Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Мы благодарим доктора Олу Аджиджолу (Центр сердечной аритмии UCLA) за экспертную поддержку экспериментов in vivo . Эта работа была поддержана NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованию животных Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и выполнены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторны?...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Настоящий протокол описывает изготовление и тестирование емкостного иммунозонда (зонда CI), способного обнаруживать и измерять биомаркеры, представляющие интерес как в условиях in vitro , так и in vivo . Обнаружение достигается путем улавливания биомаркера на кончике электрода. Собы...

Несколько химических методов обнаружения и количественной оценки биомаркеров обычно используются как в химии белка, так и в клинической диагностике, особенно в диагностике рака и оценке прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуноферментный анализ (ИФА) и масс-спектрометрия, основаны на сборе проб из сосудистого компартмента 1,2,3 путем объемного забора жидкости или интерстициального компартмента путем микродиализа. Микродиализ использует полупроницаемую мембранную трубку известной длины, которая помещается в интересующую область. Всасывающая жидкость перфузируется через пробирку в течение нескольких минут4 для сбора образца для анализа5, тем самым ограничивая временное разрешение. Таким образом, собранные образцы обеспечивают только усредненную стоимость с течением времени местной микроокружения и ограничены скоростью перфузии и сбором достаточного объема образца. Кроме того, эти методы требуют объединения экспериментальных данных и усреднения сигналов; поэтому они могут не учитывать изменчивость между субъектами. Важно отметить, что время между сбором проб и последующим автономным анализом исключает немедленное клиническое вмешательство и терапию.
В настоящем протоколе описано использование емкостного иммунозондового биосенсора (CI-зонда) для электрического обнаружения специфических биоактивных пептидов с временным разрешением. Нейропептид Y (NPY), высвобождаемый из постганглионарных симпатических нейронов, которые иннервируют сосудистую систему, эндокард, кардиомиоциты и внутрисердечные ганглии, является основным нейромодулирующим пептидным передатчиком в сердечно-сосудистой системе 6,7,8,9. Метод, представленный здесь, предназначен для измерения NPY, а экспериментальная осуществимость демонстрируется в модели сердца свиней. Однако этот подход применим к любому биологически активному пептиду, для которого доступно селективное антитело10. Этот способ основан на емкостном соединении между зондом из платиновой проволоки и проводящей жидкостью на функционализированном наконечнике11,12. В этом приложении взаимодействие опосредовано через антитело против целевого нейропептида (NPY), который был связан с наконечником электрода, взаимодействуя со средой проводящей жидкости. Эта функционализация была достигнута путем электроосаждения реакционноспособного полидофамина на наконечник зонда10,13 из платиновой проволоки.
Когда функционализированный антителами зонд помещается в интересующую область in vivo, вызванное эндогенное высвобождение NPY приводит к связыванию с улавливающими антителами на кончике зонда, и проводящая жидкость на поверхности электрода смещается белком NPY. Локальное изменение в электрической среде приводит к вытеснению высокомобильной, высокодиэлектрической жидкости неподвижной, статически заряженной молекулой. Это изменяет интерфейс электрод-жидкость и, таким образом, его емкость, которая измеряется как изменение тока заряда в ответ на командный потенциал ступенчатой функции. Отрицательный потенциал «сброса» используется сразу после каждого отдельного цикла измерения для отталкивания связанного NPY от антитела посредством электростатического взаимодействия, тем самым очищая сайты связывания антител для последующих раундов измерения10. Это позволяет эффективно измерять NPY с временным разрешением. Уникальный метод CI преодолевает ограничения иммунохимических методов на основе микродиализа, описанных выше, для измерения динамических уровней биомаркеров из одного эксперимента без объединения данных или усреднения сигналов в течение нескольких экспериментов9, предоставляя данные почти в режиме реального времени. Более того, способность адаптировать этот метод к любому биомаркеру, представляющему интерес, для которого существует соответствующее антитело в масштабе с временным разрешением и локализацией, обеспечивает значительный технический прогресс в иммунохимическом измерении для оценки прогрессирования заболевания и руководства терапевтическими вмешательствами.
Программное обеспечение для сбора и анализа данных было написано на заказ в IGOR Pro (полностью интерактивная программная среда). Система аналого-цифрового преобразователя (A/D) выдавала командное напряжение под управлением компьютера и получала данные от пользовательского усилителя. Усилитель обладал определенными уникальными особенностями. Они включали резистор обратной связи (переключаемый) для каждого из четырех каналов сбора, что позволяло выбирать цепи зажима напряжения обратной связи 1 МОм или 10 МОм для интеграции вариативности электрода. Блок ступени с одной головкой и взаимной схемой заземления/отсчета для всех четырех каналов сбора также был построен для размещения устройства рядом с сундуком в одном физическом модуле. Для сбора всех сообщаемых данных использовалась настройка резистора обратной связи 1 МОм.
Настройки фильтра и усиления передавались по телеграфу с усилителя и записывались в файл данных. Данные фильтровались на частоте 1 кГц с помощью 2-полюсного аналогового фильтра Бесселя, оцифрованного на частоте 10 кГц. Разница в потенциале между зондом и окружающим проводящим раствором создает емкостный слой Гельмгольца на кончике зонда. Связывание лиганда с антителом на кончике зонда приводит к изменению местного заряда и, таким образом, изменению емкости Гельмгольца. Это изменение емкостной составляющей цепи приводит к сдвигу величины впрыскиваемого заряда, необходимого для приведения зонда к потенциалу в протоколе напряжения ступенчатой функции. Таким образом, связывание конкретного лиганда с функционализированным зондом приводит к изменению измерения емкости электрода как изменение пикового емкостного тока.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

