Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

نشكر الدكتور أولو أجيجولا (مركز عدم انتظام ضربات القلب بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس) على دعم الخبراء للتجارب في الجسم الحي . تم دعم هذا العمل من قبل NIH U01 EB025138 (JLA ، CS).

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أبحاث الحيوانات بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية التي حددها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (الطبعة 8th ، 2011). تم استخدام خنازير يوركشاير الذكور البالغة التي يبلغ وزنها حوالي 75 كجم...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول تصنيع واختبار مسبار مناعي سعوي (مسبار CI) قادر على اكتشاف وقياس المؤشرات الحيوية ذات الأهمية في كل من المختبر والجسم الحي . يتم تحقيق الكشف عن طريق محاصرة العلامة الحيوية عند طرف القطب الكهربائي. يغير حدث الاصطياد التقاطع السعوي بين مسبار مناعي سعوي من الأسلاك ا...

تستخدم العديد من الطرق الكيميائية للكشف عن المؤشرات الحيوية وقياسها بشكل روتيني في كل من كيمياء البروتين والتشخيص السريري ، خاصة في تشخيص السرطان وتقييم تطور أمراض القلب والأوعية الدموية. حاليا، تعتمد طرق مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وقياس الطيف الكتلي على جمع العينات من حجرة الأوعية الدموية1،2،3 عن طريق سحب السوائل السائبة أو المقصورة الخلالية عن طريق غسيل الكلى المجهري. يستخدم غسيل الكلى المجهري أنبوب غشاء شبه نافذ بطول معروف يتم وضعه في منطقة ذات أهمية. يتم تمرير سائل التجميع عبر الأنبوب على مدى عدة دقائق4 لجمع العينة للتحليل5 ، مما يحد من الدقة الزمنية. وبهذه الطريقة، لا توفر العينات المجمعة سوى قيمة متوسطة مع مرور الوقت للبيئة الدقيقة المحلية وتكون محدودة بمعدل التروية وجمع حجم كاف من العينات. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الأساليب تجميع البيانات التجريبية ومتوسط الإشارات؛ لذلك ، قد يفشلون في حساب التباين بين الموضوعات. الأهم من ذلك ، أن الوقت بين جمع العينات والتحليل اللاحق دون اتصال بالإنترنت يمنع التدخل السريري الفوري والعلاجات.
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (CI probe) للكشف الكهربائي الذي يتم حله في الوقت المناسب عن ببتيدات نشطة بيولوجيا محددة. Neuropeptide Y (NPY) ، الذي تم إطلاقه من الخلايا العصبية الودية ما بعد العقدية التي تعصب الأوعية الدموية ، والشغاف ، والخلايا العضلية القلبية ، والعقد داخل القلب ، هو ناقل الببتيد العصبي الرئيسي في نظام القلب والأوعية الدموية6،7،8،9. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا لقياس NPY ، ويتم توضيح الجدوى التجريبية في نموذج قلب الخنزير. ومع ذلك ، ينطبق هذا النهج على أي ببتيد نشط بيولوجيا يتوفر له جسم مضاد انتقائي10. تعتمد هذه الطريقة على التقاطع السعوي بين مسبار سلك بلاتيني والسائل الموصل عند الطرف الوظيفي11,12. في هذا التطبيق ، تم التوسط في التفاعل من خلال جسم مضاد ضد neuropeptide المستهدف (NPY) ، والذي كان مرتبطا بطرف القطب الكهربائي ، وربط بيئة السائل الموصل. تم تحقيق هذا الأداء من خلال الترسيب الكهربائي لمادة البوليدوبامين التفاعلية على طرف مسبار الأسلاك البلاتينية10,13.
عندما يتم وضع المسبار الوظيفي للأجسام المضادة في منطقة ذات أهمية في الجسم الحي ، يؤدي إطلاق NPY الداخلي المستحضر إلى الارتباط بالأجسام المضادة المحاصرة على طرف المسبار ، ويتم إزاحة السائل الموصل على سطح القطب الكهربائي بواسطة بروتين NPY. يؤدي التغيير المحلي في البيئة الكهربائية إلى إزاحة سائل عالي الحركة وعازل كهربائي عالي مع جزيء غير متحرك ومشحون بشكل ثابت. هذا يغير واجهة القطب والسائل ، وبالتالي ، سعته ، والتي تقاس كتغيير في تيار الشحنة استجابة لجهد أمر وظيفة الخطوة. يتم استخدام جهد "إعادة ضبط" سلبي مباشرة بعد كل دورة قياس فردية لصد NPY المرتبط من الجسم المضاد من خلال التفاعل الكهروستاتيكي ، وبالتالي تطهير مواقع ربط الأجسام المضادة لجولات القياس اللاحقة10. هذا يسمح بشكل فعال لقياس NPY بطريقة يتم حلها في الوقت المناسب. تتغلب تقنية CI الفريدة من نوعها على قيود الطرق الكيميائية المناعية القائمة على غسيل الكلى المجهري الموضحة أعلاه لقياس مستويات المؤشرات الحيوية الديناميكية من تجربة واحدة دون تجميع البيانات أو الإشارة في المتوسط على مدى العديد من التجارب9 ، مما يوفر البيانات في الوقت الفعلي تقريبا. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تكييف هذه الطريقة مع أي مؤشر حيوي ذي أهمية يوجد له جسم مضاد مناسب على نطاق زمني محدد ومحدد الموقع يوفر تقدما تقنيا كبيرا في القياس الكيميائي المناعي لتقييم تطور المرض وتوجيه التدخلات العلاجية.
وكان البرنامج الحاسوبي للحصول على البيانات وتحليلها مكتوبا خصيصا في IGOR Pro (بيئة برمجية تفاعلية بالكامل). أصدر نظام محول تناظري إلى رقمي (A / D) جهدا قياديا تحت سيطرة الكمبيوتر وحصل على بيانات من مكبر صوت مخصص. يمتلك مكبر الصوت بعض الميزات الفريدة. وشملت هذه مقاومة التغذية المرتدة (قابلة للتبديل) لكل قناة من قنوات الاستحواذ الأربع ، مما يسمح باختيار 1 MOhm أو 10 دوائر مشبك الجهد التغذية المرتدة MOhm لدمج تباين القطب الكهربائي. كما تم بناء وحدة مرحلة ذات رأس واحد ودائرة أرضية / مرجعية متبادلة لجميع قنوات الاستحواذ الأربع لوضع الجهاز بالقرب من الصدر في وحدة مادية واحدة. تم استخدام إعداد مقاوم التغذية المرتدة 1 MOhm لجمع جميع البيانات المبلغ عنها.
تم تلغراف إعدادات المرشح والكسب من مكبر الصوت وتسجيلها داخل ملف البيانات. تمت تصفية البيانات عند 1 كيلو هرتز عبر مرشح بيسل تناظري ثنائي القطب رقمي عند 10 كيلو هرتز. الفرق في الجهد بين المسبار والحل الموصل المحيط يخلق طبقة سعوية هيلمهولتز عند طرف المسبار. يؤدي ربط الليغاند بالجسم المضاد عند طرف المسبار إلى تغيير الشحنة المحلية ، وبالتالي تغيير في سعة هيلمهولتز. يؤدي هذا التغيير في المكون السعوي للدائرة إلى تحول في حجم الشحنة المحقونة المطلوبة لجلب المسبار إلى الجهد المحتمل في بروتوكول الجهد ذي الوظيفة التدريجية. وبالتالي ، فإن ربط رباط معين بالمسبار الوظيفي يؤدي إلى تغيير في قياس سعة القطب الكهربائي كتغيير في ذروة التيار السعوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

