Name: cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging
Uploaded: 2022-07-12T14:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Vi erkänner Diamond Light Source för tillgång till och stöd för kryo-EM-anläggningarna vid Storbritanniens nationella Electron Bio-Imaging Center (eBIC), finansierat av Wellcome Trust, MRC och BBRSC. Vi vill också tacka Andrew Howe för förvärvet av Apoferritin-tomogrammet (film 1), Ishika Kumar för beredningen och förvärvet av neurontomogrammet (film 2) och Craig MacGregor-Chatwin för cyanobakteriernas lamelltomogram (film 3).

<ol>
	<li>Bai, X. -. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> eLife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoTEM+with+a+cold+field+emission+gun+that+moves+structural+biology+into+a+new+stage.">CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SerialEM:+A+program+for+automated+tilt+series+acquisition+on+Tecnai+microscopes+using+prediction+of+specimen+position.">SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position.</a> Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+EPU:+SPA+getting+intelligent.">Smart EPU: SPA getting intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+cryo-EM+single-particle+analysis+in+RELION-4.0.">New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0.</a> Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li><li>Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tomography+in+EMAN2.">Single particle tomography in EMAN2.</a> Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).</li><li>Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+macromolecular+structures+from+electron+cryo-tomography+data+using+subtomogram+averaging+in+RELION.">Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION.</a> Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).</li><li>Himes, B. A., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity:+Software+for+high-resolution+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).</li><li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM.">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li><li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+cryo-electron+microscopy:+From+sample+to+structure.">Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+macromolecular+assemblies+by+electron+microscopy.">Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy.</a> Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li><li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography.">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li><li>Liu, Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotropic+reconstruction+of+electron+tomograms+with+deep+learning.">Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-The+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Allegretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+the+nuclear+pore+and+snapshots+of+its+turnover.">In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover.</a> Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+sarcomere+organization+in+vertebrate+skeletal+muscle.">The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle.</a> Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).</li><li>Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+transmission+electron+microscopy.">Conventional transmission electron microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).</li><li>Wagner, J., Schaffer, M., Fern&#225;ndez-Busnadiego, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography-The+cell+biology+that+came+in+from+the+cold.">Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold.</a> FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery.">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li><li>Erdmann, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+gradient+organization+of+ribosome+biogenesis+in+intact+nucleoli.">In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli.</a> Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+Image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+A+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+A+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Himes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=emClarity.">emClarity.</a> GitHub. , (2021).</li><li>. The IMOD Home Page Available from: <a target="_blank" href="https://bio3d.colorado.edu/imod/">https://bio3d.colorado.edu/imod/</a> (2020)</li><li>. GitHub: emClarity-tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial">https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</a> (2021)</li><li>Ni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity.">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).</li><li>. MotionCor2 Available from: <a target="_blank" href="https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software">https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</a> (2016)</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdataresource.org/EMD-10101">https://www.emdataresource.org/EMD-10101</a> (2022)</li><li>Nedozralova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cryo-electron+tomography+reveals+local+cellular+machineries+for+axon+branch+development.">In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development.</a> Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).</li><li>Mendon&#231;a, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress.">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).</li><li>. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/6s61">https://www.rcsb.org/structure/6s61</a> (2019)</li><li>Nicastro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+architecture+of+axonemes+revealed+by+cryoelectron+tomography.">The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter.