Возможность измерения биомаркеров in vivo, имеющих отношение к оценке прогрессирования заболевания, представляет большой интерес для научного и медицинского сообществ. Разрешение результатов, полученных в результате современных методов измерения определенных биомаркеров, может занять несколько дней или недель для получения, поскольку они могут быть ограничены в разрешении как пространственно, так и временно (например, микродиализ жидкостного компартмента интерстициальной жидкости, анализируемой с помощью иммуноферментного анализа [ИФА], высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] или масс-спектрометрии); таким образом, нарушается их руководство своевременной диагностикой и лечением. В настоящем исследовании сообщается об уникальном методе обнаружения и измерения пептидных передатчиков in vivo с использованием емкостного биосенсора иммунозонда (CI probe). Описан протокол изготовления и характеристика in vitro этих зондов. Приведены измерения высвобождения in vivo вызванного симпатической стимуляцией нейропептида Y (NPY). Высвобождение NPY коррелирует с симпатическим высвобождением норадреналина для справки. Данные демонстрируют подход к быстрому и локализованному измерению нейропептидов in vivo. Будущие приложения включают интраоперационную оценку прогрессирования заболевания в режиме реального времени и минимально инвазивное развертывание этих зондов на основе катетера.

Изготовление и определение характеристик электродов Был изготовлен гибкий емкостный иммунозонд (зонды CI), и репрезентативное изображение изображено на рисунке 1A. Электродный потенциал устанавливали с помощью управляемой компьютером цепи зажима напряжения...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Установленные иммунохимические методы измерения пептидных передатчиков in vivo полагаются на микродиализ или объемное извлечение жидкости для получения образца для автономного анализа. Тем не менее, они страдают от пространственно-временных ограничений. Настоящий протокол описывает изготовление и применение емкостного иммунозондового биосенсора, который преодолевает ограничения существующих методов.

Измерение динамики нейропептидов in vivo с временным разрешением с помощью емкостного иммунозонда в сердце свиней

