos determinan el tiempo de exposición para cada inclinación, ya sea apuntando a una dosis óptima por inclinación o a una dosis total óptima para la serie de inclinación completa. En el promedio de subtomogramas, es una práctica común apuntar a una dosis óptima por imagen inclinada en el rango de 3.0-3.5 e-/Å2. En ambos casos, las "fracciones (Nr.)" se establecen en 6 para lograr ~0.5 e-/Å2 de dosis por fotograma de película de la inclinación para una señal suficiente para realizar la corrección de movimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Figura 4: Pestaña Atlas. Imagen general de la pestaña "Atlas". La imagen se ha recortado para evitar espacios de posición de cuadrícula vacíos. El menú "Tareas" contiene preferencias de configuración de sesión y espacios de selección de cuadrícula para la selección individual de todas las cuadrículas inventariadas y una opción para adquirir un solo atlas después de que el casete se haya eliminado del cargador automático. Una cuadrícula seleccionada se puede restablecer y luego volver a adquirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Figura 5: Cambios de imagen calibrados. La imagen muestra una imagen de exposición y búsqueda. La cruz roja en la imagen de búsqueda es el marcador desplazado para corregir el desplazamiento entre la exposición y la búsqueda. Uno debe rehacer las calibraciones de desplazamiento de imagen al inicio de la sesión o después de cambiar los ajustes preestablecidos de la condición de imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Figura 6: Funciones y aperturas automáticas. (A) La pestaña "Funciones automáticas" muestra el menú desplegable "Ajustes preestablecidos" y la selección "Tarea". Subrayado en azul está el ajuste preestablecido "Thon Ring" requerido para "Autostigmate" (también subrayado en azul) y "Autocoma". Uno debe seleccionar los ajustes preestablecidos respectivos para cada tarea y luego presionar el botón Inicio . (B) Las aperturas se encuentran en la interfaz de usuario de TEM. Seleccione la "Apertura objetiva" deseada después de que se hayan realizado las funciones automáticas y ejecute "Autoestigma" con la apertura adentro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Figura 7: Descripción general de la pestaña Tomografía. Las imágenes muestran la interfaz de usuario de Tomo 5.8. (A) Posiciones de lote. Las últimas funciones representadas en la imagen: la opción "Adquirir mapa de búsqueda"; Las posiciones del tomograma se muestran en la vista Atlas con la opción de zoom; resaltado en la parte superior derecha está "Seleccionar posiciones"; a continuación, se han seleccionado las cuatro posiciones para "Actualizar desenfoque". (B) Se seleccionan tres posiciones en el mapa de búsqueda, etiquetadas como 1, 2 y 3. La posición 1 no planteará un problema cuando se ejecute "Refinar todo". Sin embargo, si en un ajuste de alta densidad de objetivos, como cuando se seleccionan las posiciones de las laminillas, como se muestra para la posición 2 y la posición 3, entonces "Refinar todo" ejecutará la rutina "Seguimiento" y "Enfoque" en la región de "Exposición" de la posición 2, exponiendo el objetivo antes de que se adquiera el tomograma. El tipo de cuadrícula es R1.2/1.3. Barra de escala = 1,2 μm. (C) Adquisición de datos. Las posiciones seleccionadas configuradas en "Posiciones por lotes" ahora se pueden adquirir individualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Figura 8: Definición del ángulo máximo de inclinación. La figura muestra un enfoque paso a paso para determinar el rango máximo de inclinación para la adquisición de tomogramas. (A) 0° visión general y un mapa de búsqueda en el centro del cuadrado de cuadrícula. Para probar el rango de inclinación, el ángulo se puede ajustar en el software de tomografía con "Establecer inclinación (°)" escribiendo el valor deseado y luego presionando Establecer. (B) El escenario se ha inclinado a -60°, lo que muestra que una esquina del mapa de búsqueda no se adquiriría completamente a -60°. (C) El escenario se ha inclinado a 60°. Al contar los agujeros que han desaparecido a ±60°, uno puede tener una idea sobre el rango de inclinación de un cuadrado de cuadrícula. Barras de escala = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Figura 9: Diagrama de flujo de emClarity. El diagrama de flujo describió los diversos pasos para el promedio de subtomograma criogénico. Barras de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Figura 10: Coincidencia de plantillas usando emClarity . (A) Una micrografía típica de apoferritina en una cuadrícula recubierta de grafeno. Desenfoque: −3.430 μm. (B) Una porción del tomograma superpuesta con puntos de modelo después de la búsqueda de plantillas. (C) Una vista superior y (D) una proyección lateral de los puntos del modelo, que indican una sola capa plana de partículas de apoferritina monodispersas. Barras de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figura 11: Cryo-ET STA de apoferritina . (A) El mapa final después de 21 ciclos de alineación de subtomograma. (B) La gráfica de correlación de conchas de Fourier (FSC) del mapa final con una resolución reportada de 2.86 Å, que contiene 38 FSC de cono. (C) Mapas de densidad representativos (equipados con el modelo PDB 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra</td>
			<td>Tipo Cryo-ET</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Rango de inclinación (+/-)</td>
			<td>Paso de inclinación (°)</td>
			<td>Rango de desenfoque (μm)</td>
			<td>Dosis total (e-/Å2)</td>
			<td>Resolución</td>
			<td>Datos brutos</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr><tr><td>Apoferritina</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & este documento</td>
		</tr><tr><td>Mordaza sobre el VIH-1</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosoma</td>
			<td>Purificado/Molecular (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Pico de SARS-CoV-2</td>
			<td>Lamela/Molecular (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Estructura del axón neuronal</td>
			<td>Celular (ultraestructural)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Parámetros de recolección para varios estudios crio-ET. Estudios dirigidos a la reconstrucción de detalles moleculares a partir de proteínas purificadas o in situ en comparación con un estudio destinado a resolver y segmentar las características celulares ultraestructurales.
Película 1: Un tomograma de muestras de apoferritina en una cuadrícula EM normal y luego fotografiado con un crio-TEM equipado con una cámara de ultra alta resolución con un filtro compatible. Las series de inclinación se adquirieron con un esquema simétrico de dosis, con un intervalo de inclinación de 54° y una dosis total de 134 e-/A2 en el software de tomografía electrónica. Barra de escala = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 2: Una tomografía de una neurona primaria cultivada en una cuadrícula EM y luego fotografiada directamente con un crio-TEM equipado con una cámara de ultra alta resolución con un filtro compatible. Las series de inclinación se adquirieron con un esquema simétrico de dosis, con un intervalo de inclinación de 60° y una dosis total de 120 e-/A2 en el software de tomografía electrónica. Barra de escala = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 3: Un tomograma de una cianobacteria en una rejilla EM, sometida a molienda FIB y luego fotografiada con un crio-TEM equipado con una cámara de alta velocidad y un filtro compatible. Las series de inclinación se adquirieron con un esquema simétrico de dosis, con un intervalo de inclinación de 50° y una dosis total de 120 e-/A2 en el software de tomografía electrónica. Barra de escala = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Archivo complementario 1: la plantilla del archivo de parámetros para estimar el desenfoque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Recopilación de datos y detalles de configuración del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla complementaria 2: Lista de comandos en el orden de ejecución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

