Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Nous remercions le Dr Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) pour son soutien expert pour les expériences in vivo . Ce travail a été soutenu par NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de recherche animale de l’Université de Californie à Los Angeles et réalisées conformément aux directives établies par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e édition, 2011). Des porcs mâles adultes du Yorkshire d’environ 75 kg ont été utilisés pour des études in vivo 10.
1. Fabrication et fonctionnalisation de l’imm...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Le présent protocole décrit la fabrication et l’essai d’une immunosonde capacitive (sonde IC) capable de détecter et de mesurer des biomarqueurs d’intérêt in vitro et in vivo . La détection est réalisée en piégeant le biomarqueur à l’extrémité de l’électrode. L’événement de piégeage modifie la jonction capacitive entre une immunosonde capacitive à fil de platine et l’environnement de fluide conducteur environnant, mesurée comme un changement de courant de charge en répon...

Plusieurs méthodes chimiques de détection et de quantification des biomarqueurs sont couramment utilisées dans la chimie des protéines et le diagnostic clinique, en particulier dans les diagnostics de cancer et l’évaluation de la progression des maladies cardiovasculaires. Actuellement, des méthodes telles que la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et la spectrométrie de masse reposent sur la collecte d’échantillons dans le compartiment vasculaire 1,2,3 par prélèvement de fluide en vrac ou dans le compartiment interstitiel par microdialyse. La microdialyse utilise un tube membranaire semi-perméable de longueur connue qui est placé dans une région d’intérêt. Le liquide de prélèvement est perfusé à travers le tube pendant plusieurs minutes4 pour prélever l’échantillon pour l’analyse5, limitant ainsi la résolution temporelle. De cette manière, les échantillons prélevés ne fournissent qu’une valeur moyenne dans le temps du microenvironnement local et sont limités par le taux de perfusion et la collecte d’un volume d’échantillon suffisant. De plus, ces méthodes nécessitent la mise en commun des données expérimentales et la moyenne des signaux; par conséquent, ils peuvent ne pas tenir compte de la variabilité entre les sujets. Il est important de noter que le temps écoulé entre le prélèvement de l’échantillon et l’analyse hors ligne ultérieure empêche une intervention clinique et thérapeutique immédiate.
Dans le présent protocole, l’utilisation d’un biocapteur capacitif d’immunosonde (sonde CI) pour la détection électrique résolue dans le temps de peptides bioactifs spécifiques est décrite. Le neuropeptide Y (NPY), libéré par les neurones sympathiques post-ganglionnaires qui innervent le système vasculaire, l’endocarde, les cardiomyocytes et les ganglions intracardiaques, est un transmetteur peptidique neuromodulateur majeur dans le système cardiovasculaire 6,7,8,9. La méthode présentée ici est conçue pour mesurer le NPY, et la faisabilité expérimentale est démontrée dans un modèle de cœur porcin. Cependant, cette approche s’applique à tout peptide bioactif pour lequel un anticorps sélectif est disponible10. Cette méthode repose sur la jonction capacitive entre une sonde en fil de platine et le fluide conducteur à la pointe fonctionnalisée11,12. Dans cette application, l’interaction a été médiée par un anticorps contre le neuropeptide cible (NPY), qui était lié à la pointe de l’électrode, interfaçant l’environnement fluide conducteur. Cette fonctionnalisation a été obtenue par électrodéposition de polydopamine réactive sur la pointe de la sonde de fil de platine10,13.
Lorsque la sonde fonctionnalisée par anticorps est placée in vivo dans une région d’intérêt, la libération endogène évoquée de NPY conduit à la liaison aux anticorps de piégeage sur la pointe de la sonde, et le fluide conducteur à la surface de l’électrode est déplacé par la protéine NPY. L’altération locale de l’environnement électrique entraîne le déplacement d’un fluide à haute mobilité et à haute diélectrique avec une molécule immobile chargée statiquement. Cela modifie l’interface électrode-fluide et, par conséquent, sa capacité, qui est mesurée comme un changement de courant de charge en réponse à un potentiel de commande de fonction pas à pas. Un potentiel de « réinitialisation » négatif est utilisé immédiatement après chaque cycle de mesure individuel pour repousser le NPY lié de l’anticorps par interaction électrostatique, éliminant ainsi les sites de liaison des anticorps pour les cycles de mesure suivants10. Cela permet effectivement de mesurer le NPY d’une manière résolue dans le temps. La technique unique d’IC surmonte les limites des méthodes immunochimiques basées sur la microdialyse décrites ci-dessus pour mesurer les niveaux de biomarqueurs dynamiques à partir d’une seule expérience sans mise en commun des données ni moyenne des signaux sur plusieurs expériences9, fournissant des données en temps quasi réel. De plus, la capacité d’adapter cette méthode à tout biomarqueur d’intérêt pour lequel il existe un anticorps approprié à une échelle localisée et résolue dans le temps fournit une avancée technique majeure dans la mesure immunochimique pour l’évaluation de la progression de la maladie et l’orientation des interventions thérapeutiques.
Le logiciel d’acquisition et d’analyse de données a été écrit sur mesure dans IGOR Pro (un environnement logiciel entièrement interactif). Un système de convertisseur analogique-numérique (A/N) émettait une tension de commande sous contrôle informatique et acquérait des données à partir d’un amplificateur personnalisé. L’amplificateur possédait certaines caractéristiques uniques. Ceux-ci comprenaient une résistance de rétroaction (commutable) pour chacun des quatre canaux d’acquisition, permettant de choisir des circuits de serrage de tension de rétroaction de 1 MOhm ou 10 MOhm pour intégrer la variabilité de l’électrode. Une unité de scène avec une seule tête et un circuit de terre / référence mutuel pour les quatre canaux d’acquisition a également été construite pour placer l’appareil près de la poitrine dans un seul module physique. Un réglage de résistance de rétroaction de 1 MOhm a été utilisé pour collecter toutes les données rapportées.
Les paramètres de filtre et de gain ont été télégraphiés à partir de l’amplificateur et enregistrés dans le fichier de données. Les données ont été filtrées à 1 kHz via un filtre Bessel analogique à 2 pôles numérisé à 10 kHz. La différence de potentiel entre la sonde et la solution conductrice environnante crée une couche capacitive de Helmholtz à l’extrémité de la sonde. La liaison du ligand à l’anticorps à l’extrémité de la sonde entraîne une altération de la charge locale et, par conséquent, une modification de la capacité de Helmholtz. Cette modification de la composante capacitive du circuit entraîne un changement dans l’amplitude de la charge injectée nécessaire pour amener la sonde au potentiel du protocole de tension à fonction pas à pas. Ainsi, la liaison d’un ligand spécifique à la sonde fonctionnalisée entraîne une altération de la mesure de la capacité de l’électrode sous la forme d’un changement du courant capacitif de crête.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

