Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

אנו מודים לד"ר אולו אג'יג'ולה (מרכז UCLA להפרעות קצב לב) על תמיכת מומחים בניסויי in vivo . עבודה זו נתמכה על ידי NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (מהדורה 8, 2011). חזירי יורקשייר זכרים בוגרים במשקל של כ-75 ק"ג שימשו למחקרי in vivo <sup class=...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור ובדיקה של אימונו-פרוב קיבולי (CI probe) המסוגל לזהות ולמדוד סמנים ביולוגיים בעלי עניין הן במבחנה והן בסביבה in vivo . הגילוי מושג על ידי לכידת הסמן הביולוגי בקצה האלקטרודה. אירוע הלכידה משנה את הצומת הקיבולי בין אימונופרוב קיבולי של חוט פלטינה לבין סביבת הנו?...

מספר שיטות כימיות לאיתור וכימות סמנים ביולוגיים משמשות באופן שגרתי הן בכימיה של חלבונים והן באבחון קליני, במיוחד באבחנות סרטן ובהערכת התקדמות מחלות לב וכלי דם. נכון לעכשיו, שיטות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) וספקטרומטריית מסה מסתמכות על איסוף דגימות מתא כלי הדם 1,2,3 על ידי משיכת נוזלים בתפזורת או מהתא הבין-כוכבי על ידי מיקרודיאליזה. מיקרודיאליזה משתמשת בצינור ממברנה חצי-חדיר באורך ידוע הממוקם באזור עניין. נוזל האיסוף מחלחל דרך הצינור במשך מספר דקות4 כדי לאסוף את הדגימה לניתוח5, ובכך מגביל את הרזולוציה הטמפורלית. באופן זה, דגימות שנאספו מספקות רק ערך ממוצע לאורך זמן של המיקרו-סביבה המקומית ומוגבלות על ידי קצב הזלוף והאיסוף של נפח דגימה מספיק. יתר על כן, שיטות אלה דורשות איגום של נתונים ניסיוניים וממוצע אותות; לכן, הם עשויים שלא לתת דין וחשבון על השונות בין הנושאים. חשוב לציין כי הזמן שבין איסוף הדגימות לבין הניתוח הלא מקוון שלאחר מכן מונע התערבות קלינית וטיפולים מיידיים.
בפרוטוקול הנוכחי, מתואר השימוש בביו-סנסור אימונופרוב קיבולי (CI probe) לזיהוי חשמלי שנפתר בזמן של פפטידים ביו-אקטיביים ספציפיים. נוירופפטיד Y (NPY), המשתחרר מתאי עצב סימפתטיים פוסט-גנגליוניים המעצימים את כלי הדם, אנדוקרדיום, קרדיומיוציטים וגרעינים תוך-לבביים, הוא משדר פפטידים נוירומודולטוריים מרכזי במערכת הלב וכלי הדם 6,7,8,9. השיטה המוצגת כאן נועדה למדוד NPY, וההיתכנות הניסויית מודגמת במודל לב חזירי. עם זאת, גישה זו חלה על כל פפטיד ביו-אקטיבי שעבורו נוגדן סלקטיבי זמין10. שיטה זו מסתמכת על הצומת הקיבולי בין בדיקה של חוט פלטינה לבין הנוזל המוליך בקצה המתפקד11,12. ביישום זה, האינטראקציה הייתה מתווכת באמצעות נוגדן נגד נוירופפטיד המטרה (NPY), שהיה קשור לקצה האלקטרודה, והתממשק לסביבת הנוזל המוליך. פונקציונליזציה זו הושגה באמצעות אלקטרודפוזיציה של פולידופאמין תגובתי על קצה הגשושית חוט הפלטינה 10,13.
כאשר הגשושית המתפקדת על ידי נוגדנים ממוקמת באזור עניין in vivo, שחרור NPY אנדוגני מעורר מוביל לקשירת נוגדנים לוכדים על קצה הגשושית, והנוזל המוליך במשטח האלקטרודה נעקר על ידי חלבון NPY. שינוי מקומי בסביבה החשמלית גורם לתזוזה של נוזל דיאלקטרי בעל ניידות גבוהה עם מולקולה חסרת תנועה וטעונה סטטית. זה משנה את ממשק האלקטרודה-זורם, ובכך את הקיבוליות שלו, הנמדדת כשינוי בזרם המטען בתגובה לפוטנציאל פקודה של פונקציית צעד. פוטנציאל "איפוס" שלילי מופעל מיד לאחר כל מחזור מדידה בודד כדי להדוף NPY מאוגד מהנוגדן באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית, ובכך לנקות את אתרי הקישור של הנוגדנים לסבבים הבאים של מדידה10. זה למעשה מאפשר מדידה של NPY באופן שנפתר בזמן. טכניקת CI הייחודית מתגברת על המגבלות של השיטות האימונוכימיות מבוססות המיקרודיאליזה שתוארו לעיל כדי למדוד רמות סמנים ביולוגיים דינמיים מניסוי יחיד ללא אגום נתונים או ממוצע איתותים על פני מספר ניסויים9, ומספקת נתונים כמעט בזמן אמת. יתר על כן, היכולת להתאים שיטה זו לכל סמן ביולוגי בעל עניין שעבורו קיים נוגדן מתאים בקנה מידה פתור ומלוקלי מספקת התקדמות טכנית משמעותית במדידה אימונוכימית להערכת התקדמות המחלה והכוונת התערבויות טיפוליות.
התוכנה לאיסוף וניתוח נתונים נכתבה בהתאמה אישית ב- IGOR Pro (סביבת תוכנה אינטראקטיבית לחלוטין). מערכת ממיר אנלוגית לדיגיטלית (A/D) הוציאה מתח פקודה תחת בקרת מחשב ורכשה נתונים ממגבר מותאם אישית. המגבר היה בעל תכונות ייחודיות מסוימות. אלה כללו נגד משוב (ניתן להחלפה) עבור כל אחד מארבעת ערוצי הרכישה, המאפשר בחירה במעגלי מהדקי מתח משוב של 1 MOhm או 10 MOhm כדי לשלב את השונות של האלקטרודה. יחידת במה עם ראש יחיד ומעגל קרקע/ייחוס הדדי לכל ארבעת ערוצי הרכישה נבנתה גם היא כדי למקם את המכשיר קרוב לחזה במודול פיזי יחיד. הגדרת נגד משוב 1 MOhm שימשה לאיסוף כל הנתונים המדווחים.
הגדרות המסנן והרווח הועתקו מהמגבר ותועדו בתוך קובץ הנתונים. הנתונים סוננו ב-1 קילוהרץ באמצעות מסנן בסל אנלוגי בן 2 קטבים שעבר דיגיטציה ב-10 קילוהרץ. ההבדל בפוטנציאל בין הגשושית לתמיסה המוליכה הסובבת יוצר שכבה קיבולית של הלמהולץ בקצה הגשושית. קשירת ליגנד לנוגדן בקצה הגשושית גורמת לשינוי במטען המקומי, ובכך לשינוי בקיבוליות הלמהולץ. שינוי זה ברכיב הקיבולי של המעגל גורם לשינוי בגודל המטען המוזרק הנדרש כדי להביא את הגשושית לפוטנציאל בפרוטוקול המתח של פונקציית הצעד. לפיכך, קשירת ליגנד מסוים לבדיקה הפונקציונלית גורמת לשינוי במדידת קיבוליות האלקטרודה כשינוי בזרם הקיבולי הגבוה ביותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

