Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Vi takker Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) for ekspertstøtte til in vivo-eksperimenterne . Dette arbejde blev støttet af NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of California, Los Angeles Animal Research Committee og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health Guide for care and use of laboratory animals (8. udgave, 2011). Voksne Yorkshire-hansvin på ca. 75 kg blev anvendt til in vivo-undersøgelse 10.
1. Kapacitiv immunoprobe fabrikation og funktionalisering
<ol><li>Skær en 25 cm længde perfluoralkoxy (PFA) -belagt...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Denne protokol beskriver fremstilling og testning af en kapacitiv immunoprobe (CI-sonde), der er i stand til at detektere og måle biomarkører af interesse i både in vitro- og in vivo-indstillinger . Detektion opnås ved at fange biomarkøren ved elektrodespidsen. Fangsthændelsen ændrer det kapacitive kryds mellem en platintrådkapacitiv immunoprobe og det omgivende ledende væskemiljø målt som en ændring i ladningsstrømmen som reaktion på et potentielt skift i sonden. En unik elektrisk erhverv...

Flere kemiske metoder til påvisning og kvantificering af biomarkører anvendes rutinemæssigt i både proteinkemi og klinisk diagnostik, især i kræftdiagnoser og vurdering af hjerte-kar-sygdomsprogression. I øjeblikket er metoder såsom højtydende væskekromatografi (HPLC), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og massespektrometri afhængige af prøveindsamling fra vaskulærrummet 1,2,3 ved bulkvæskeudtrækning eller det interstitielle rum ved mikrodialyse. Mikrodialyse anvender et semipermeabelt membranrør af kendt længde, der er placeret i et område af interesse. Opsamlingsvæske perfunderes gennem røret over flere minutter4 for at indsamle prøven til analyse5, hvilket begrænser den tidsmæssige opløsning. På denne måde giver de indsamlede prøver kun en gennemsnitlig værdi over tid af det lokale mikromiljø og er begrænset af perfusionshastigheden og indsamlingen af tilstrækkelig prøvevolumen. Desuden kræver disse metoder pooling af eksperimentelle data og signalgennemsnit; derfor kan de undlade at tage højde for variabilitet mellem emner. Det er vigtigt, at tiden mellem prøveindsamling og efterfølgende offline analyse udelukker øjeblikkelig klinisk intervention og terapi.
I den nuværende protokol er brugen af en kapacitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde) til den tidsopløste elektriske detektion af specifikke bioaktive peptider skitseret. Neuropeptid Y (NPY), frigivet fra post-ganglione sympatiske neuroner, der innerverer vaskulaturen, endokardiet, kardiomyocytter og intrakardiale ganglier, er en vigtig neuromodulerende peptidsender i det kardiovaskulære system 6,7,8,9. Metoden, der præsenteres her, er designet til at måle NPY, og den eksperimentelle gennemførlighed demonstreres i en svinehjertemodel. Denne fremgangsmåde gælder imidlertid for ethvert bioaktivt peptid, for hvilket et selektivt antistof er tilgængeligt10. Denne metode er afhængig af det kapacitive kryds mellem en platintrådssonde og den ledende væske ved den funktionaliserede spids11,12. I denne applikation blev interaktionen medieret gennem et antistof mod målneuropeptidet (NPY), som var bundet til elektrodespidsen, der grænseflade det ledende væskemiljø. Denne funktionalisering blev opnået gennem elektrodeposition af reaktiv polydopamin på spidsen af platintrådssonden 10,13.