La capacité de mesurer in vivo des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation de la progression de la maladie est d’un grand intérêt pour les communautés scientifiques et médicales. La résolution des résultats obtenus à partir des méthodes actuelles de mesure de certains biomarqueurs peut prendre plusieurs jours ou semaines, car leur résolution peut être limitée à la fois spatialement et temporellement (p. ex., microdialyse du compartiment fluide du liquide interstitiel analysée par dosage immuno-enzymatique [ELISA], chromatographie liquide à haute performance [CLHP] ou spectrométrie de masse); ainsi, leur orientation du diagnostic et du traitement en temps opportun est perturbée. Dans la présente étude, une technique unique de détection et de mesure des transmetteurs peptidiques in vivo grâce à l’utilisation d’un biocapteur capacitif d’immunosonde (sonde CI) est rapportée. Le protocole de fabrication et la caractérisation in vitro de ces sondes sont décrits. Des mesures de la libération in vivo de neuropeptide Y évoqué par stimulation sympathique (NPY) sont fournies. La libération de NPY est corrélée à la libération sympathique de noradrénaline à titre de référence. Les données démontrent une approche pour la mesure rapide et localisée des neuropeptides in vivo. Les applications futures comprennent l’évaluation peropératoire en temps réel de la progression de la maladie et le déploiement mini-invasif de ces sondes par cathéter.