היכולת למדוד סמנים ביולוגיים in vivo הרלוונטיים להערכת התקדמות המחלה מעניינת מאוד את הקהילות המדעיות והרפואיות. קבלת הרזולוציה של התוצאות המתקבלות מהשיטות הנוכחיות למדידת סמנים ביולוגיים מסוימים יכולה להימשך מספר ימים או שבועות, מכיוון שהם יכולים להיות מוגבלים ברזולוציה הן מבחינה מרחבית והן באופן זמני (למשל, מיקרודיאליזה של תאי נוזלים של נוזל אינטרסטיציאלי של נוזל אינטרסטיציאלי שנותחה על ידי בדיקה חיסונית המקושרת לאנזים [ELISA], כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [HPLC], או ספקטרומטריית מסה); לפיכך, ההנחיה שלהם לאבחון וטיפול בזמן מופרעת. במחקר הנוכחי מדווחת טכניקה ייחודית לאיתור ומדידה של משדרי פפטידים in vivo באמצעות שימוש בביוסנסור אימונו-פרובי קיבולי (CI probe). פרוטוקול הייצור והאפיון החוץ גופי של בדיקות אלה מתוארים. מדידות של נוירופפטיד Y (NPY) מעורר גירוי סימפתטי משחרר in vivo מסופקות. שחרור NPY מתואם לשחרור אוהד של נוראדרנלין לעיון. הנתונים מדגימים גישה למדידה מהירה ומקומית של נוירופפטידים in vivo. יישומים עתידיים כוללים הערכה תוך ניתוחית בזמן אמת של התקדמות המחלה ופריסה זעיר פולשנית מבוססת צנתרים של בדיקות אלה.

