Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Vi takker Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) for ekspertstøtte for in vivo-eksperimentene . Dette arbeidet ble støttet av NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Alle dyreforsøk ble godkjent av University of California, Los Angeles Animal Research Committee og utført etter retningslinjene fastsatt av National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (8. utgave, 2011). Voksne mannlige Yorkshire griser på ca 75 kg ble brukt til in vivo studier10.
1. Kapasitiv immunoprobe fabrikasjon og funksjonalisering
<ol><li>Klipp en 25 cm lengde perfluoroalkoxy (PFA)-belagt platinatråd (...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Den nåværende protokollen beskriver produksjon og testing av en kapasitiv immunoprobe (CI-sonde) som er i stand til å oppdage og måle biomarkører av interesse for både in vitro - og in vivo-innstillinger . Deteksjon oppnås ved å fange biomarkøren på elektrodespissen. Overlappingshendelsen endrer det kapasitive krysset mellom en platinatråd kapasitiv immunoprobe og det omkringliggende ledende væskemiljøet, målt som en endring i ladestrømmen som svar på et potensielt skifte i sonden. En un...

Flere kjemiske metoder for å oppdage og kvantifisere biomarkører brukes rutinemessig i både proteinkjemi og klinisk diagnostikk, spesielt i kreftdiagnoser og vurdering av kardiovaskulær sykdomsprogresjon. For tiden er metoder som høyytelses væskekromatografi (HPLC), enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og massespektrometri avhengig av prøveinnsamling fra det vaskulære rommet 1,2,3 ved bulkvæsketrekk eller interstitialrommet ved mikrodialyse. Mikrodialyse bruker et halverfarlig membranrør av kjent lengde som er plassert i en interesseregion. Oppsamlingsvæske perfunderes gjennom røret over flere minutter4 for å samle prøven for analyse5, og begrenser dermed tidsoppløsningen. På denne måten gir prøver som samles inn bare en gjennomsnittlig verdi over tid av det lokale mikromiljøet og begrenses av perfusjonshastigheten og innsamlingen av tilstrekkelig prøvevolum. Videre krever disse metodene sammenslåing av eksperimentelle data og signalgjennomsnitt; Derfor kan de unnlate å ta hensyn til variasjon mellom fagene. Det er viktig at tiden mellom prøveinnsamling og påfølgende offline analyse utelukker umiddelbar klinisk intervensjon og terapeutiske behandlinger.
I den nåværende protokollen er bruken av en kapasitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde) for tidsavklart elektrisk deteksjon av spesifikke bioaktive peptider skissert. Neuropeptid Y (NPY), utgitt fra post-ganglionic sympatiske nevroner som innervate vaskulaturen, endokardi, kardiomyocytter og intrakardiiac ganglia, er en stor nevromodulatorisk peptidsender i kardiovaskulærsystemet 6,7,8,9. Metoden som presenteres her er designet for å måle NPY, og den eksperimentelle gjennomførbarheten er demonstrert i en porcin hjertemodell. Denne tilnærmingen gjelder imidlertid for alle bioaktive peptider der et selektivt antistoff er tilgjengelig10. Denne metoden er avhengig av det kapasitive krysset mellom en platinatrådsonde og den ledende væsken på den funksjonaliserte spissen11,12. I denne applikasjonen ble samspillet formidlet gjennom et antistoff mot målet neuropeptid (NPY), som var bundet til elektrodespissen, og interfacing det ledende væskemiljøet. Denne funksjonaliseringen ble oppnådd gjennom elektrodeposisjon av reaktiv polydopamin på spissen av platinatrådsonden 10,13.