إن القدرة على قياس المؤشرات الحيوية في الجسم الحي ذات الصلة بتقييم تطور المرض ذات أهمية كبيرة للأوساط العلمية والطبية. ويمكن أن يستغرق الحصول على استبانة النتائج التي يتم الحصول عليها من الطرق الحالية لقياس بعض المؤشرات الحيوية عدة أيام أو أسابيع، حيث يمكن أن تكون محدودة في الدقة مكانيا وزمنيا (على سبيل المثال، الغسيل المجهري لحجرة السوائل للسائل الخلالي الذي يتم تحليله بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم [ELISA]، أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء [HPLC]، أو قياس الطيف الكتلي)؛ وبالتالي ، فإن توجيههم للتشخيص والعلاج في الوقت المناسب يتعطل. في هذه الدراسة ، تم الإبلاغ عن تقنية فريدة للكشف عن أجهزة إرسال الببتيد وقياسها في الجسم الحي من خلال استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (مسبار CI). يتم وصف بروتوكول التصنيع والتوصيف في المختبر لهذه المجسات. يتم توفير قياسات لإطلاق neuropeptide Y (NPY) المستحضر للتحفيز الودي في الجسم الحي . يرتبط إصدار NPY بالإصدار الودي للنورادرينالين كمرجع. توضح البيانات نهجا للقياس السريع والموضعي للببتيدات العصبية في الجسم الحي. وتشمل التطبيقات المستقبلية التقييم في الوقت الحقيقي أثناء العملية الجراحية لتطور المرض والنشر القائم على القسطرة طفيفة التوغل لهذه المجسات.