Når den antistoffunktionaliserede sonde placeres i et område af interesse in vivo, fører fremkaldt endogen NPY-frigivelse til binding til fangstantistofferne på sondespidsen, og den ledende væske ved elektrodeoverfladen fortrænges af NPY-proteinet. Lokal ændring i det elektriske miljø resulterer i forskydning af højmobilitet, højdielektrisk væske med et immobilt, statisk ladet molekyle. Dette ændrer elektrode-væske-grænsefladen og dermed dens kapacitans, som måles som en ændring i ladningsstrøm som reaktion på et trinfunktionskommandopotentiale. Et negativt "nulstillingspotentiale" anvendes umiddelbart efter hver enkelt målecyklus til at afvise bundet NPY fra antistoffet gennem elektrostatisk interaktion og dermed rydde antistofbindingsstederne for efterfølgende runder af måling10. Dette giver effektivt mulighed for måling af NPY på en tidsbestemt måde. Den unikke CI-teknik overvinder begrænsningerne ved de mikrodialysebaserede immunokemiske metoder, der er skitseret ovenfor, til at måle dynamiske biomarkørniveauer fra et enkelt eksperiment uden datapooling eller signalgennemsnit over flere eksperimenter9, hvilket giver data i næsten realtid. Desuden giver evnen til at tilpasse denne metode til enhver biomarkør af interesse, for hvilken der findes et passende antistof på en tidsopløst og lokaliseret skala, et stort teknisk fremskridt inden for immunokemisk måling til evaluering af sygdomsprogression og vejledning af terapeutiske interventioner.
Softwaren til dataindsamling og analyse blev specialskrevet i IGOR Pro (et fuldt interaktivt softwaremiljø). Et analogt til digitalt konvertersystem (A / D) udstedte en kommandospænding under computerstyring og hentede data fra en brugerdefineret forstærker. Forstærkeren havde visse unikke funktioner. Disse omfattede en feedbackmodstand (omskiftelig) for hver af de fire opsamlingskanaler, hvilket giver mulighed for at vælge 1 MOhm eller 10 MOhm feedback spændingsklemme kredsløb for at integrere elektrodens variabilitet. En sceneenhed med et enkelt hoved og gensidig jord / referencekredsløb til alle de fire erhvervelseskanaler blev også bygget til at placere enheden tæt ved brystet i et enkelt fysisk modul. En 1 MOhm feedback modstand indstilling blev brugt til at indsamle alle de rapporterede data.
Filter- og forstærkningsindstillingerne blev telegraferet fra forstærkeren og optaget i datafilen. Data blev filtreret ved 1 kHz via et 2-polet analogt Bessel-filter digitaliseret ved 10 kHz. Forskellen i potentiale mellem sonden og den omgivende ledende opløsning skaber et Helmholtz kapacitivt lag ved sondespidsen. Ligandbinding til antistoffet ved sondespidsen resulterer i en ændret lokal ladning og dermed en ændring i Helmholtz-kapacitansen. Denne ændring i kredsløbets kapacitive komponent resulterer i et skift i størrelsen af den injicerede ladning, der kræves for at bringe sonden til potentialet i trinfunktionsspændingsprotokollen. Bindingen af en specifik ligand til den funktionaliserede sonde resulterer således i en ændring i elektrodekapacitansmålingen som en ændring i spidskapacitiv strøm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

Evnen til at måle biomarkører in vivo , der er relevante for vurderingen af sygdomsprogression, er af stor interesse for de videnskabelige og medicinske samfund. Opløsningen af resultater opnået fra nuværende metoder til måling af visse biomarkører kan tage flere dage eller uger at opnå, da de kan være begrænset i opløsning både rumligt og tidsmæssigt (f.eks. Væskerumsmikrodialyse af interstitiel væske analyseret ved enzymbundet immunosorbentassay [ELISA], højtydende væskekromatografi [HPLC] eller massespektrometri); således forstyrres deres vejledning om rettidig diagnose og behandling. I denne undersøgelse rapporteres en unik teknik til påvisning og måling af peptidtransmittere in vivo ved anvendelse af en kapacitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde). Fremstillingsprotokollen og in vitro-karakteriseringen af disse sonder er beskrevet. Målinger af sympatisk stimulering-fremkaldt neuropeptid Y (NPY) frigivelse in vivo er tilvejebragt. NPY-frigivelse er korreleret med den sympatiske frigivelse af noradrenalin til reference. Dataene viser en tilgang til hurtig og lokaliseret måling af neuropeptider in vivo. Fremtidige anvendelser omfatter intraoperativ realtidsvurdering af sygdomsprogression og minimalt invasiv kateterbaseret implementering af disse sonder.