ייצור ואפיון אלקטרודות אימונו-פרוב קיבולי גמיש (בדיקות CI) יוצר, ותמונה מייצגת מתוארת באיור 1A. פוטנציאל האלקטרודה נקבע על ידי מעגל מהדק מתח מבוקר מחשב (איור 1B), והאלקטרודה הייתה שקועה בתמיסת פולידופאמין המיוצרת ב-PBS. פולידופאמין הוצמד לאלקטרודפוזי...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

שיטות אימונוכימיות מבוססות למדידת משדרי פפטידים in vivo מסתמכות על מיקרודיאליזה או על משיכת נוזלים בתפזורת כדי לקבל את הדגימה לניתוח לא מקוון. עם זאת, אלה סובלים ממגבלות מרחביות-טמפורליות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור והיישום של ביוסנסור אימונופרוב קיבולי המתגבר על מגבלות הטכניקות הקיימות.

מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

זו הפעם הראשונה שפותחה שיטה למדידת רמות המשדר הפפטידי in vivo. אנו יכולים למדוד את רמות המשדר הפפטידי בנבדקים בודדים ובמיקומים בדידים באמצעות ניתוח כמעט בזמן אמת. ראשית, חותכים אורך של 25 ס"מ של חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי.לאחר מכן, באמצעות אזמל, מפשיטים כחמישה מילימטרים של ציפוי פרפלואורואלקוקסי מקצה אחד, נזהרים שלא לחתוך לחוט הפלטינה. כעת, הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לתוך פין מחבר זכר מצופה זהב, מילימטר אחד. לאחר מכן, באמצעות צבתות אף-מחט, צמצם את שיני הפין המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה והלחים את חוט הפלטינה לפין המחבר המצופה זהב.לאחר מכן, להכין את תמיסת הדופמין על ידי הוספת 50 מיליגרם של דופמין הידרוכלוריד ב 50 מיליליטרים של 10 מילימולרי PBS עם pH6 ולערבב על ידי ערבוב על ידי ערבוב. לאחר המסה מוחלטת של הדופמין, מניחים את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל את ה-PBS הטרי עם תוספת דופמין. חברו את אלקטרודת הדיסק הכסופה כלוריד לתעלת הקרקע בשלב הראש.לאחר מכן, הניחו את הדיסק הכסוף כלוריד בכלי המכיל PBS ותיל פלטינה המכילים PBS ותיל פלטינה בתוספת דופמין. לפני שתמשיך הלאה, חבר חוט לערוצי הייחוס של שלב הראש. פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים והגדר פרוטוקול פוטנציאל פקודת תצהיר אלקטרוני של sawtooth על-ידי הגדרת פוטנציאל ההתחלה במינוס 0.6 וולט, פוטנציאל הקצה ל- 0.65 וולט, קצב הסריקה ב- 0.04 וולט לשנייה ומשך התצהיר ל- 420 שניות.לאחר השלמת תצהיר הפולי-דופמין, הסר את כדור הקרקע הכסוף כלוריד ואת קצה חוט הפלטינה מהכלי. מקם את קצה החוט במיקרו-צינור המכיל PBS של pH 7.4 למשך שתיים עד חמש דקות וודא שקצה החוט אינו יוצר קשר עם הצדדים או התחתית של המיקרו-צינור. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדן על ידי שילוב הנוגדן המעניין עם ה-PBS של pH 7.4 ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים.לאחר מכן, השרו את קצה הפולי-דופמין המופקד של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת הנוגדנים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא נח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור. מכניסים את הקצה התפקודי של האימונו-פרוב הקיבולי לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן פעולה זו עלולה לפגוע בקצה החושי של הגשושית. לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הבדיקה האימונו-פרוביבית הקיבולית, ועבור פרוטוקול המתח, קבע את פוטנציאל הצעד החיובי ל-110 מיליוולט, פוטנציאל צעד שלילי למינוס חמישה מיליוולטים, משך צעד של 20 אלפיות השנייה ומשך הרכישה ל-600 שניות.