Tomo5 Arbetsflödesbeskrivningen av tomografiprogramvaran belyser ett potentiellt och mest strömlinjeformat sätt för en (fjärr) batchtomografisession. Även om programvaran är lätt för nybörjare, kan viss initial kryo-EM-upplevelse och grundläggande tomografiförståelse hjälpa till med installationen. Kritiska steg markeras i protokollet och bör hjälpa till att felsöka även om en annan installationsmetod har använts. Utvecklingen av programvaran kommer att underlätta (fjärr) datainsamling och göra cryo-ET mer tillgänglig för en bred användarbas. Några tips och tricks som kan hjälpa till att felsöka vanliga problem beskrivs nedan.
En viktig punkt att diskutera är valet av rutnät eftersom gallerstänger vid höga lutningar kan dölja utsikten (figur 8) när du lutar provet till ±60 °. På ett TEM-rutnät avser maskstorleken antalet rutnätsrutor per längdenhet på rutnätet. Större maskantal har fler rutnätsrutor per längdenhet, en högre densitet av rutnätsrutor och mindre rutnätsrutor, dvs. ett rutnät med 400 maskor har mindre rutor än ett rutnät med 200 maskor. Ett bra val av galler för tomografi är 200-mesh eller 300-mesh galler. Som visas i figur 8 minskas det tillgängliga området att samla in när rutnätet lutas. Vid ±60 ° lutning kommer ett 300-maskigt rutnät att ha ett litet synfält på vilket ett fullständigt tomogram kan förvärvas. Fördelarna med 200-maskiga rutnät är att de större rutnätsrutorna gör molekylär tomografiinställning snabbare, och med den ökade rutnätskvadratytan kommer en kvadrat sannolikt att räcka för en samling över natten. Nackdelen är att 200-nätsgaller är mer ömtåliga, så hantering och klippning kräver mer finess.
Dessutom, om man använder hålig stödfilm (se materialtabell) på EM-rutnät, måste hålavståndet beaktas för att ställa in fokus- och spårningsområdet i förhållande till exponeringsområdet. Helst bör stråldiametern vid önskad förstoring vara tillräckligt liten för att täcka kolområdet intill exponeringsområdet längs lutningsaxeln för optimal och snabb installation. På så sätt kan potentiella regioner av intresse i varje hål förvärvas.
Eftersom programvarans eucentriska höjdrutin för närvarande inte är lika robust, till exempel serialEM-rutinen, kan följande tips lösa det problemet. Om den eucentriska höjdbestämningen misslyckas med den eucentriska höjdförinställningen kan man istället använda översiktsförinställningen och köra om "Auto-eucentrisk genom steglutning"; Detta kan lösa problem om den eucentriska höjden är långt ifrån 0. Om detta lyckas kan man köra om "Auto-eucentric by stage tilt" med "Eucentric Height" förinställningar för att förbättra precisionen. Om det misslyckas kan man köra "Auto-Eucentric by beam tilt" med den eucentriska höjden förinställd och sedan köra om "Auto-Eucentric by stage tilt" eller manuellt ställa in z-höjden konsoliderad med "Auto-Eucentric by beam tilt" i TEM-användargränssnittet under "Stage" -inställningarna. Om rutnät med ett upprepande hålmönster används kan de förhindra identifiering av en enda korskorrelationstopp. Man kan försöka ändra den eucentriska höjdförinställningen till en lägre oskärpaförskjutning som −25 μm och/eller en kortare exponeringstid för att minska korskorrelationen från hålmönstren. Å andra sidan kan det hända att användning av spetsiga galler / lameller inte ger tillräcklig signal för en stark korskorrelationstopp. Man kan försöka ändra den eucentriska höjdförinställningen till en större oskärpaförskjutning som −75 μm och/eller en förlängd exponeringstid för att förbättra korskorrelationstoppen. Ett annat alternativ är att justera bildfilterinställningarna; de finns på fliken "Förberedelse". Alternativ för att justera filterinställningarna kan ställas in för låg (Översikt/rutnät), medium (Eucentrisk höjd) och hög förstoring (Spårning/Fokus) för att hitta den optimala korskorrelationstoppen för varje förinställning. Den önskade inmatningen är en bild, dvs vid 0 ° och en vid 5 °, följt av att klicka på Jämför för att jämföra båda bilderna. Rekommenderat startvärde för den längsta våglängden är en fjärdedel av skalstrecket i bilden och för den kortaste våglängden är en fyrtiondel av skalstrecket. Om toppen inte är robust identifierad kan man optimera inställningarna tills en övertygande topp kan hittas. Det finns inget behov av att skaffa bilder varje gång; att bara trycka på "Jämför" räcker. Om TOMO fortfarande inte automatiskt hittar den eucentriska höjden kan den manuella eucentriska höjdkalibreringen användas. Man bör centrera över en någorlunda stor iskristall i översiktsförstoring på fliken "Förberedelse", sedan gå till "Scenkontrollen" i TEM-användargränssnittet, ställa in alfa på −30° och justera steg z-värdet för att centrera om kristallen med hjälp av den fluorescerande skärmbilden. Om du väljer inställningarna "Hög upplösning" och "Hög kontrast" i TEM-användargränssnittet blir det enkelt (knappar längst ner i det fluorescerande skärmfönstret). Alternativt, om det finns tillgång till en kamera med live-läge, kan detta användas för att bestämma den eucentriska höjden; Det blir enklare än på den fluorescerande skärmen.
De största begränsningarna i Tomo5-versioner före 5.8 är de saknade medelstora förstoringsmontagena, saknat dossymmetriskt schema och problem relaterade till eucentrisk höjdsökning. Dessa finns i serialEM, ett freeware med snabb utveckling och samhällsstöd, en robust eucentrisk höjdrutin och möjligheten att skripta, dvs ett specialbyggt dossymmetriskt schema. Från version 5.8 och framåt i Tomo5 har det vanligaste problemet för att hitta den eucentriska höjden, dvs. en misslyckad looping runt mål-z-värdet, lösts genom att implementera alternativet att ställa in ett eucentriskt höjdacceptanskriterium. Men med olika rutnäts- och provtyper rekommenderas det starkt att justera bildfilterinställningarna för att återspegla de unika bildförhållandena för enskilda sessioner och för att ge bästa möjliga korskorrelationstopp för att hitta den eucentriska höjden och för att fokus- och spårningsregionen ska fungera tillförlitligt under tomogramförvärv.

Sammantaget har många anläggningar snabbt anpassat sig till fjärrdrift under pandemin. Tomo5-programvaran ger en enkel åtkomst och användarvänlig väg till tomografi som är väl lämpad för fjärrstyrning. De framsteg som gjorts inom programvaran kommer utan tvekan att fortsätta att göra fjärrdatainsamlingar och tomografiinsamling i allmänhet mer vanliga i samhället.
emClarity Eftersom emClarity använder en mallbaserad partikelplockningsmetod behöver den en mall för objektet av intresse. Partikelplockningen (steg 2.6) är mycket känslig och nyckeln till den slutliga strukturen. Innan medelvärde och justering (steg 2.9) måste man se till att kontrollera noggrant och manuellt ta bort de falska positiva resultaten. När en mall inte är tillgänglig kanske emClarity inte är lätt att använda, men det är möjligt att använda annan programvara, till exempel Dynamo37 och PEET48, för att skapa en första modell.
För heterogena prover är emClarity utrustad med en klassificeringsmetod som gör det möjligt för användare att fokusera på specifika funktioner med olika skalor. Det är bra att köra några cykler med justeringar före klassificering och köra den vid en högre binning (till exempel bin 4 eller bin 3).
Den uppdaterade versionen av programvaran (V1.5.3.11) har betydande uppdateringar jämfört med den första versionen (V1.0)17. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, en handenhetskontroll under CTF-uppskattning (steg 2.3); symmetri för inriktningar (CX, I, I2, O); beräkning av 3D-provtagningsfunktioner per partikel (3DSF); en övergång till MATLAB 2019a för kompatibilitet och stabilitet; och rekonstruktion med hjälp av råprojektionsbilderna (cisTEM). Programvaran kommer att fortsätta att förbättras för olika prover, och de senaste meddelandena finns online (se materialförteckning).