Når den antistoff-funksjonaliserte sonden er plassert i en region av interesse in vivo, fremkalles endogen NPY-frigjøring fører til binding til fangstantistoffene på sondespissen, og den ledende væsken på elektrodeoverflaten forskyves av NPY-proteinet. Lokal endring i det elektriske miljøet resulterer i forskyvning av høy mobilitet, høy dielektrisk væske med et immobilt, statisk ladet molekyl. Dette endrer elektrodevæskegrensesnittet og dermed kapasitansen, som måles som en endring i ladestrøm som svar på et trinnfunksjonskommandopotensial. Et negativt "reset"-potensial brukes umiddelbart etter hver enkelt målesyklus for å avvise bundet NPY fra antistoffet gjennom elektrostatisk interaksjon, og dermed fjerne antistoffbindingsstedene for påfølgende runder med måling10. Dette muliggjør effektivt måling av NPY på en tidsavklart måte. Den unike CI-teknikken overvinner begrensningene til de mikrodialysebaserte immunkjemiske metodene som er skissert ovenfor for å måle dynamiske biomarkørnivåer fra et enkelt eksperiment uten datagruppering eller signalgjennomsnitt over flere eksperimenter9, og gir data i nesten sanntid. Videre gir evnen til å tilpasse denne metoden til enhver biomarkør av interesse som det finnes et passende antistoff på en tidsavklart og lokalisert skala, et stort teknisk fremskritt i immunkjemisk måling for evaluering av sykdomsprogresjon og veiledning av terapeutiske intervensjoner.
Programvaren for datainnsamling og analyse ble spesialskrevet i IGOR Pro (et fullt interaktivt programvaremiljø). Et analogt til digitalt omformersystem (A/D) utstedte en kommandospenning under datakontroll og innhentet data fra en tilpasset forsterker. Forsterkeren hadde visse unike egenskaper. Disse inkluderte en tilbakemeldingsmotstand (byttbar) for hver av de fire oppkjøpskanalene, noe som gjorde det mulig å velge 1 MOhm eller 10 MOhm feedback spenningsklemmekretser for å integrere variabiliteten til elektroden. En sceneenhet med ett enkelt hode og gjensidig jord/referansekrets for alle de fire oppkjøpskanalene ble også bygget for å plassere enheten i nærheten av brystet i en enkelt fysisk modul. En innstilling på 1 MOhm-tilbakemeldingsmotstand ble brukt til å samle inn alle de rapporterte dataene.
Filter- og forsterkningsinnstillingene ble telegrafert fra forsterkeren og registrert i datafilen. Data ble filtrert ved 1 kHz via et 2-polet analogt Bessel-filter digitalisert ved 10 kHz. Forskjellen i potensial mellom sonden og den omkringliggende ledende løsningen skaper et Helmholtz kapasitivt lag ved sondespissen. Ligandbinding til antistoffet på sondespissen resulterer i en endret lokal ladning og dermed en endring i Helmholtz-kapasitansen. Denne endringen i den kapasitive komponenten i kretsen resulterer i et skifte i størrelsen på injisert ladning som kreves for å bringe sonden til potensialet i trinnfunksjonsspenningsprotokollen. Dermed resulterer bindingen av en bestemt ligand til den funksjonaliserte sonden i en endring i elektrode kapasitansmålingen som en endring i topp kapasitiv strøm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

Evnen til å måle biomarkører in vivo relevant for vurdering av sykdomsprogresjon er av stor interesse for de vitenskapelige og medisinske samfunnene. Oppløsningen av resultater hentet fra dagens metoder for måling av visse biomarkører kan ta flere dager eller uker å oppnå, da de kan begrenses i oppløsning både romlig og timelig (f.eks. mikrodialyse av mellomliggende væske analysert av enzymbundet immunosorbentanalyse [ELISA], høyytelses væskekromatografi [HPLC], eller massespektrometri); Dermed blir deres veiledning om rettidig diagnose og behandling forstyrret. I den nåværende studien rapporteres en unik teknikk for å oppdage og måle peptidssendere in vivo ved bruk av en kapasitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde). Fabrikasjonsprotokollen og in vitro-karakteriseringen av disse sondene er beskrevet. Målinger av sympatisk stimulering-fremkalt neuropeptid Y (NPY) frigjøring in vivo er gitt. NPY-utgivelsen er korrelert med den sympatiske frigjøringen av noradrenalin som referanse. Dataene viser en tilnærming for rask og lokalisert måling av nevropeptider in vivo. Fremtidige anvendelser inkluderer intraoperativ sanntidsvurdering av sykdomsprogresjon og minimalt invasiv kateterbasert distribusjon av disse sondene.

