Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Vi tackar Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) för expertstöd för in vivo-experimenten . Detta arbete stöddes av NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Alla djurförsök godkändes av University of California, Los Angeles Animal Research Committee och utfördes enligt riktlinjerna från National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8: e upplagan, 2011). Vuxna Yorkshire-hangrisar på cirka 75 kg användes för in vivo-studier 10.
1. Kapacitiv immunoprobetillverkning och funktionalisering
<ol><li>Skär en 25 cm lång perfluoralkoxi (PFA) -belagd platinatråd (...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Detta protokoll beskriver tillverkning och testning av en kapacitiv immunoprob (CI-sond) som kan detektera och mäta biomarkörer av intresse i både in vitro- och in vivo-inställningar . Detektion uppnås genom att fånga biomarkören vid elektrodspetsen. Fångsthändelsen förändrar den kapacitiva korsningen mellan en platinatrådskapacitiv immunoprob och den omgivande ledande vätskemiljön, mätt som en förändring i laddningsströmmen som svar på en potentiell förskjutning i sonden. Ett unikt ...

Flera kemiska metoder för att detektera och kvantifiera biomarkörer används rutinmässigt inom både proteinkemi och klinisk diagnostik, särskilt vid cancerdiagnoser och bedömning av kardiovaskulär sjukdomsprogression. För närvarande är metoder som högpresterande vätskekromatografi (HPLC), enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och masspektrometri beroende av provuppsamling från kärlfacket 1,2,3 genom bulkvätskedragning eller det interstitiella facket genom mikrodialys. Mikrodialys använder ett semipermeabelt membranrör av känd längd som placeras i ett område av intresse. Uppsamlingsvätska perfuseras genom röret under flera minuter4 för att samla provet för analys5, vilket begränsar den tidsmässiga upplösningen. På detta sätt ger insamlade prover endast ett medelvärde över tiden av den lokala mikromiljön och begränsas av perfusionshastigheten och insamlingen av tillräcklig provvolym. Dessutom kräver dessa metoder sammanslagning av experimentella data och signalmedelvärde; därför kan de misslyckas med att ta hänsyn till variationer mellan ämnen. Viktigt är att tiden mellan provinsamling och efterföljande offlineanalys utesluter omedelbar klinisk intervention och terapi.
I detta protokoll beskrivs användningen av en kapacitiv immunoprobbiosensor (CI-sond) för tidsupplöst elektrisk detektion av specifika bioaktiva peptider. Neuropeptid Y (NPY), frisatt från post-ganglioniska sympatiska neuroner som innerverar vaskulaturen, endokardiet, kardiomyocyterna och intrakardiella ganglierna, är en viktig neuromodulerande peptidsändare i hjärt-kärlsystemet 6,7,8,9. Metoden som presenteras här är utformad för att mäta NPY, och den experimentella genomförbarheten demonstreras i en svinhjärtmodell. Detta tillvägagångssätt gäller emellertid för alla bioaktiva peptider för vilka en selektiv antikropp är tillgänglig10. Denna metod bygger på den kapacitiva korsningen mellan en platinatrådsond och den ledande vätskan vid den funktionaliserade spetsen11,12. I denna applikation medierades interaktionen genom en antikropp mot målneuropeptid (NPY), som var bunden till elektrodspetsen, vilket gränssnitt mot den ledande vätskemiljön. Denna funktionalisering uppnåddes genom elektrodeposition av reaktiv polydopamin på spetsen av platinatrådsonden10,13.
När den antikroppsfunktionaliserade sonden placeras i ett område av intresse in vivo leder framkallad endogen NPY-frisättning till bindning till de fångande antikropparna på sondspetsen och den ledande vätskan vid elektrodytan förskjuts av NPY-proteinet. Lokal förändring i den elektriska miljön resulterar i förskjutning av högrörlig, högdielektrisk vätska med en orörlig, statiskt laddad molekyl. Detta förändrar elektrod-vätskegränssnittet och därmed dess kapacitans, vilket mäts som en förändring i laddningsströmmen som svar på en stegfunktionskommandopotential. En negativ "återställningspotential" används omedelbart efter varje enskild mätcykel för att avvisa bunden NPY från antikroppen genom elektrostatisk interaktion och därmed rensa antikroppsbindningsställena för efterföljande mätrundor10. Detta möjliggör effektivt mätning av NPY på ett tidsupplöst sätt. Den unika CI-tekniken övervinner begränsningarna för de mikrodialysbaserade immunkemiska metoderna som beskrivs ovan för att mäta dynamiska biomarkörnivåer från ett enda experiment utan datapoolning eller signalgenomsnitt över flera experiment9, vilket ger data i nästan realtid. Dessutom ger förmågan att anpassa denna metod till alla biomarkörer av intresse för vilka det finns en lämplig antikropp i tidsupplöst och lokaliserad skala ett stort tekniskt framsteg inom immunokemisk mätning för utvärdering av sjukdomsprogression och vägledning av terapeutiska ingrepp.
Programvaran för datainsamling och analys var specialskriven i IGOR Pro (en helt interaktiv mjukvarumiljö). Ett analogt till digitalt omvandlare (A / D) -system utfärdade en kommandospänning under datorstyrning och förvärvade data från en anpassad förstärkare. Förstärkaren hade vissa unika egenskaper. Dessa inkluderade ett återkopplingsmotstånd (omkopplingsbart) för var och en av de fyra förvärvskanalerna, vilket möjliggjorde val av 1 MOhm eller 10 MOhm återkopplingsspänningsklämkretsar för att integrera elektrodens variation. En stegenhet med ett enda huvud och ömsesidig jord/ referenskrets för alla de fyra förvärvskanalerna byggdes också för att placera enheten nära bröstet i en enda fysisk modul. En inställning på 1 MOhm feedbackmotstånd användes för att samla in alla rapporterade data.
Filter- och förstärkningsinställningarna telegraferades från förstärkaren och spelades in i datafilen. Data filtrerades vid 1 kHz via ett 2-poligt analogt Bessel-filter digitaliserat vid 10 kHz. Skillnaden i potential mellan sonden och den omgivande ledande lösningen skapar ett Helmholtz kapacitivt skikt vid sondspetsen. Ligandbindning till antikroppen vid sondspetsen resulterar i en förändrad lokal laddning och därmed en förändring i Helmholtz kapacitans. Denna förändring i kretsens kapacitiva komponent resulterar i en förskjutning av storleken på injicerad laddning som krävs för att föra sonden till potentialen i stegfunktionsspänningsprotokollet. Således resulterar bindningen av en specifik ligand till den funktionaliserade sonden i en förändring i elektrodkapacitansmätningen som en förändring i toppkapacitiv ström.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