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) är allmänt känd för att ha upplevt en renässansperiod, vilket påskyndar den till att bli ett centralt och centralt användbart verktyg inom strukturbiologi. Utveckling och användning av direkta elektrondetektorer 1,2,3, förbättrade mikroskop och elektronkällor 3,4,5, förbättringar i automatisering/genomströmning 6,7,8,9 och beräkningsframsteg inom enpartikelanalys10,11,12,13 ,14 och tomografi15,16,17 är alla delvis ansvariga för teknikens senaste framgång. Dessa tekniska drivkrafter har utvecklat kryo-EM: s förmåga att lösa biologiska makromolekylära strukturer under kryogena och inhemska förhållanden. De upplösningar som är lätta att få är tillräckliga för atomärt korrekt modellering och har fört tekniken i framkant på den strukturbiologiska arenan. Ett reduktionistiskt tillvägagångssätt för att uttrycka och rena ett biologiskt mål av intresse har länge visat sig vara framgångsrikt inom makromolekylär kristallografi (MX) för grundläggande biologisk forskning, läkemedelsupptäckt och translationell vetenskap. På samma sätt kan cryo-EM nu leverera resultat som parallella högupplösta MX-studier. Den nuvarande stora framgången inom kryo-EM-grenen av strukturbiologi kallas enkelpartikelanalys (SPA), som förvärvar 2D-projektionsbilder vanligtvis av ett renat proteinprov18 för att få tusentals visningar av en biologisk makromolekyl19. Dessa bilder (1) innehåller information från en rad vyer som fullt ut representerar målets orienteringar i 3D-rymden och (2) fångar objektets konformationella heterogenitet, som senare kan separeras och undersökas.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att förvärva dessa 2D-projektionsbilder av biologiska prover, även på plats och utan rening, är kryoelektrontomografi (kryo-ET). Cryo-ET tar en serie bilder av samma objekt i lutande vinklar genom att mekaniskt rotera provet. Således samlas de 2D-projektioner som samlas in i SPA, som representerar vinkelställningarna för molekylen av intresse, i sig som en del av kryo-ET-avbildningsexperimentet20. Tomografiska lutningsserier rekonstrueras sedan till ett tomogram som innehåller 3D-representationer av de avbildade makromolekylära komplexen. Arten av tomografisk datainsamling minskar i viss mån beroendet av medelvärde för att uppnå en fullständig 3D-representation av en molekyl från en samling 2D-bilder. På grund av nuvarande scendesign lutas dock provet vanligtvis från −60 ° till +60 °, vilket lämnar en saknad kil21 av information i den tomografiska 3D-rekonstruktionen.
3D-rekonstruktionerna i ett enda tomogram har då en saknad kil av information och låg signal till brus. Enskilda makromolekyler kan extraheras som subtomogram och medelvärdet tillsammans för att hantera detta. Där varje makromolekyl i ett subtomogram finns i en annan riktning, är den saknade kilen orienterad annorlunda i varje subtomogram av målobjektet, så medelvärde över många kopior fyller i information på grund av den saknade kilen. Den senaste utvecklingen inom bildbehandling har också försökt träna neurala nätverk med artificiell intelligens för att fylla i den saknade kilen med meningsfulla data22. Denna medelvärdesprocess ökar också signalen till brus, liknande målet att medelvärde i enpartikelanalys, så rekonstruktionens kvalitet och upplösning förbättras. Om molekylen av intresse har symmetri kan även den definieras och användas under medelvärdet, vilket ytterligare förbättrar rekonstruktionsupplösningen. Extraktionen av 3D-volymer av en makromolekyl från ett tomogram till en uppsättning subtomogram och deras efterföljande bearbetning är känd som subtomogrammedelvärde (STA)23. Om varje subtomogram representerar en unik kopia av molekylen som studeras, kan eventuell strukturell heterogenitet förhöras med hjälp av STA-arbetsflödet. Som vanligtvis används i SPA-arbetsflödet kan klassificeringstekniker användas under STA för att dissekera konformationstillstånden för komplexet av intresse. Förutom STA som möjliggör högupplöst rekonstruktion i kryo-ET, gör detta tillvägagångssätt tekniken till ett kraftfullt verktyg för att förhöra de strukturella mekanismerna hos makromolekyler i deras ursprungliga cellulära miljö eller av mål som ofta inte är mottagliga för SPA24,25,26.
Elektrontomografi har en lång historia av att bestämma 3D-ultrastrukturen hos cellulära prover vid rumstemperatur27. Förvärvet av vyer genom fysisk lutning av provet ger tillräckligt med information för 3D-rekonstruktion av ett objekt i celllängdsskalor och är särskilt viktigt när cellulära strukturer saknar regelbundenhet för medelvärde. Celler kan också frysas på substrat för kryo-ET-avbildning vid cellkanterna där provet är tillräckligt tunt för att vara elektrontransparent. Under dessa förhållanden kan STA användas för att bestämma makromolekylära strukturer i en cellulär miljö, om än när provet är tillräckligt tunt för att vara elektrontransparent28. Men i kombination med ytterligare preparativa tekniker, inklusive kryo-korrelativt ljus och elektronmikroskopi (kryo-CLEM) och fokuserad jonstrålefräsning (kryo-FIB), kan kryo-ET användas för att avbilda inuti hela celler under kryogena förhållanden29. Detta sammanför kraften i kryo-ET för att studera den cellulära ultrastrukturen med kraften i STA för att bestämma strukturerna för makromolekylära komplex på plats samtidigt som de identifierar deras cellulära plats 30 och ger ögonblicksbilder av komplex som är engagerade i dynamiska processer31. Teknikens förmåga att avbilda cellulära prover och använda STA i flera studier har belyst teknikens kraft att lösa makromolekylära strukturer in situ, även vid upplösningar jämförbara med SPA32. En ytterligare fördel finns i kunskapen om makromolekylens ursprungliga placering, representerad av den slutliga klassificerade 3D-rekonstruktionen i tomogrammet30. Därför kan den makromolekylära strukturen korreleras med den cellulära ultrastrukturen. Dessa observationer över längdskalor kommer förmodligen att leda till viktiga fynd där strukturella mekanismer kan korreleras med cellulära förändringar i samband med funktionella studier.