El presente protocolo describe la adquisición remota de datos por criotomografía electrónica de alta resolución utilizando Tomo5 y el posterior procesamiento de datos y el promedio de subtomografías utilizando emClarity. La apoferritina se utiliza como ejemplo para ilustrar procesos detallados paso a paso para lograr una estructura crio-ET a una resolución de 2,86 Å.

Recopilación remota de datos por tomografía crioelectrónica y promedio de subtomografía

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Este protocolo proporciona una ruta de fácil acceso al mundo cada vez más popular pero complejo de la criotomografía electrónica. Se pueden obtener imágenes de seis especímenes celulares. Instituto en un estado cercano al nativo.Las micromoléculas pueden resolverse a alta resolución en su entorno celular nativo mediante el uso de CROW, ET y promedio de subátomos. Comience iniciando el software Tomo five desde la PC del servidor TEM. Inicie la configuración de la sesión ajustando los parámetros de adquisición de imágenes en la pestaña de preparación, en ajustes preestablecidos.Copie los parámetros de adquisición de imágenes en todos los demás ajustes preestablecidos de gran aumento. Pulse Set"para ajustar la exposición al microscopio y Get" para obtener los ajustes de exposición para todos los demás aumentos altos después de seleccionarlos individualmente. Para recopilar un atlas, haga clic en la pestaña "Nueva sesión" en el Atlas.Establezca las preferencias de sesión. Introduzca la ruta de almacenamiento y el formato de salida y pulse aplicar. Seleccione "Proyección" y marque todos los atlas que desea adquirir.Seleccione Cerrar válvulas de llamada"Si el microscopio no está supervisado, esto cerrará las válvulas de columna. Luego, para iniciar la proyección, presione el botón de inicio. Inspeccione los atlas únicos o múltiples en busca de objetivos haciendo clic en la cuadrícula en el panel izquierdo en Configuración de sesión"Luego haga clic izquierdo y arrastre el mouse para moverse y desplácese hacia el medio para acercar y alejar.Elija la cuadrícula para la configuración de destino. Selecciónelo y haga clic en Cargar muestra" desde dentro del software. Para realizar la calibración del desplazamiento de imagen, en la pestaña Funciones automáticas"establezca el ajuste preestablecido en Altura eucéntrica"Navegar a Eucéntrico automático" mediante inclinación de escenario y pulse Inicio.Si la función permaneció centrada durante la segmentación, omita las calibraciones de desplazamiento de imagen. De lo contrario, vaya a la pestaña Preparación "para calibrar el desplazamiento de imagen, seleccione Calibrar desplazamiento de imagen" y presione inicio. Esto alineará los aumentos más bajos con la función centrada en el aumento de la exposición.Para la configuración de la tomografía, inicie una nueva sesión en Configuración de sesión"para muestras biológicas. Elija Slab like"como el tipo de muestra y seleccione Lote" y Dosis baja"Luego seleccione la carpeta Formato de salida y almacenamiento". Opcionalmente, agregue un destinatario de correo electrónico y presione Aplicar"Para configurar objetivos, vaya a la flecha del atlas, busque una región de interés y muévase seleccionando las opciones que aparecen con un clic derecho del mouse.Tome una imagen general para confirmar una buena posición para el ajuste de altura eucéntrica. A continuación, pulse autoeucentric"para ejecutar la rutina eucentric by stage tilt, vuelva a adquirir una nueva imagen de visión general para actualizar la altura eucéntrica. Inspeccione la vista general cuadrada o el mapa de búsqueda adquirido.Muévase a una región de interés y presione adquirir búsqueda. Luego inspeccione la imagen de búsqueda si la región de interés no está centrada, haga clic derecho en la posición deseada y repita la etapa Mover aquí "y adquiera la imagen. Ajuste las áreas de enfoque y seguimiento.Haga clic izquierdo para arrastrar las áreas de seguimiento y enfoque. Una vez que todos los parámetros estén configurados, presione Agregar posición "Para realizar funciones automáticas, verifique la configuración para realizar las alineaciones a través de la pestaña Funciones automáticas" navegando por el atlas a un área de carbono. Lleve esa área a la altura eucéntrica y siga el orden de alineaciones como se describe en el