Elektrodefabrikation og karakterisering En fleksibel kapacitiv immunoprobe (CI-sonder) blev fremstillet, og et repræsentativt billede er afbildet i figur 1A. Elektrodepotentialet blev indstillet af et computerstyret spændingsklemekredsløb (figur 1B), og elektroden blev nedsænket i en polydopaminopløsning fremstillet i PBS. Polydopamin blev elektrodepositeret på den ledende elektrodespids13 til funktionalisering. ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Etablerede immunokemiske metoder til måling af peptidtransmittere in vivo er afhængige af mikrodialyse eller bulkvæskeudtrækning for at opnå prøven til offline analyse. Disse lider dog af spatiotemporale begrænsninger. Den nuværende protokol beskriver fremstilling og anvendelse af en kapacitiv immunoprobe biosensor, der overvinder begrænsningerne i de eksisterende teknikker.

Tidsopløst In Vivo-måling af neuropeptiddynamik ved kapacitiv immunoprobe i svinehjerte

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Det er første gang, der er udviklet en metode til tidsopløst måling af peptidtransmitterniveauer in vivo. Vi kan måle peptidtransmitterniveauer i enkeltpersoner og diskrete steder med næsten realtidsanalyse. Skær først en 25 centimeter længde perfluoralkoxy-belagt platintråd.Derefter skalbes ca. fem millimeter perfluoralkoxybelægning fra den ene ende ved hjælp af en skalpel, og pas på ikke at skære i platintråden. Indsæt nu den strippede ende af platintråden i en forgyldt, en millimeter hanstikstift. Brug derefter nåletang til at krympe stikstifttænderne rundt om den afstribede ende af platintråden og lod platintråden til den forgyldte stikstift.Forbered derefter dopaminopløsningen ved at tilsætte 50 milligram dopaminhydrochlorid i 50 ml 10-millimolar PBS med pH-seks og blandes under omrøring. Efter fuldstændig opløsning af dopamin placeres spidsen af platintråden i beholderen indeholdende den frisklavede dopamin-supplerede PBS. Tilslut sølvchloridskiveelektroden til jordkanalen i hovedtrinnet.Placer derefter sølvchloridskiven i beholderen indeholdende dopamin-suppleret PBS og platintråd. Før du går videre, skal du tilslutte en trådshunt til referencekanalerne på hovedtrinnet. Åbn den interaktive dataindsamlingssoftware, og indstil en elektroaflejringskommandoprotokol med savtand ved at indstille Startpotentialet til minus 0,6 volt, Slutpotentialet til 0,65 volt, Scanningshastigheden til 0,04 volt pr. Sekund og Varigheden af aflejring til 420 sekunder.Efter afslutning af poly-dopaminaflejringen fjernes sølvchloridpellet og spidsen af platintråden fra beholderen. Trådspidsen anbringes i et mikrorør, der indeholder PBS på 7,4 pH i to til fem minutter, og det skal sikres, at trådspidsen ikke kommer i kontakt med mikrorørets sider eller bund. Derefter fremstilles antistofopløsningen ved at kombinere antistoffet af interesse med PBS på pH 7,4 i forholdet 1:20 i en beholder af passende størrelse.Blød derefter den poly-dopaminaflejrede spids af platinelektroden i antistofopløsning i to timer ved stuetemperatur, hvilket sikrer, at platintrådspidsen suspenderes i opløsning og ikke hviler på mikrorørets indre overflade. Placer den funktionelle spids af den kapacitive immunoprobe i strømningskammeret, og pas på ikke at forstyrre elektrodens spids på nogen måde, da dette kan beskadige sondens sensoriske spids. Før den første eksperimentelle test skal du udføre en TBS-standardkørsel for at konditionere den kapacitive immunoprobe-sonde, og for spændingsprotokollen indstilles det positive trinpotentiale til 110 millivolt, negativt