Cryo-ET och STA tillåter datainsamling i tre stora arbetsflöden: molekylär, cellulär och lamelltomografi. Strukturerna för renade makromolekylära komplex kan bestämmas av kryo-ET genom molekylär tomografi. Att bestämma proteinstrukturer i deras cellulära miljö där cellen är tillräckligt tunn kan beskrivas som cellulär tomografi. På senare tid, med utvecklingen av kryogen inriktning och fräsning, kan samma tekniker tillämpas i lamelltomografiarbetsflöden för att bestämma proteinstrukturerna djupt inne i cellen i deras ursprungliga miljö samtidigt som de avslöjar det cellulära sammanhanget där dessa proteiner observeras. Olika datainsamlingsstrategier kan användas beroende på tillgängliga programvarupaket och, viktigast av allt, beroende på provets krav. Molekylära eller icke-vidhäftande prover på ett koppar-TEM-rutnät av ett renat protein kräver vanligtvis mindre hantering och förblir därför plana och oskadade i ideala fall. Elektrontomogram kan enkelt ställas in i serie över ett håligt kolnät för att snabbt förvärva tiotals till hundratals tomogram på ett systematiskt sätt. Det enklaste sättet för användare att ställa in molekylära tomografiprover där proteiner finns rikligt på nätet skulle vara att använda Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi som används i denna studie, se Materialförteckning). Andra tomografiprogram som Leginon9 och serialEM6 finns också tillgängliga; De erbjuder fler installationsalternativ för mer personliga metoder för datainsamling men är mer komplexa och kan därför vara svårare att navigera, särskilt för användare som är nya inom tomografi och användare som har åtkomst till sin session på distans. För en anläggning med en stor och mångsidig användarbas är Tomo5 lätt att använda i en avlägsen miljö och att utbilda användare i. För vidhäftande celler kräver rutnät vanligtvis fler hanteringssteg, och behovet av att använda ömtåliga guldgaller ökar behovet av förbättrad vård i hanterings- och datainsamlingsstrategier. För att underlätta att hitta ett cellulärt område av intresse och undvika ocklusion från själva gallret i höga lutningsvinklar är det också fördelaktigt att använda större maskstorlekar, men till kostnaden att de i sig är mer ömtåliga. För lamellprover bestäms provets bräcklighet av lamellens kvalitet, som kan vara variabel. Dessa faktorer ökar installationstiden och övervägandena, men den ökade anpassningsförmågan och robustheten gör återigen Tomo5 lämplig för denna typ av datainsamling. Det finns dock specialiserade datainsamlingsscenarier för varje arbetsflöde. BISECT och PACE-tomo (båda körs i SerialEM) introducerar möjligheten till skriptad strålbildsförskjutning under tomografiförvärv för att öka tomograminsamlingshastigheten28, särskilt vid molekylär tomografi. Medelstora förstoringsmontage (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bättre identifiera och exakt rikta in sig på molekylära funktioner i alla arbetsflöden, även om dessa funktioner i skrivande stund börjar implementeras i Tomo5.
Liksom SPA blir kryo-ET och STA alltmer tillgängliga genom de förbättringar som gjorts av förvärvsprogramvara och en mängd tillgängliga paket för subtomogram i genomsnitt 16,17,32,34,35,36,37,38. Dessutom, under pandemin, blev det viktigt att möjliggöra fjärråtkomst till kryo-EM-instrumentering för den fortsatta driften av nationella anläggningar som electron Bio-Imaging Center (eBIC) vid Diamond Light Source (DLS), Storbritannien. Denna utveckling har gjort kryo-ET mer tillgängligt och robust för forskare som vill använda tekniken. När data har förvärvats är STA ett viktigt verktyg för att analysera återkommande objekt för att uppnå maximal upplösningsrekonstruktion och möjliggöra klassificering av makromolekylär heterogenitet. Det nuvarande protokollet syftar till att ge en detaljerad genomgång av att förbereda ett kryo-TEM-mikroskop för kryo-ET-datainsamling och hur man utför subtomogrammedelvärde med emClarity på en molekylär tomografidatauppsättning av apoferritin som ett exempel. Användningen av emClarity (programvara för högupplöst kryoelektrontomografi och subtomogrammedelvärde, se Materialförteckning) kräver att skript körs från kommandoraden, så en nivå av förtrogenhet med Linux / UNIX-system antas.
Fjärranslutningen beror på nätverksmiljön i varje institut/anläggning. På eBIC använder fjärrsystemet program som tillåter fjärrdatainsamling på den specifika nätverkskonfigurationen som används på Diamond. Fjärranslutning till mikroskopet underlättas av två plattformar: NoMachine och TeamViewer (se Materialförteckning). Med hjälp av programmet NoMachine kan användaren logga in på ett fjärrskrivbord i Windows. Det fjärranslutna Windows-skrivbordet som tillhandahålls av NoMachine finns i samma nätverk som mikroskopet och fungerar därmed som en virtuell support-dator till mikroskopet. Från den virtuella supportdatorn ansluter användaren till mikroskopet via TeamViewer som ger direkt åtkomst och kontroll till mikroskopdatorn som kör TUI och Tomo.
Detta protokoll består av två delar (steg 1 och steg 2). Steg 1 fokuserar på fjärrinsamling av kryo-ET-data med Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi). Genomgången för en (fjärr) session tar bilder vid allt högre förstoringar för att i slutändan låta användaren rikta tomografiprogramvaran till målprovområden för tomografisk datainsamling. Figur 1 sammanfattar denna process. Steg 2 beskriver kryo-ET STA-databehandling med emClarity (programvara för högupplöst kryoelektrontomografi och subtomogrammedelvärde). Figur 9 sammanfattar denna process.
Protokollet är avsett för en fjärrpublik. Det förutsätter att personen fysiskt vid mikroskopet och laddar proverna har gjort direktinriktningarna och tagit hand om kamerainställningen och fått referensförvärv. För detta protokoll antas ett linssystem med tre kondensorer med en autoloader. För ytterligare detaljerade riktlinjer för tomografiprogramvaran finns en detaljerad manual från tillverkaren tillgänglig i Windows Start-knapp där programvaran laddades från.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.9.0</td>
			<td>Internal terminology: Tomo5 in document</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM server</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5.10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigitalMicrograph</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>3.44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emClarity</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>1.5.3.11</td>
			<td>Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>Free for academic use</td>
			<td>1.1.0</td>
			<td>A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded 
			on dose fractionated movie stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETomo</td>
			<td>Open-Source software</td>
			<td>4.11</td>
			<td>ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NoMachine</td>
			<td>NoMachine, freeware</td>
			<td>7.9.2</td>
			<td>Remote desktop software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeamViewer</td>
			<td>TeamViewer AG</td>
			<td>-</td>
			<td>Remote access and remote control computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil (holey support film) EM grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>-</td>
			<td>A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Titan Krios G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3 camera and GIB energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera and Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the emClarity software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download IMOD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the emClarity online tutorial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download MotionCor2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging

Kryoelektrontomografi (kryo-ET) har fått fart de senaste åren, särskilt sedan introduktionen av direkta elektrondetektorer, förbättrade automatiserade förvärvsstrategier, preparativa tekniker som utökar möjligheterna för vad elektronmikroskopet kan avbilda med hög upplösning med kryo-ET och ny subtomogrammedelvärdesprogramvara. Dessutom har datainsamlingen blivit alltmer strömlinjeformad, vilket gör den mer tillgänglig för många användare. SARS-CoV-2-pandemin har ytterligare påskyndat datainsamlingen för kryoelektronmikroskopi (kryo-EM), särskilt för kryo-EM med en partikel, i många anläggningar globalt, vilket ger oavbruten användaråtkomst till toppmoderna instrument under pandemin. Med de senaste framstegen inom Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi) har fjärrinsamling av kryo-ET-data blivit robust och lätt att hantera var som helst i världen. Den här artikeln syftar till att ge en detaljerad genomgång, med utgångspunkt från datainsamlingsinställningen i tomografiprogramvaran för processen med en (fjärr) kryo-ET-datainsamlingssession med detaljerad felsökning. Det (avlägsna) datainsamlingsprotokollet kompletteras ytterligare med arbetsflödet för strukturbestämning vid nästan atomär upplösning genom subtomogrammedelvärde med emClarity, med apoferritin som exempel.