manuscrito de texto.A continuación, inicie la adquisición automatizada de la pestaña de tomografía. Seleccione la losa de adquisición de datos y establezca los parámetros deseados. Configure los parámetros de adquisición de datos: paso de inclinación, ángulo positivo máximo, ángulo negativo máximo, esquema de seguimiento.A continuación, seleccione Cerrar válvulas de columna" para el esquema de altura eucéntrica. Comience con la preparación de archivos de entrada y directorios. Establezca una carpeta de proyecto en la carpeta Project".Crea otra nueva carpeta fija en pilas y prepara los archivos de entrada. Inclinación serie uno basculación fija serie 1. Serie XF e inclinación 1.tlt.Para calcular el desenfoque, actualice el archivo de parámetros con el microscopio y los parámetros de imagen. Copie un archivo de parámetros en la carpeta del proyecto. Cambie su nombre a param_CTF.M y ejecute el comando indicado. A continuación, verifique los resultados de la estimación de CTF. Para cada pila, verifique las pilas alineadas usando 3D mod y asegúrese de que las cuentas fiduciales se borren correctamente.Asegúrese de que la mano es correcta ejecutando el comando indicado. A continuación, compruebe el valor de desenfoque y asegúrese de que coincida con la estimación teórica de CTF. Para definir las subregiones, genere un tomograma de plegado.En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Determine los límites eligiendo seis puntos Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin y Zmax, para crear una subregión en la carpeta bin10, ejecute el comando indicado. A continuación, ejecute la selección de partículas para cada subregión.Para el conjunto de datos de apoferritina, realice una búsqueda de plantillas en el contenedor seis. Modifique el ángulo de subrayado de la plantilla. Parámetros de búsqueda para determinar el ángulo, el rango y los intervalos para la búsqueda dentro o fuera del plano en grados.En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Elimine las partículas incorrectas usando 3D mod debajo de la carpeta. Convmap_wedge_Type2_bin6. Ejecute el comando indicado.A continuación, inicialice el proyecto. En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado para crear una base de datos para mayor claridad EM, AppoF.mat. Realice la reconstrucción del tomograma antes del promedio y la alineación del subtomo para generar tomogramas de subregión corregidos por CTF en bin4, ejecute el comando indicado.A continuación, para realizar el promedio y la alineación de sub tomo, realice el promedio utilizando los subtelegramas corregidos de CTF a partir de bin4. En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Continúe haciendo alineaciones y ejecute el comando.Limpie las partículas superpuestas ejecutando el comando indicado. Realice la reconstrucción final combinando los dos conjuntos de datos de la mitad. En la carpeta del proyecto ejecute los comandos indicados.La descripción general del flujo de trabajo de tomografía para la tomografía celular y molecular se muestra aquí para muestras celulares y laminares, la estrategia de recopilación de datos depende en gran medida de la muestra y el objetivo del estudio de imagen. Aquí se muestran los parámetros de recolección para varios estudios crioET. Aquí se muestran tomogramas representativos de muestras moleculares como apoferritina, procesos celulares delgados y láminas fresadas por haz de iones enfocados de la muestra celular gruesa.El análisis estructural de alta resolución puede ayudar a revelar sitios de unión para objetivos farmacológicos y la tomografía y el promedio subtomogral también han ayudado al desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

El agua de mar de muestreo y recolección

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Investigación

Biología

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Recolección e identificación de polen de colonias de abejas melíferas

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Recopilación de datos microscópicos de iluminación crioestructurada de células preservadas criogénicamente

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Construcción de un modelo esquelético equino tridimensional realista, de cuerpo entero utilizando datos de tomografía computarizada

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...