Förmågan att mäta biomarkörer in vivo relevanta för bedömning av sjukdomsprogression är av stort intresse för det vetenskapliga och medicinska samfundet. Upplösningen av resultat som erhållits från nuvarande metoder för att mäta vissa biomarkörer kan ta flera dagar eller veckor att erhålla, eftersom de kan begränsas i upplösning både rumsligt och tidsmässigt (t.ex. mikrodialys i vätskefacket av interstitiell vätska analyserad genom enzymbunden immunosorbentanalys [ELISA], högpresterande vätskekromatografi [HPLC] eller masspektrometri); Således störs deras vägledning om snabb diagnos och behandling. I den aktuella studien rapporteras en unik teknik för att detektera och mäta peptidtransmittrar in vivo genom användning av en kapacitiv immunoprobebiosensor (CI-sond). Tillverkningsprotokollet och in vitro-karakteriseringen av dessa sonder beskrivs. Mätningar av sympatisk stimulerings-framkallad neuropeptid Y (NPY) frisättning in vivo tillhandahålls. NPY-frisättning är korrelerad till den sympatiska frisättningen av noradrenalin som referens. Datan visar ett tillvägagångssätt för snabb och lokaliserad mätning av neuropeptider in vivo. Framtida tillämpningar inkluderar intraoperativ realtidsbedömning av sjukdomsprogression och minimalt invasiv kateterbaserad distribution av dessa sonder.