För cell- och lamellprover beror datainsamlingsstrategin till stor del på provet och målet med bildstudien (figur 1). Inriktningsmetoden beror på om det molekylära målet är in situ eller framställt från det renade makromolekylära komplexet för högupplösta rekonstruktionsprover som innehåller molekylära mål. För renade komplex som förglasats på håliga (kol) galler kan inriktning helt enkelt baseras på avbildning i hålen i (kol) stödfilmen. För in situ-arbete kräver inriktningsmetoden kunskap om placeringen av den molekylära enheten baserat på korrelativa data eller kända cellulära landmärken med låg förstoring. Cellulära landmärken skulle helst kunna identifieras när du tar översiktsbilder och, om det är tillräckligt för att grovt lokalisera intressanta regioner, kan ge ett snabbt sätt att bekräfta målidentitet med en sökbild. Men om de observerbara händelserna är sällsynta kan sökbilder med medelstor förstoring behövas för att kvalificera att målet är korrekt. Sökkartor är medelstora förstoringsmontage av sökbilder och kan därmed göra målsökning mycket enklare, där de kan förvärvas med en förstoring där funktionen av intresse är synlig. Sökkartor kan sedan screenas för att hitta och ställa in målbatchpositioner. För prover som innehåller cellulära egenskaper för ultrastrukturell rekonstruktion är inriktningsmetoden liknande, men lika beroende av synligheten av cellulära händelsen vid olika förstoringar och dess förekomst i provet.
Datainsamlingsstrategin måste också övervägas; I samtliga fall avgör studiens mål till stor del hur data samlas in. För rekonstruktion av den cellulära ultrastrukturen kan en låg förstoring (20-5 Å/px) och stort synfält vara lämpligt, men höga förstoringar krävs för att rekonstruera molekylära eller högupplösta detaljer (5-1 Å/px). Ett dataset som samlas in vid 1,5 Å/px under ideala förhållanden kommer endast fysiskt att kunna producera en rekonstruktion vid Nyquistfrekvensen 3,0 Å/px; Men i verkligheten påverkar många faktorer, inklusive men inte begränsat till provtjocklek, storlek och heterogenitet, alla den erhållna rekonstruktionskvaliteten. De exakta avbildningsparametrarna balanserar också förstoringen baserat på studiens mål med synfältet att innehålla tillräckligt med information. Denna artikel presenterar ett subtomogram medelvärdesfall som når 2,86 Å, men ytterligare studier 17,42,43,44,45 presenteras i tabell 1 för att illustrera insamlingsparametrarna associerade med studier som riktar sig mot olika resultat17,42,45,46.
När ett inriktningsarbetsflöde och datainsamlingsregim för kryo-ET har upprättats är datainsamling av många olika provtyper möjlig. Representativa tomogram av en mängd olika prover presenteras här: molekylära prover såsom apoferritin (film 1), tunna cellulära processer (film 2) och FIB-fräst lamell av det tjocka cellulära provet (film 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig01.jpg"> Bild 1: Översikt över konfigurationen av tomografiarbetsflödet. Kryo-ET-bildarbetsflödet som beskrivs i protokollet visas som ett flödesschema. De bilder som förväntas förvärvas visas för det cellulära och molekylära arbetsflödet. Den presenterade namngivningen följer Tomo5-konventionen, även om de flesta programvaror för insamling av tomografi delar gemensamma principer för att samla in dessa bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig02.jpg"> Bild 2: Förberedelseflik och sökförinställda villkor . (A) Översiktsbild av hela fliken. Förinställningar för bildvillkor ställs in på den här fliken och "Kalibrera bildskift" och "Bildfilterinställningar" finns i rullgardinsmenyn "Uppgifter". (B) Zooma in i rullgardinsmenyn "Förinställningar" där varje förinställning kan väljas för individuella bildförhållanden. (C) Bild som visar en tillräcklig förstoring för att passa både exponeringen och området "Fokus och spårning" i synfältet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig03.jpg"> Figur 3: Dosberäkningar. Exempel på dosberäkningar för möjliga tomogramanskaffningsscheman där dosraten har mätts över vakuum. De två beräkningarna bestämmer exponeringstiden (erna) för varje lutning, oavsett om de är inriktade på en optimal dos per tilt eller en optimal total dos för full tilt-serien. Vid subtomogrammedelvärde är det vanligt att rikta in sig på en optimal dos per lutad bild i intervallet 3,0-3,5 e-/Å2. I båda fallen är "Fraktioner (Nr.)" inställda på 6 för att uppnå ~ 0,5 e-/Å2 dos per filmram av lutningen för tillräcklig signal för att utföra rörelsekorrigering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig04.jpg"> Bild 4: Fliken Atlas. Översiktsbild på fliken "Atlas". Bilden har beskurits för att undvika tomma rutnätspositionsutrymmen. Menyn "Uppgifter" innehåller inställningar för sessionsinställningar och rutnätsvalsutrymmen för individuellt urval av alla rutnät som inventerats och ett alternativ att skaffa en enda atlas efter att kassetten har tagits bort från autoladdaren. Ett valt rutnät kan återställas och sedan förvärvas igen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig05.jpg"> Bild 5: Kalibrerade bildförskjutningar. Bilden visar en exponerings- och sökbild. Det röda korset i sökbilden är den förskjutna markören för att korrigera förskjutningen mellan exponering och sökning. Man bör göra om bildskiftskalibreringar vid sessionens start eller efter att ha ändrat förinställningarna för bildtillstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig06.jpg"> Bild 6: Autofunktioner och bländare. (A) Fliken "Autofunktioner" visar rullgardinsmenyn "Förinställningar" och valet "Uppgift". Understruken i blått är förinställningen "Thon Ring" som krävs för "Autostigmate" (även understruken i blått) och "Autocoma". Man bör välja respektive förinställningar för varje uppgift och sedan trycka på Start-knappen. (B) Bländare finns i TEM-användargränssnittet. Välj önskad "Objektiv bländare" efter att autofunktionerna har utförts och kör "Autostigmate" med bländaren i. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig07..jpg"> Bild 7: Översikt över fliken Tomografi. Bilder visar Tomo 5.8-användargränssnittet. A) Partipositioner. De senaste funktionerna som visas i bilden: alternativet "Skaffa sökkarta"; Tomogrampositioner visas i atlasvyn med inzoomningsalternativet; markerad längst upp till höger är "Välj positioner"; nedan har alla fyra positionerna valts till parametrarna "Uppdatera oskärpa". (B) Tre positioner väljs på sökkartan, märkta 1, 2 och 3. Position 1 kommer inte att utgöra ett problem när "Förfina alla" körs. Men om i en inställning med hög måltäthet, till exempel när lamellpositioner väljs, som visas för position 2 och position 3, kommer "Förfina alla" att köra "Tracking" och "Focus" -rutinen på "Exponering" -regionen i position 2 och exponera målet innan tomogrammet förvärvas. Rutnätstypen är R1.2/1.3. Skalstreck = 1,2 μm. (C) Datainsamling. Valda positioner i "Batchpositioner" kan nu förvärvas individuellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig8v2.jpg"> Bild 8: Definiera maximal lutningsvinkel. Figuren visar en steg-för-steg-metod för att bestämma det maximala lutningsområdet för tomogramförvärv. (A) 0° översikt och en sökkarta i mitten av rutnätet. För att testa lutningsområdet kan vinkeln ställas in i tomografiprogramvaran med "Set Tilt (°)" genom att skriva önskat värde och sedan trycka på Set. (B) Scenen har lutats till −60°, vilket visar att ett hörn av sökkartan inte skulle förvärvas fullt ut vid −60°. (C) Steget har lutats till 60°. Genom att räkna hålen som har försvunnit vid ±60° kan man få en uppfattning om lutningsområdet för en rutnätsruta. Skalstreck = 2,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig08v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig09.jpg"> Bild 9: emClarity flödesschema. Flödesschemat beskrev de olika stegen för kryo-subtomogrammedelvärde. Skalstänger = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig10.jpg"> Bild 10: Mallmatchning med emClarity . (A) En typisk mikrograf av apoferritin på ett grafenbelagt rutnät. Oskärpa: −3.430 μm. (B) En bit av tomogrammet överlagrat med modellpunkter efter mallsökning. (C) En topp och (D) en sidoprojektionsvy av modellpunkter, som indikerar ett enda plant lager av monodisperserade apoferritinpartiklar. Skalstänger = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63923/63923fig11.jpg"> Figur 11: Cryo-ET STA för apoferritin . (A) Den slutliga kartan efter 21 cykler av subtomograminriktning. (B) Den slutliga kartans Fourierskalkorrelationsdiagram (FSC) med en rapporterad upplösning på 2,86 Å, innehållande 38 koniska FSC:er. (C) Representativa densitetskartor (utrustade med PDB-modell 6s6147). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prov</td>
			<td>Cryo-ET-typ</td>
			<td>Å/px</td>
			<td>Lutningsområde (+/-)</td>
			<td>Lutningssteg (°)</td>
			<td>Oskärpa (μm)</td>
			<td>Total dos (e-/Å2)</td>
			<td>Resolution</td>
			<td>Rådata</td>
			<td>Hänvisning</td>
		</tr><tr><td>Apoferritin</td>
			<td>Renad/molekylär (STA)</td>
			<td>1.34</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.5</td>
			<td>102</td>
			<td>2.86</td>
			<td>EMPIAR-10787</td>
			<td>17 & detta dokument</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 Gag</td>
			<td>Renad/molekylär (STA)</td>
			<td>1.35</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1.5 – 3.96</td>
			<td>120</td>
			<td>3.1</td>
			<td>EMPIAR-10164</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>Ribosom</td>
			<td>Renad/molekylär (STA)</td>
			<td>2.1</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>2.2 – 4.3</td>
			<td>120</td>
			<td>7</td>
			<td>EMPIAR-10304</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>SARS-CoV-2 spik</td>
			<td>Lamell/molekylär (STA)</td>
			<td>2.13</td>
			<td>54</td>
			<td>3</td>
			<td>2 – 7</td>
			<td>120</td>
			<td>16</td>
			<td>EMPIAR-10753</td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Neuron axon struktur</td>
			<td>Cellulär (ultrastrukturell)</td>
			<td>5.46</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
			<td>3.5 – 5</td>
			<td>90</td>
			<td>N.D.</td>
			<td>EMPIAR-10922</td>
			<td>47</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Insamlingsparametrar för flera kryo-ET-studier. Studier inriktade på rekonstruktion av molekylära detaljer från renade eller in situ-proteiner jämfört med en studie som syftar till att lösa och segmentera de ultrastrukturella cellulära egenskaperna.
Film 1: Ett tomogram av apoferritinprover på ett normalt EM-rutnät och sedan avbildat med en kryo-TEM utrustad med en ultrahögupplöst kamera med ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 54° och en total dos på 134 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalstreck = 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/movie1_ApoF_50nmscale.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filmen.</a>
Film 2: Ett tomogram av en primär neuron som odlas på ett EM-rutnät och sedan avbildas direkt med en kryo-TEM utrustad med en ultrahögupplöst kamera med ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 60° och en total dos på 120 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalfält = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie2_neuron_100nm.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filmen.</a>
Film 3: Ett tomogram av en cyanobakterie på ett EM-rutnät, utsatt för FIB-fräsning och sedan avbildat med en kryo-TEM utrustad med en höghastighetskamera och ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 50° och en total dos på 120 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalstreck = 87,2 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/Movie3_lamella_100pxScale.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filmen.</a>
Tilläggsfil 1: Parameterfilmallen för uppskattning av oskärpan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande tabell 1: Uppgifter om datainsamling och mikroskopinställning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Kompletterande tabell 2: Lista över kommandon i exekveringsordningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63923/63923_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging at JoVE.com