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Это первый случай, когда был разработан метод измерения с временным разрешением уровней пептидных передатчиков in vivo. Мы можем измерять уровни пептидных передатчиков в отдельных субъектах и дискретных местах с помощью анализа, близкого к реальному времени. Во-первых, вырежьте 25-сантиметровую длину платиновой проволоки с перфторалкокси-покрытием.Затем, используя скальпель, снимите примерно пять миллиметров перфторалкокси-покрытия с одного конца, стараясь не разрезать на платиновую проволоку. Теперь вставьте зачищенный конец платинового провода в позолоченный одномиллиметровый контакт разъема. Затем, используя плоскогубцы, обжимаем контактные зубья разъема вокруг зачищенного конца платинового провода и паяем платиновый провод к позолоченному контакту разъема.Далее готовят раствор дофамина, добавляя 50 миллиграммов гидрохлорида дофамина в 50 миллилитрах 10-миллимолярного PBS с рН шесть и перемешивают путем перемешивания. После полного растворения дофамина поместите наконечник платиновой проволоки в сосуд, содержащий свежеприготовленный дофамин СДБ. Подключите дисковый электрод хлорида серебра к заземляющему каналу в головной ступени.Затем поместите диск хлорида серебра в сосуд, содержащий PBS, дополненный дофамином, и платиновую проволоку. Прежде чем идти дальше, подключите проволочный шунт к опорным каналам головной ступени. Откройте интерактивное программное обеспечение для сбора данных и установите протокол потенциала команды электроосаждения пилообразного электроосаждения, установив начальный потенциал на минус 0,6 вольта, конечный потенциал на 0,65 вольта, скорость сканирования на 0,04 вольта в секунду и продолжительность осаждения на 420 секунд.После завершения осаждения полидофамина удалите гранулу хлорида серебра и наконечник платиновой проволоки из сосуда. Поместите наконечник проволоки в микротрубку, содержащую PBS рН 7,4, на две-пять минут и убедитесь, что наконечник провода не соприкасается с боковыми или нижними сторонами микропробирки. Затем готовят раствор антител, комбинируя интересующее антитело с PBS рН 7,4 в соотношении 1:20 в сосуде соответствующего размера.Затем замочите полидофаминовый осажденный наконечник платинового электрода в растворе антител в течение двух часов при комнатной температуре, гарантируя, что наконечник платиновой проволоки подвешен в растворе и не покоится на внутренней поверхности микротрубки. Поместите функциональный наконечник емкостного иммунозонда в проточную камеру, заботясь о том, чтобы не потревожить кончик электрода каким-либо образом, так как это может повредить сенсорный наконечник зонда. Перед первым экспериментальным испытанием выполните стандартный прогон TBS для кондициации емкостного иммунозондового зонда, а для протокола напряжения установите потенциал положительного шага на 110 милливольт, отрицательный потенциал шага до минус пяти милливольт, продолжительность шага 20 миллисекунд и продолжительность сбора до 600 секунд.Затем создайте интересующий пептидный раствор, используя тот же TBS для поддержания состава суперфузата. Настройте многообразную систему, в которой суперфузат можно переключать между TBS и TBS, дополненным пептидами. Используйте стандартные параметры TBS и настройте протокол сбора данных пептидного зондирования, установив продолжительность сбора 360 секунд.Перед осаждением полидофамина проденьте открытый наконечник электрода из платиновой проволоки через подкожную иглу 22-го калибра, оставив примерно два миллиметра за кончиком иглы. Используйте щипцы и осторожно согните кончик электрода из платиновой проволоки, чтобы создать колючку, которая свисает с конца подкожной иглы. Осторожно извлеките иглу из колючего наконечника, оставив достаточно проволоки для помещения в сосуд без контакта иглы с жидкостью, и приступайте к отложению дофамина, как показано ранее.Теперь промойте колючий наконечник зонда PBS и поместите его в раствор антител. Затем аккуратно извлеките функционализированный наконечник из PBS. Переместите иглу для подкожных инъекций к колючему емкостному иммунозонду и аккуратно имплантируйте его в интересующую область, прежде чем подключать золотой соединительный штифт к головной стадии.После имплантации извлеките подкожную иглу, оставив электрод на месте. Положительный шаг в командном потенциале измеряет ток впрыска, необходимый для зажима напряжения зонда, и позволяет измерять емкостный ток. Шаг отрицательного командного потенциала очищает связанный пептид от антитела посредством электростатического отталкивания.Форма сигнала команды ступенчатой функции изображала итеративное обнаружение и количественную оценку пептида с временным разрешением. Нижняя трассировка представляла командный потенциал и результирующий ток при переливании зонда в TBS. Уравновешенный емкостный иммунозонд показал меньший начальный распад и стабильный исходный уровень в течение шести минут.Поток нейропептида Y в проточную камеру увеличивал емкостные токи по сравнению с исходной линией. Емкостные иммунозондовые токи, измеренные с помощью нейропептидного зонда, функционализированного антителом Y, показали зависящий от концентрации сигнал, чувствительный к нейропептиду с низким содержанием пикомоле Y Для калибровки стандартную кривую измеряли для всех тестируемых концентраций. Стимуляция двустороннего звездчатого ганглия показала повышенный уровень нейропептида Y при совместном построении с отрицательными контрольными емкостными токами.Высвобождение норадреналина, измеренное при стимуляции звездчатой, показало синхронное высвобождение с нейропептидом Y, что согласуется с вызванной симпатической реакцией. Разработка этих методов может обеспечить интраоперационное считывание ключевых модуляторов сердечной деятельности, обеспечивая тем самым потенциальное быстрое терапевтическое или интервенционное руководство. Метод, представленный здесь, специфичен для сердечно-сосудистого развертывания, однако сам метод подходит для других физиологических условий, таких как моча, скелетные мышцы, почки, жировая ткань и т. Д.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Многопараметрический Оптический Картирование Langendorff-перфузии сердца кролика

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Визуализация белков и макромолекулярных комплексов по Отрицательные пятна EM: от сетки Подготовка к Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Порядок Decellularization свиного сердца, ретроградная коронарная перфузия

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics для химического синтеза и с временным разрешением механистических исследований

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Количественная оценка глобальной диастолической функции по кинематическая Моделирование на основе анализа трансмитрального кровотока через Заполнение формализма Параметризованный диастолической

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Тканевая инженерия по искробезопасности васкуляризации<em&gt; В Vivo</em&gt; Tissue Engineering палата

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Жесткая встраивание фиксированной и витражи, в целом, миллиметр масштаб образцов для секции Бесплатные 3D гистологии, Микро Компьютерная томография

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...