trinpotentiale til minus fem millivolt, trinvarighed på 20 millisekunder og varighed af erhvervelse til 600 sekunder.Opret derefter peptidopløsningen af interesse ved hjælp af den samme TBS for at opretholde superfusatets sammensætning. Opsæt et manifoldsystem, hvor superfusatet kan skiftes mellem TBS og peptid-suppleret TBS. Brug TBS-standardparametre og opsæt peptidfølingsdataopsamlingsprotokollen ved at indstille varigheden af erhvervelsen til 360 sekunder.Før poly-dopaminaflejringen skal du trække den udsatte spids af platintrådelektroden gennem en 22-gauge hypodermisk nål og efterlade ca. to millimeter ud over nålens spids. Brug pincet og bøj forsigtigt spidsen af platintrådelektroden for at skabe en modhage, der hænger fra enden af den hypodermiske nål. Træk forsigtigt nålen ud af pigspidsen, efterlad nok ledning til at placere i beholderen uden at nålen kommer i kontakt med væsken og fortsæt med dopaminaflejring som tidligere demonstreret.Skyl nu pigtrådens sondespids med PBS og anbring den i antistofopløsningen. Fjern derefter forsigtigt den funktionaliserede spids fra PBS. Flyt den hypodermiske nål til den piggede kapacitive immunoprobe, og implanter den forsigtigt i interesseområdet, inden du sætter guldstikstiften i hovedtrinnet.Når den er implanteret, skal du trække den hypodermiske nål tilbage og lade elektroden være på plads. Et positivt trin i kommandopotentialet måler den injektionsstrøm, der kræves for at klemme sondespændingen og tillader måling af kapacitivstrømmen. Det negative kommandopotentialetrin rydder det bundne peptid fra antistoffet via elektrostatisk frastødning.Trinfunktionskommandobølgeformen skildrede den tidsopløste iterative detektion og kvantificering af peptidet. Det nederste spor repræsenterede kommandopotentialet og den resulterende strøm under sondens superfusion i TBS. Den ækvilibrerede kapacitive immunoprobe viste mindre indledende henfald og en stabil baseline over seks minutter.Strømmen af neuropeptid Y ind i strømningskammeret øgede de kapacitive strømme over baseline. Kapacitive immunoprobestrømme målt med en neuropeptid Y antistoffunktionaliseret sonde viste et koncentrationsafhængigt signal, der var følsomt over for lavt picomole neuropeptid Y Til kalibrering blev der målt en standardkurve for alle testede koncentrationer. Stimuleringen af den bilaterale stellatganglion viste forhøjet neuropeptid Y, når den blev plottet sammen med de negative kontrolkapacitive strømme.Noradrenalinfrigivelse målt under stellatstimulering viste en synkron frigivelse med neuropeptid Y, i overensstemmelse med en fremkaldt sympatisk respons. Udviklingen af disse teknikker kan tilvejebringe intraoperative aflæsninger af nøglemodulatorer af hjerteaktivitet og dermed give potentiel hurtig terapeutisk eller interventionel vejledning. Teknikken som præsenteret her er specifik for kardiovaskulær implementering, men selve teknikken er velegnet til andre fysiologiske indstillinger, såsom urin, skeletmuskulatur, nyrer, fedtvæv osv.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylære Komplekser af negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedure for Decellularization af porcin Heart ved retrograd Coronarperfusionstrykket

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics til kemisk syntese og tidsopløste mekanistiske undersøgelser

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Stive indlejring af faste og plettet, hele, Millimeter-skala prøver for sektion-gratis 3D histologi ved mikro-beregnet tomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...