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Detta protokoll beskriver högupplöst kryoelektrontomografi fjärrdatainsamling med hjälp av Tomo5 och efterföljande databehandling och subtomogrammedelvärde med emClarity. Apoferritin används som exempel för att illustrera detaljerade steg-för-steg-processer för att uppnå en kryo-ET-struktur vid 2,86 Å-upplösning.

Kryoelektrontomografi Fjärrdatainsamling och subtomogrammedelvärde

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Detta protokoll ger en enkel åtkomstväg in i den alltmer populära men komplexa världen av kryoelektrontomografi. Sex cellprover kan avbildas. Institut i ett nära hemland.Mikromolekyler kan sedan lösas med hög upplösning i sin ursprungliga cellulära miljö genom att använda CROW, ET och subatommedelvärde. Börja med att starta Tomo five-programvaran från TEM-serverdatorn. Starta sessionsinställningen genom att justera bildförvärvsparametrarna på förberedelsefliken under förinställningar.Kopiera parametrarna för bildförvärv till alla andra förstoringsförinställningar. Tryck på Set "för att ställa in exponering för mikroskopet och Get" för att få exponeringsinställningarna till alla andra höga förstoringar efter att ha valt dem individuellt. För att samla in en atlas, klicka på Ny session"i Atlas"-fliken.Ställ in sessionsinställningarna. Ange lagringsvägen och utdataformatet och tryck på apply. Välj Screening"och markera alla atlaser som ska förvärvas.Välj Stäng samtalsventiler"Om mikroskopet är oövervakat kommer detta att stänga kolonnventilerna. För att starta screeningen, tryck sedan på startknappen. Inspektera den enda eller flera atlaserna för mål genom att klicka på rutnätet i den vänstra panelen under Session Setup"Vänsterklicka sedan och dra musen för att flytta runt och mitten bläddra för att zooma in och ut.Välj rutnätet för målinställningen. Välj det och klicka på Ladda prov"inifrån programvaran. För att utföra bildskiftskalibrering, på fliken Autofunktioner"ställ in förinställningen till Eucentrisk höjd"Navigera till Auto-Eucentric"efter steglutning och tryck på start.Om funktionen förblev centrerad under inriktningen hoppar du över bildskiftkalibreringarna. Annars, gå till förberedelse"-fliken för kalibrering av bildskift välj Kalibrera bildskift"och tryck på start. Detta justerar lägre förstoringar till funktionen centrerad vid exponeringsförstoring.För tomografiuppsättning, starta en ny session i Session Setup"för biologiska prover. Välj Platta som "som provtyp och välj Batch" och Låg dos"Välj sedan utdataformat och lagring"mapp. Alternativt kan du lägga till en e-postmottagare och trycka på Apply"För att ställa in mål, Gå till atlaspilen, hitta en region av intresse och flytta genom att välja de alternativ som dyker upp med ett högerklick.Ta en översiktsbild för att bekräfta en bra position för eucentrisk höjdjustering. Tryck sedan på autoeucentrisk "för att köra den eucentriska lutningsrutinen efter steg, skaffa en ny översiktsbild för att uppdatera den eucentriska höjden. Inspektera den fyrkantiga översikten eller den förvärvade sökkartan.Flytta till en region av intresse och tryck på hämta sökning. Inspektera sedan sökbilden om intresseområdet inte är centrerat, högerklicka på önskad position och upprepa Flytta steg här"och skaffa bild. Justera fokus- och spårningsområdena.Vänsterklicka för att dra spårnings- och fokusområdena. När alla parametrar är inställda trycker du på Lägg till position"För att utföra automatiska funktioner, kontrollera inställningarna för att utföra justeringarna via fliken Autofunktioner" genom att navigera i atlasen till ett kolområde. Ta det området till eucentrisk höjd och följ ordningen på inriktningarna som beskrivs i textmanuskriptet.Starta sedan det automatiska förvärvet av tomografifliken. Välj Data Acquisition "platta ut och ställ in önskade parametrar. Ställ in datainsamlingsparametrar: lutningssteg, maximal positiv vinkel, maximal negativ vinkel, spårningsschema.Välj sedan Stäng kolumnventiler"för det eucentriska höjdschemat. Börja med att förbereda indatafiler och kataloger. Upprätta en projektmapp under mappen Projekt".Gör en annan ny mapp fasta stackar och förbered inmatningsfilerna. Tilt-serien en fast tilt-serie 1. XF och tilt-serien 1.tlt.För att beräkna defokus, uppdatera parameterfilen med mikroskopet och bildparametrarna. Kopiera en parameterfil till projektmappen. Ändra namnet till param_CTF.M och kör det angivna kommandot. Kontrollera sedan CTF-uppskattningsresultaten. För varje stapel, kontrollera de justerade staplarna med 3D-mod och se till att de fiduciala pärlorna raderas korrekt.Se till att handenheten är korrekt genom att köra det angivna kommandot. Kontrollera sedan oskärpans värde och se till att det matchar den teoretiska CTF-uppskattningen. Om du vill definiera underregionerna genererar du ett böjtomogram.Kör det angivna kommandot i projektmappen. Bestäm gränserna genom att välja sex punkter Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin och Zmax, för att skapa en underregion under mappen bin10, kör det angivna kommandot. Kör sedan partikelplockning för varje underregion.För apoferritindatauppsättningen utför du en mallsökning på bin sex. Ändra mallens understrykningsvinkel. Sök parametrar för att bestämma vinkel, intervall och intervall för sökning i plan eller utanför plan i grader.I projektmappen kör du det angivna kommandot. Ta bort de felaktiga partiklarna med 3D-mod under mappen. Convmap_wedge_Type2_bin6. Kör det angivna kommandot.Initiera sedan projektet. I projektmappen kör du det angivna kommandot för att skapa en databas för EM-tydlighet, AppoF.mat. Utför tomogramrekonstruktion före sub tomo-medelvärde och justering för att generera CTF-korrigerade subregiontomogram vid bin4, kör det angivna kommandot.Därefter, för att utföra sub tomo medelvärde och inriktning, utför medelvärdet med hjälp av CTF-korrigerade undertelegram som börjar vid bin4. Kör det angivna kommandot i projektmappen. Fortsätt att göra justeringar och kör kommandot.Rengör de överlappande partiklarna genom att köra det angivna kommandot. Utför slutlig rekonstruktion genom att kombinera de två halva datauppsättningarna. I projektmappen kör du de angivna kommandona.Översikt över tomografiarbetsflödet för cellulär och molekylär tomografi visas här för cellulära och lamellprover, datainsamlingsstrategin beror till stor del på provet och målet med bildstudien. Insamlingsparametrar för flera kryo ET-studier visas här. Representativa tomogram av molekylära prover såsom apoferritin, tunna cellulära processer och fokuserad jonstrålefräst lamell i det tjocka cellulära provet visas här.Högupplöst strukturell analys kan hjälpa till att avslöja bindningsställen för läkemedelsmål och tomografi och sub-tomogral medelvärde har också hjälpt vaccinutveckling mot SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Biology

Seawater Sampling and Collection

Havsvatten Provtagning och insamling

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektronmikroskopi Provberedning genom en fokuserad jonstråle

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Göra och inte göra av Cryo-elektronmikroskopi: en primer på Provberedning och High Quality Data Collection för Macro 3D återuppbyggnad

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Insamling och identifiering av pollen från honungsbikolonier

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron mikroskopiska rutnät förberedelse för tidsuppgjorda studier med hjälp av ett nytt robotsystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Cryo-strukturerad belysning mikroskopisk datainsamling från kryogeniskt bevarade celler

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Konstruktion av en realistisk, helkropp, tredimensionell hästskelettmodell med hjälp av datortomografidata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier för optimering av kryogen elektrontomografi dataförvärv

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Provberedning genom 3D-korrelativ fokuserad jonstrålefräsning för högupplöst kryoelektrontomografi

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...