تصنيع القطب الكهربائي وتوصيف تم تصنيع مسبار مناعي سعوي مرن (تحقيقات CI) ، وتظهر صورة تمثيلية في الشكل 1A. تم تعيين جهد القطب الكهربائي بواسطة دائرة مشبك الجهد التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر (الشكل 1B) ، وتم غمر القطب الكهربائي في محلول متعدد ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

تعتمد الطرق الكيميائية المناعية المعمول بها لقياس أجهزة إرسال الببتيد في الجسم الحي على غسيل الكلى المجهري أو سحب السوائل السائبة للحصول على العينة لتحليلها في وضع عدم الاتصال. ومع ذلك ، فإن هذه تعاني من قيود مكانية زمنية. يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق جهاز استشعار حيوي مناعي سعوي يتغلب على قيود التقنيات الحالية.

الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطوير طريقة لقياس مستويات جهاز إرسال الببتيد في الجسم الحي بعد حلها زمنيا. يمكننا قياس مستويات إرسال الببتيد في مواضيع فردية ومواقع منفصلة مع تحليل في الوقت الفعلي تقريبا. أولا ، قطع طول 25 سم من الأسلاك البلاتينية المطلية بالفلور ألكوكسي.ثم ، باستخدام مشرط ، قم بتجريد ما يقرب من خمسة ملليمترات من طلاء perfluoroalkoxy من طرف واحد ، مع الحرص على عدم قطع سلك البلاتين. الآن ، أدخل الطرف المجرد من السلك البلاتيني في دبوس موصل ذكر مطلي بالذهب ، مليمتر واحد. بعد ذلك ، باستخدام كماشة إبرة الأنف ، قم بتجعيد أسنان دبوس الموصل حول الطرف المجرد من السلك البلاتيني ولحام السلك البلاتيني بدبوس الموصل المطلي بالذهب.بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الدوبامين عن طريق إضافة 50 ملليغرام من هيدروكلوريد الدوبامين في 50 ملليلتر من PBS 10 ملليمول مع الرقم الهيدروجيني ستة واخلطه عن طريق التحريك. بعد إذابة الدوبامين تماما ، ضع طرف السلك البلاتيني في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين الطازج. قم بتوصيل قطب قرص كلوريد الفضة بالقناة الأرضية في مرحلة الرأس.ثم ، ضع قرص كلوريد الفضة في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين وسلك البلاتين. قبل المضي قدما ، قم بتوصيل تحويلة سلكية بالقنوات المرجعية لمرحلة الرأس. افتح برنامج الحصول على البيانات التفاعلي واضبط بروتوكول جهد أمر الترسيب الكهربائي لأسنان المنشار عن طريق تعيين جهد البدء عند ناقص 0.6 فولت ، وجهد النهاية إلى 0.65 فولت ، ومعدل المسح الضوئي عند 0.04 فولت في الثانية ، ومدة الترسيب إلى 420 ثانية.بعد الانتهاء من ترسيب الدوبامين ، قم بإزالة بيليه كلوريد الفضة المطحون وطرف سلك البلاتين من السفينة. ضع طرف السلك في أنبوب دقيق يحتوي على PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق وتأكد من أن طرف السلك لا يلامس جانبي أو أسفل الأنبوب الدقيق. ثم ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة عن طريق الجمع بين الجسم المضاد محل الاهتمام مع PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 بنسبة 1:20 في وعاء بحجم مناسب.بعد ذلك ، انقع الطرف المودع من القطب البلاتيني في محلول الأجسام المضادة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن تعليق طرف السلك البلاتيني في المحلول وعدم الاستلقاء على السطح الداخلي للأنبوب الدقيق. ضع الطرف الوظيفي للمحقق المناعي السعوي في غرفة التدفق ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف القطب بأي شكل من الأشكال ، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى تلف الطرف الحسي للمسبار. قبل الاختبار التجريبي الأول ، قم بإجراء تشغيل قياسي TBS لتهيئة مسبار المسبار المناعي السعوي ، وبالنسبة لبروتوكول الجهد ، اضبط إمكانات الخطوة الإيجابية على 110 مللي فولت ، وإمكانات الخطوة السلبية إلى ناقص خمسة مللي فولت ، ومدة الخطوة من 20 مللي ثانية ، ومدة الاكتساب إلى 600 ثانية.