לאחר מכן, צור את התמיסה הפפטידית המעניינת באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב הסופרפוסאט. הגדר מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את ה-superfusate בין TBS ל-TBS עם תוספת פפטידים. השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של TBS והגדר את פרוטוקול איסוף הנתונים של חישת הפפטידים על-ידי הגדרת משך הרכישה ל-360 שניות.לפני תצהיר הפולי-דופמין, משחילים את הקצה החשוף של אלקטרודת חוט הפלטינה דרך מחט היפודרמית בעלת 22 מדים, ומשאירים כשני מילימטרים מעבר לקצה המחט. השתמשו במלקחיים וכופפו בעדינות את קצה אלקטרודת חוט הפלטינה כדי ליצור מוט שתלוי מקצה המחט ההיפודרמית. משכו בעדינות את המחט מקצה התיל, והשאירו מספיק חוט כדי למקם בכלי מבלי שהמחט תיצור קשר עם הנוזל והמשיכו עם תצהיר דופמין כפי שהוכח קודם לכן.כעת, שטפו את קצה הבדיקה עם PBS והניחו אותו בתמיסת הנוגדנים. לאחר מכן, הסר בעדינות את הקצה הפונקציונלי מה- PBS. הזיזו את המחט ההיפודרמית אל האימונו-פרוב הקיבולי של התיל והשתילו אותה בעדינות באזור העניין לפני חיבור סיכת מחבר הזהב לשלב הראש.לאחר ההשתלה, למשוך את המחט ההיפודרמית, ולהשאיר את האלקטרודה במקומה. צעד חיובי בפוטנציאל הפיקוד מודד את זרם ההזרקה הנדרש להדק את מתח הגשושית ומאפשר מדידה של הזרם הקיבולי. שלב פוטנציאל הפיקוד השלילי מנקה את הפפטיד המאוגד מהנוגדן באמצעות דחייה אלקטרוסטטית.צורת הגל של פקודת פונקציית הצעד תיארה את הגילוי והכימות האיטרטיביים של הפפטיד שנפתרו בזמן. העקבה התחתונה ייצגה את פוטנציאל הפקודה ואת הזרם שנוצר כתוצאה מכך תחת חליטת העל של הגשושית ב- TBS. החיסון הקיבולי המשוקלל הראה דעיכה ראשונית קטנה יותר ובסיס יציב במשך שש דקות.הזרימה של נוירופפטיד Y לתוך תא הזרימה הגבירה את הזרמים הקיבוליים מעל קו הבסיס. זרמי אימונו-פרופ קיבוליים שנמדדו באמצעות בדיקה תפקודית של נוגדן נוירופפטיד Y הראו אות תלוי ריכוז הרגיש לנוירופפטיד נמוך פיקומולי Y לצורך כיול, נמדדה עקומה סטנדרטית עבור כל הריכוזים שנבדקו. הגירוי של גנגליון הסטלטים הדו-צדדי הראה נוירופפטיד Y גבוה כאשר הוא מתווה יחד עם הזרמים הקיבוליים של הבקרה השלילית.שחרור נוראדרנלין שנמדד תחת גירוי סטלטי הראה שחרור סינכרוני עם נוירופפטיד Y, התואם תגובה סימפתטית מעוררת. הפיתוח של טכניקות אלה עשוי לספק קריאות תוך ניתוחיות של מודולטורים מרכזיים של פעילות לבבית, ובכך לספק הדרכה טיפולית או התערבותית מהירה פוטנציאלית. הטכניקה כפי שהוצגה כאן היא ספציפית לפריסה קרדיווסקולרית, אולם הטכניקה עצמה מתאימה למסגרות פיזיולוגיות אחרות, כגון שתן, שרירי שלד, כליות, רקמת שומן וכו '.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics לסינתזה כימית וזמן נפתר מכניסטית לימודים

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...