Elektrodtillverkning och karakterisering En flexibel kapacitiv immunoprobe (CI-sonder) tillverkades och en representativ bild avbildas i figur 1A. Elektrodpotentialen ställdes in av en datorstyrd spänningsklämkrets (figur 1B) och elektroden nedsänktes i en polydopaminlösning tillverkad i PBS. Polydopamin elektrodplacerades på den ledande elektrodspetsen13 för funktionalisering. Kommandopotentialen drev sondspän...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Etablerade immunokemiska metoder för att mäta peptidtransmittrar in vivo förlitar sig på mikrodialys eller bulkvätskedragning för att erhålla provet för offlineanalys. Dessa lider dock av spatiotemporala begränsningar. Detta protokoll beskriver tillverkningen och tillämpningen av en kapacitiv immunoprobebiosensor som övervinner begränsningarna i de befintliga teknikerna.

Tidsupplöst in vivo-mätning av neuropeptiddynamik med kapacitiv immunprobe i svinhjärta

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Det är första gången en metod utvecklas för tidsupplöst mätning av peptidtransmitternivåer in vivo. Vi kan mäta peptidtransmitternivåer i enskilda försökspersoner och diskreta platser med analys i nära realtid. Skär först en 25 centimeter lång perfluoralkoxibelagd platinatråd.Sedan, med en skalpell, remsa cirka fem millimeter perfluoralkoxibeläggning från ena änden, var försiktig så att du inte skär i platinatråden. Sätt nu in den avskalade änden av platinatråden i en guldpläterad, en millimeter hankontaktstift. Använd sedan nåltången och krympa kontaktstiftets tänder runt den avskalade änden av platinatråden och löd platinatråden till den guldpläterade kontaktstiftet.Förbered sedan dopaminlösningen genom att tillsätta 50 milligram dopaminhydroklorid i 50 ml 10-millimolär PBS med pH sex och blanda genom omrörning. Efter att helt ha löst upp dopaminet, placera spetsen på platinatråden i kärlet som innehåller den nytillverkade dopaminkompletterade PBS. Anslut silverkloridskivans elektrod till jordkanalen i huvudsteget.Placera sedan silverkloridskivan i kärlet som innehåller dopaminkompletterad PBS och platinatråd. Innan du fortsätter, anslut en trådshunt till referenskanalerna i huvudsteget. Öppna den interaktiva datainsamlingsprogramvaran och ställ in ett sågat elektrodepositionskommandopotentialprotokoll genom att ställa in startpotentialen på minus 0,6 volt, slutpotentialen till 0,65 volt, skanningshastigheten vid 0,04 volt per sekund och depositionens varaktighet till 420 sekunder.Efter avslutad poly-dopaminavsättning, ta bort silverkloridjordpelleten och spetsen på platinatråden från kärlet. Placera trådspetsen i ett mikrorör som innehåller PBS med pH 7,4 i två till fem minuter och se till att trådspetsen inte kommer i kontakt med sidorna eller botten av mikroröret. Bered sedan antikroppslösningen genom att kombinera antikroppen av intresse med PBS med pH 7,4 i ett förhållande 1:20 i ett kärl av lämplig storlek.Blötlägg sedan den poly-dopaminavsatta spetsen på platinaelektroden i antikroppslösning i två timmar vid rumstemperatur, vilket säkerställer att platinatrådspetsen är suspenderad i lösning och inte vilar på mikrorörets inre yta. Placera den funktionella spetsen på det kapacitiva immunoproben i flödeskammaren, var noga med att inte störa elektrodens spets på något sätt, eftersom det kan skada sondens sensoriska spets. Innan det första experimentella testet, utför en TBS-standardkörning för att konditionera den kapacitiva immunoprobsonden, och för spänningsprotokollet, ställ in den positiva stegpotentialen till 110 millivolt, negativ stegpotential till minus fem millivolt, stegvaraktighet på 20 millisekunder och förvärvstid till 600 sekunder.Skapa sedan peptidlösningen