Elektrodeproduksjon og karakterisering En fleksibel kapasitiv immunoprobe (CI-sonder) ble fremstilt, og et representativt bilde er avbildet i figur 1A. Elektrodepotensialet ble satt av en datastyrt spenningsklemmekrets (figur 1B), og elektroden ble nedsenket i en polydopaminløsning laget i PBS. Polydopamin ble elektrodeponert på den ledende elektrodespissen13 for funksjonalisering. Kommandopotensialet drev sondespenn...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Etablerte immunkjemiske metoder for å måle peptidssendere in vivo er avhengige av mikrodialyse eller bulkvæsketrekk for å oppnå prøven for offline analyse. Disse lider imidlertid av romlige begrensninger. Den nåværende protokollen beskriver fabrikasjon og anvendelse av en kapasitiv immunoprobe biosensor som overvinner begrensningene til de eksisterende teknikkene.

Tidsavklart In Vivo-måling av nevropeptiddynamikk ved kapasitiv immunoprobe i porcin hjerte

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Dette er første gang en metode er utviklet for tidsavklart måling av peptidssendernivåer in vivo. Vi kan måle peptidssendernivåer i enkeltpersoner og diskrete steder med nesten sanntidsanalyse. Klipp først en 25 centimeter lang perfluoroalkoxy-belagt platinatråd.Deretter, ved hjelp av en skalpell, strip omtrent fem millimeter perfluoroalkoxy belegg fra den ene enden, forsiktig så du ikke kutter inn i platinatråden. Sett nå den stripete enden av platinatråden inn i en gullbelagt, en millimeter mannlig kontaktpinne. Deretter krymper du kontaktpinnen rundt den stripete enden av platinatråden og lodder platinatråden til den gullbelagte kontaktpinnen ved hjelp av nåle-nesetangen.Deretter forbereder du dopaminoppløsningen ved å legge til 50 milligram dopaminhydroklorid i 50 milliliter 10 millimolar PBS med pH seks og bland ved omrøring. Etter fullstendig oppløsning av dopamin, plasser spissen av platinatråden i karet som inneholder den nylagde dopamin-supplerte PBS. Koble sølvkloridskiveelektroden til jordkanalen i hodetrinnet.Plasser deretter sølvkloridskiven i karet som inneholder dopamin-supplert PBS og platinatråd. Før du fortsetter videre, koble en wire shunt til referansekanalene til hodetrinnet. Åpne den interaktive datainnsamlingsprogramvaren og sett en satooth elektroavsetningskommando potensiell protokoll ved å sette Start-potensialet til minus 0,6 volt, End-potensialet til 0,65 volt, skannehastigheten på 0,04 volt per sekund og varigheten av avsetningen til 420 sekunder.Etter å ha fullført poly-dopaminavsetningen, fjern sølvklorid malt pellet og spissen av platinatråden fra karet. Plasser trådspissen i et mikrorør som inneholder PBS på pH 7.4 i to til fem minutter, og sørg for at trådspissen ikke kommer i kontakt med sidene eller bunnen av mikrorøret. Forbered deretter antistoffløsningen ved å kombinere antistoffet av interesse med PBS av pH 7,4 i et 1:20-forhold i et passende størrelsesfartøy.Deretter suger du den poly-dopaminavsatte spissen av platinaelektroden i antistoffoppløsning i to timer ved romtemperatur, og sikrer at platinatrådspissen er suspendert i løsning og ikke hviler på mikrorørets indre overflate. Plasser den funksjonelle spissen av den kapasitive immunoproben inn i strømningskammeret, pass på at du ikke forstyrrer elektrodens spiss på noen måte, da det kan skade probens sensoriske spiss. Før den første eksperimentelle testen, utfør en TBS-standardkjøring for å kondisjonere den kapasitive immunoprobe-sonden, og for spenningsprotokollen setter du det