بعد ذلك ، قم بإنشاء محلول الببتيد المثير للاهتمام باستخدام نفس TBS للحفاظ على تكوين superfusate. قم بإعداد نظام متعدد حيث يمكن تبديل السوبرفوسات بين TBS و TBS المكمل بالببتيد. استخدم المعلمات القياسية TBS وقم بإعداد بروتوكول الحصول على بيانات استشعار الببتيد عن طريق تعيين مدة الاكتساب إلى 360 ثانية.قبل ترسب الدوبامين المتعدد ، قم بربط الطرف المكشوف لقطب السلك البلاتيني من خلال إبرة تحت الجلد قياس 22 ، تاركا ما يقرب من مليمترين وراء طرف الإبرة. استخدم الملقط وثني طرف قطب السلك البلاتيني برفق لإنشاء شريط لاذع يتدلى من نهاية الإبرة تحت الجلد. اسحب الإبرة بلطف من الطرف الشائك ، تاركا ما يكفي من الأسلاك لوضعها في الوعاء دون أن تلامس الإبرة السائل والمضي قدما في ترسب الدوبامين كما هو موضح سابقا.الآن ، شطف طرف المسبار الشائك باستخدام PBS وضعه في محلول الأجسام المضادة. ثم قم بإزالة الطرف الوظيفي بلطف من PBS. حرك الإبرة تحت الجلد إلى المسبار المناعي السعوي الشائك وازرعها بلطف في المنطقة ذات الأهمية قبل توصيل دبوس الموصل الذهبي بمرحلة الرأس.بمجرد زرعها ، اسحب الإبرة تحت الجلد ، تاركا القطب الكهربائي في مكانه. تقيس الخطوة الإيجابية في جهد القيادة تيار الحقن المطلوب لتثبيت جهد المسبار وتسمح بقياس التيار السعوي. تقوم خطوة جهد الأمر السلبي بإزالة الببتيد المرتبط من الجسم المضاد عن طريق التنافر الكهروستاتيكي.يصور الشكل الموجي لأمر وظيفة الخطوة الكشف التكراري الذي تم حله بمرور الوقت وتحديد كمية الببتيد. يمثل التتبع السفلي إمكانات القيادة والتيار الناتج تحت الانصهار الفائق للمسبار في TBS. أظهر المسبار المناعي السعوي المتوازن اضمحلالا أوليا أصغر وخط أساس مستقر على مدى ست دقائق.أدى تدفق neuropeptide Y إلى غرفة التدفق إلى زيادة التيارات السعوية فوق خط الأساس. أظهرت تيارات المسبار المناعي السعوي التي تم قياسها باستخدام مسبار وظيفي للأجسام المضادة neuropeptide Y إشارة تعتمد على التركيز حساسة ل neuropeptide منخفض البيكومول Y للمعايرة ، تم قياس منحنى قياسي لجميع التركيزات المختبرة. أظهر تحفيز العقدة النجمية الثنائية ارتفاع neuropeptide Y عند التخطيط المشترك مع التيارات السعوية للتحكم السلبي.أظهر إطلاق النورادرينالين الذي تم قياسه تحت التحفيز النجمي إطلاقا متزامنا مع neuropeptide Y ، بما يتفق مع استجابة متعاطفة مستحثة. قد يوفر تطوير هذه التقنيات قراءات أثناء الجراحة للمعدلات الرئيسية لنشاط القلب ، وبالتالي توفير إرشادات علاجية أو تدخلية سريعة محتملة. التقنية كما هو موضح هنا محددة لنشر القلب والأوعية الدموية ، ومع ذلك ، فإن التقنية نفسها مناسبة للإعدادات الفسيولوجية الأخرى ، مثل البول والعضلات الهيكلية والكلى والأنسجة الدهنية وما إلى ذلك.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric رسم الخرائط البصرية للقلب الأرنب Langendorff - perfused

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics لتخليق المواد الكيميائية والدراسات الميكنة الوقت لحلها

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

جامدة التضمين من الثابتة والملون، إجمالاً، مقياس الملليمتر العينات 3D خالية من قسم علم الأنسجة بالتصوير المقطعي الصغيرة المحسوبة

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...