av intresse med samma TBS för att upprätthålla superfusatets sammansättning. Ställ in ett grenrörssystem där superfusatet kan växlas mellan TBS och peptidkomptiduperad TBS. Använd TBS-standardparametrar och ställ in peptidavkänningsdataförvärvsprotokollet genom att ställa in varaktigheten för förvärvet till 360 sekunder.Innan poly-dopaminavsättningen, trä den exponerade spetsen på platinatrådelektroden genom en 22-gauge hypodermisk nål och lämna ungefär två millimeter bortom nålspetsen. Använd pincett och böj försiktigt spetsen på platinatrådelektroden för att skapa en tagg som hänger från änden av den hypodermiska nålen. Dra försiktigt ut nålen från taggspetsen och lämna tillräckligt med tråd att placera i kärlet utan att nålen kommer i kontakt med vätskan och fortsätt med dopaminavsättning som visats tidigare.Skölj nu den taggiga sondspetsen med PBS och placera den i antikroppslösningen. Ta sedan försiktigt bort den funktionaliserade spetsen från PBS. Flytta den hypodermiska nålen till den taggiga kapacitiva immunoproben och implantera den försiktigt i intresseområdet innan du ansluter guldkontaktstiftet till huvudsteget.När du har implanterat, dra ut den hypodermiska nålen och lämna elektroden på plats. Ett positivt steg i kommandopotentialen mäter den injektionsström som krävs för att klämma fast sondspänningen och möjliggör mätning av den kapacitiva strömmen. Det negativa kommandopotentialsteget rensar den bundna peptiden från antikroppen via elektrostatisk avstötning.Stegfunktionens kommandovågform avbildade den tidsupplösta iterativa detektionen och kvantifieringen av peptiden. Bottenspåret representerade kommandopotentialen och den resulterande strömmen under sondens superfusion i TBS. Det ekvilibrerade kapacitiva immunprobetet visade mindre initialt sönderfall och en stabil baslinje under sex minuter.Flödet av neuropeptid Y in i flödeskammaren ökade de kapacitiva strömmarna över baslinjen. Kapacitiva immunprobströmmar uppmätta med en neuropeptid Y-antikroppsfunktionaliserad sond visade en koncentrationsberoende signal känslig för neuropeptid Y Med låg pikomol Y För kalibrering mättes en standardkurva för alla testade koncentrationer. Stimuleringen av den bilaterala stellat ganglion visade förhöjd neuropeptid Y när den samordnades med de negativa kontrollkapacitiva strömmarna.Noradrenalinfrisättning mätt under stellatstimulering visade en synkron frisättning med neuropeptid Y, i överensstämmelse med ett framkallat sympatiskt svar. Utvecklingen av dessa tekniker kan ge intraoperativa avläsningar av nyckelmodulatorer för hjärtaktivitet, vilket ger potentiell snabb terapeutisk eller interventionell vägledning. Tekniken som presenteras här är specifik för kardiovaskulär distribution, men själva tekniken är lämplig för andra fysiologiska inställningar, såsom urin, skelettmuskulatur, njurar, fettvävnad, et cetera.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparameter Optisk Kartläggning av Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisera proteiner och Makromolekylär av negativa Stain EM: från Grid förberedelse till Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optisk Kartläggning av aktionspotentialer och transienter Kalcium i musen hjärta

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Förfarande för decellularisering av grishjärta genom retrograd koronarperfusionstrycket

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics för kemisk syntes och tidsupplöst Mekanistiska studier

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Styv inbäddning av fixeras och färgas, hela Millimeter-skala prover för avsnitt-gratis 3D histologi av mikro-datortomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...