positive trinnpotensialet til 110 millivolt, negativt trinnpotensial til minus fem millivolt, trinnvarighet på 20 millisekunder og varigheten av oppkjøpet til 600 sekunder.Deretter oppretter du peptidløsningen av interesse ved hjelp av samme TBS for å opprettholde superfusatets sammensetning. Sett opp et manifoldsystem der superfusatet kan byttes mellom TBS og peptid-supplert TBS. Bruk TBS-standardparametere og sett opp peptidsensorens datainnsamlingsprotokoll ved å sette varigheten av oppkjøpet til 360 sekunder.Før poly-dopaminavsetningen trer du den eksponerte spissen av platinatrådelektroden gjennom en 22-gauge hypodermisk nål, og etterlater omtrent to millimeter utover nålens spiss. Bruk tang og bøy forsiktig spissen av platinatrådelektroden for å lage en barb som henger fra enden av den hypodermiske nålen. Trekk nålen forsiktig ut av piggspissen, og la nok ledning til å plassere i fartøyet uten at nålen kommer i kontakt med væsken og fortsetter med dopaminavsetning som vist tidligere.Skyll nå piggtrådspissen med PBS og legg den i antistoffoppløsningen. Fjern deretter den funksjonaliserte spissen forsiktig fra PBS. Flytt den hypodermiske nålen til barbed kapasitiv immunoprobe og implanter den forsiktig i interesseområdet før du kobler gullkontaktstiften til hodetrinnet.Når den er implantert, trekker du ut den hypodermiske nålen og lar elektroden være på plass. Et positivt trinn i kommandopotensialet måler injeksjonsstrømmen som kreves for å klemme sondespenningen og tillater måling av den kapasitive strømmen. Det negative kommandopotensialet fjerner det bundne peptidet fra antistoffet via elektrostatisk frastøtelse.Trinnfunksjonskommandoens bølgeform avbildet den tidsavklarte iterative deteksjonen og kvantifiseringen av peptidet. Den nederste sporingen representerte kommandopotensialet og den resulterende strømmen under superfusjonen av sonden i TBS. Den likevektede kapasitive immunoproben viste mindre innledende forfall og en stabil basislinje over seks minutter.Strømmen av nevropeptid og inn i strømningskammeret økte de kapasitive strømmene over baseline. Kapasitive immunoprobestrømmer målt med en nevropeptid Y antistoff-funksjonalisert sonde viste et konsentrasjonsavhengig signal følsomt for lavpikomole neuropeptid Y For kalibrering ble det målt en standardkurve for alle testede konsentrasjoner. Stimuleringen av den bilaterale stellate ganglion viste forhøyet neuropeptid Y når den var sam plottet med de negative kontrollkapasitetsstrømmene.Norepinefrinfrigjøring målt under stellate stimulering viste en synkron frigjøring med nevropeptid Y, i samsvar med en fremkalt sympatisk respons. Utviklingen av disse teknikkene kan gi intraoperative avlesninger av viktige modulatorer av hjerteaktivitet, og dermed gi potensiell rask terapeutisk eller intervensjonsveiledning. Teknikken som presenteres her er spesifikk for kardiovaskulær distribusjon, men teknikken i seg selv er egnet for andre fysiologiske omgivelser, for eksempel urin, skjelettmuskulatur, nyrer, fettvev, et cetera.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Prosedyre for Decellularization av svinekjøtt Heart av Retrograde Coronary Perfusjon

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics for kjemisk syntese og Time-løst mekanistiske studier

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Stive innebygging av fast og farget, hele, Millimeter skala prøver for delen-gratis 3D Histology av mikro-beregnet tomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...