Fabrication et caractérisation d’électrodes Une immunosonde capacitive flexible (sondes CI) a été fabriquée et une image représentative est représentée à la figure 1A. Le potentiel de l’électrode a été défini par un circuit de serrage de tension contrôlé par ordinateur (Figure 1B), et l’électrode a été immergée dans une solution de polydopamine fabriquée dans du PBS. La polydopamine a été électrodéposée sur la p...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Les méthodes immunochimiques établies pour mesurer les transmetteurs peptidiques in vivo reposent sur la microdialyse ou le prélèvement de fluide en vrac pour obtenir l’échantillon en vue d’une analyse hors ligne. Cependant, ceux-ci souffrent de limitations spatio-temporelles. Le présent protocole décrit la fabrication et l’application d’un biocapteur capacitif immunoprobe qui surmonte les limites des techniques existantes.

Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

C’est la première fois qu’une méthode est développée pour la mesure résolue dans le temps des niveaux de transmetteurs peptidiques in vivo. Nous pouvons mesurer les niveaux de transmetteurs peptidiques chez des sujets individuels et des emplacements discrets avec une analyse en temps quasi réel. Tout d’abord, coupez une longueur de 25 centimètres de fil de platine recouvert de perfluoroalkyxie.Ensuite, à l’aide d’un scalpel, dénudez environ cinq millimètres de revêtement perfluoroalcoxy d’une extrémité, en prenant soin de ne pas couper dans le fil de platine. Maintenant, insérez l’extrémité dénudée du fil de platine dans une broche de connecteur mâle plaquée or d’un millimètre. Ensuite, à l’aide d’une pince à aiguille, sertissez les dents de la broche du connecteur autour de l’extrémité dénudée du fil de platine et soudez le fil de platine à la broche de connecteur plaquée or.Ensuite, préparez la solution de dopamine en ajoutant 50 milligrammes de chlorhydrate de dopamine dans 50 millilitres de PBS de 10 millimolaires avec un pH de six et mélangez en remuant. Après avoir complètement dissous la dopamine, placez l’extrémité du fil de platine dans le récipient contenant le PBS supplémenté en dopamine fraîchement fabriqué. Connectez l’électrode du disque de chlorure d’argent au canal de terre dans l’étage de tête.Ensuite, placez le disque de chlorure d’argent dans le récipient contenant du PBS supplémenté en dopamine et du fil de platine. Avant de continuer, connectez un shunt de fil aux canaux de référence de l’étage de tête. Ouvrez le logiciel interactif d’acquisition de données et définissez un protocole de potentiel de commande d’électrodéposition en dents de scie en réglant le potentiel de démarrage à moins 0,6 volt, le potentiel de fin à 0,65 volt, le taux de balayage à 0,04 volt par seconde et la durée de dépôt à 420 secondes.Après avoir terminé le dépôt de poly-dopamine, retirez la pastille de chlorure d’argent moulue et l’extrémité du fil de platine du récipient. Placez l’embout du fil dans un microtube contenant du PBS de pH 7,4 pendant deux à cinq minutes et assurez-vous que l’embout du fil n’entre pas en contact avec les côtés ou le fond du microtube. Ensuite, préparez la solution d’anticorps en combinant l’anticorps d’intérêt avec le PBS de pH 7,4 dans un rapport de 1:20 dans un récipient de taille appropriée.Ensuite, faites tremper la pointe déposée en poly-dopamine de l’électrode de platine dans une solution d’anticorps pendant deux heures à température ambiante, en veillant à ce que la pointe du fil de platine soit suspendue en solution et ne repose pas sur la surface intérieure du microtube. Placez la pointe fonctionnelle de l’immunosonde capacitive dans la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas perturber la pointe de l’électrode de quelque manière que ce soit, car cela pourrait endommager la pointe sensorielle de la sonde. Avant le premier test expérimental, effectuez une exécution standard TBS pour conditionner la sonde immunosonde capacitive et, pour le protocole de tension, réglez le potentiel de pas positif à 110 millivolts, le potentiel de pas négatif à moins cinq millivolts, la durée de pas de 20 millisecondes et la durée d’acquisition à 600 secondes.Ensuite, créez la solution peptidique d’intérêt en utilisant le même TBS pour maintenir la composition du superfusat. Mettre en place un système de collecteur où le superfusat peut être commuté entre TBS et TBS complété par des peptides. Utilisez les paramètres standard TBS et configurez le protocole d’acquisition de données de détection peptidique en réglant la durée d’acquisition à 360 secondes.Avant le dépôt de poly-dopamine, enfilez la pointe exposée de l’électrode en fil de platine à travers une aiguille hypodermique de calibre 22, laissant environ deux millimètres au-delà de la pointe de l’aiguille. Utilisez des pinces et pliez doucement l’extrémité de l’électrode en fil de platine pour créer une barbe qui pend de l’extrémité de l’aiguille hypodermique. Retirez doucement l’aiguille de la pointe barbelée, en laissant suffisamment de fil à placer dans le récipient sans que l’aiguille n’entre en contact avec le liquide et procédez au dépôt de dopamine comme démontré précédemment.Maintenant, rincez la pointe de la sonde barbelée avec du PBS et placez-la dans la solution d’anticorps. Ensuite, retirez doucement la pointe fonctionnalisée du PBS. Déplacez l’aiguille hypodermique vers la sonde immunoactive capacitive barbelée et implantez-la doucement dans la région d’intérêt avant de brancher la broche du connecteur en or dans l’étage de tête.Une fois implanté, retirez l’aiguille hypodermique en laissant l’électrode en place. Une étape positive dans le potentiel de commande mesure le courant d’injection nécessaire pour serrer la tension de la sonde et permet la mesure du courant capacitif. L’étape de potentiel de commande négative efface le peptide lié de l’anticorps par répulsion électrostatique.La forme d’onde de commande de la fonction pas représentait la détection itérative résolue dans le temps et la quantification du peptide. La trace inférieure représentait le potentiel de commande et le courant résultant sous la superfusion de la sonde dans TBS. L’immunosonde capacitive équilibrée a montré une carie initiale plus petite et une ligne de base stable sur six minutes.Le flux de neuropeptide Y dans la chambre d’écoulement a augmenté les courants capacitifs par rapport à la ligne de base. Les courants d’immunosonde capacitifs mesurés avec une sonde fonctionnalisée par anticorps neuropeptide Y ont montré un signal dépendant de la concentration sensible au neuropeptide Y à faible picomole Pour l’étalonnage, une courbe standard a été mesurée pour toutes les concentrations testées. La stimulation du ganglion stellaire bilatéral a montré un niveau élevé de neuropeptide Y lorsqu’il est co-tracé avec les courants capacitifs de contrôle négatif.La libération de noradrénaline mesurée sous stimulation stellaire a montré une libération synchrone avec le neuropeptide Y, compatible avec une réponse sympathique évoquée. Le développement de ces techniques peut fournir des lectures peropératoires des modulateurs clés de l’activité cardiaque, fournissant ainsi un guidage thérapeutique ou interventionnel rapide potentiel. La technique présentée ici est spécifique au déploiement cardiovasculaire, mais la technique elle-même convient à d’autres contextes physiologiques, tels que l’urine, les muscles squelettiques, les reins, le tissu adipeux, etc.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparamétrique cartographie optique du Cœur lapin perfusé de Langendorff

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l&#39;acquisition d&#39;images

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics de synthèse chimique et résolue en temps des études mécanistes

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...