Name: time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

İn vivo deneyler için uzman desteği için Dr. Olu Ajijola'ya (UCLA Kardiyak Aritmi Merkezi) teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH U01 EB025138 (JLA, CS) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (8. baskı, 2011) tarafından belirtilen yönergeleri izleyerek gerçekleştirilmiştir. Yaklaşık 75 kg'lık yetişkin erkek Yorkshire domuzları in vivo çalışmalar için kullanılmıştır10.
1. Kapasitif immünoprob üretimi ve işlevselleşti...

<ol>
	<li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Biomarkers+for+the+prevention,+assessment,+and+management+of+heart+failure:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li><li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+responses+to+stress.">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li><li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction.">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li><li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo.">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li><li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation.">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).</li><li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone.">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li><li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+neurocardiology:+development,+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease.">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li><li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y.">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).</li><li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs:+comparison+of+VIP,+PHI,+NPY,+CGRP,+and+NT.">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li><li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart.">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensors.">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedimetric+immunosensors-A+review.">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells.">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li><li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells.">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li><li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices.">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li><li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li><li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+recombinant+Ca(v)3.2,+T-type,+Ca(2+)+channel+currents+by+CaMKIIgamma(C).">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li><li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart.">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li><li>Chow, R. H., von R&#252;den, L., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile,+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating.">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).</li></ol>

Mevcut protokol, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda ilgilenilen biyobelirteçleri tespit edebilen ve ölçebilen kapasitif bir immünoprobun (CI probu) üretimini ve test edilmesini açıklamaktadır. Algılama, biyobelirtecin elektrot ucunda hapsedilmesiyle elde edilir. Yakalama olayı, bir platin tel kapasitif immünoprob ile çevresindeki iletken sıvı ortamı arasındaki kapasitif bağlantıyı değiştirir ve probun potansiyel bir kaymasına yanıt olarak yük akımında bir değişiklik olara...

Biyobelirteçlerin tespiti ve nicelleştirilmesi için çeşitli kimyasal yöntemler, hem protein kimyasında hem de klinik tanılarda, özellikle kanser tanılarında ve kardiyovasküler hastalık progresyonunun değerlendirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır. Günümüzde, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve kütle spektrometresi gibi yöntemler, toplu sıvı çekme yoluyla vasküler bölme 1,2,3'ten veya mikrodiyaliz ile interstisyel bölmeden numune toplanmasına dayanmaktadır. Mikrodiyaliz, ilgilenilen bir bölgeye yerleştirilen bilinen uzunlukta yarı geçirgen bir membran tüpü kullanır. Toplama sıvısı, analiz5 içinnumuneyi toplamak için birkaç dakika 4 boyunca tüpün içinden geçirilir, böylece zamansal çözünürlüğü sınırlar. Bu şekilde, toplanan örnekler sadece yerel mikro çevrenin zaman içinde ortalama bir değerini sağlar ve perfüzyon hızı ve yeterli numune hacminin toplanması ile sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntemler deneysel verilerin ve sinyal ortalamasının bir araya getirilmesini gerektirir; bu nedenle, denekler arasındaki değişkenliği hesaba katmayabilir. Daha da önemlisi, numune toplama ve sonraki çevrimdışı analiz arasındaki süre, acil klinik müdahale ve terapötikleri engellemektedir.
Mevcut protokolde, spesifik biyoaktif peptitlerin zamana bağlı elektriksel tespiti için kapasitif immünoprob biyosensörünün (CI probu) kullanımı özetlenmiştir. Vaskülatür, endokard, kardiyomiyositler ve intrakardiyak gangliyonları innerve eden post-gangliyonik sempatik nöronlardan salınan nöropeptit Y (NPY), kardiyovasküler sistemde majör bir nöromodülatör peptid vericisidir 6,7,8,9. Burada sunulan yöntem NPY'yi ölçmek için tasarlanmıştır ve deneysel fizibilite bir domuz kalp modelinde gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, seçici bir antikorun mevcut olduğu herhangi bir biyoaktif peptit için geçerlidir10. Bu yöntem, bir platin tel probu ile işlevselleştirilmiş uç11,12'deki iletken sıvı arasındaki kapasitif bağlantıya dayanır. Bu uygulamada, elektrot ucuna bağlanan ve iletken sıvı ortamına bakan hedef nöropeptide (NPY) karşı bir antikor aracılığıyla etkileşime aracılık edildi. Bu işlevselleştirme, reaktif polidopaminin platin tel probu10,13'ün ucuna elektrodepozisyonu ile sağlandı.
Antikor işlevselleştirilmiş prob in vivo olarak ilgi çekici bir bölgeye yerleştirildiğinde, uyarılmış endojen NPY salınımı prob ucundaki tutucu antikorlara bağlanmaya yol açar ve elektrot yüzeyindeki iletken sıvı NPY proteini tarafından yer değiştirir. Elektriksel ortamdaki lokal değişiklik, yüksek hareketlilikli, yüksek dielektrik sıvının hareketsiz, statik yüklü bir molekülle yer değiştirmesine neden olur. Bu, elektrot-akışkan arayüzünü ve dolayısıyla bir adım fonksiyonlu komut potansiyeline yanıt olarak yük akımındaki bir değişiklik olarak ölçülen kapasitansını değiştirir. Her bir ölçüm döngüsünün hemen ardından, bağlı NPY'yi elektrostatik etkileşim yoluyla antikordan itmek için negatif bir "sıfırlama" potansiyeli kullanılır, böylece sonraki ölçüm10 turları için antikor bağlanma bölgeleri temizlenir. Bu, NPY'nin zaman çözümlü bir şekilde ölçülmesine etkili bir şekilde izin verir. Benzersiz CI tekniği, veri havuzu oluşturmadan veya birkaç deney üzerinde sinyal ortalaması olmadan tek bir deneyden dinamik biyobelirteç seviyelerini ölçmek için yukarıda özetlenen mikrodiyaliz tabanlı immünokimyasal yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden gelir9 ve neredeyse gerçek zamanlı olarak veri sağlar. Ayrıca, bu yöntemi, zaman içinde çözülmüş ve lokalize bir ölçekte uygun bir antikorun bulunduğu herhangi bir biyobelirteç ile uyarlama yeteneği, hastalık progresyonunun değerlendirilmesi ve terapötik müdahalelerin yönlendirilmesi için immünokimyasal ölçümlerde önemli bir teknik ilerleme sağlamaktadır.
Veri toplama ve analiz yazılımı, IGOR Pro'da (tamamen etkileşimli bir yazılım ortamı) özel olarak yazılmıştır. Bir analogdan dijitale dönüştürücü (A/D) sistemi, bilgisayar kontrolü altında bir komut voltajı yayınladı ve özel bir amplifikatörden veri aldı. Amplifikatör bazı benzersiz özelliklere sahipti. Bunlar, elektrotun değişkenliğini entegre etmek için 1 MOhm veya 10 MOhm geri besleme voltajı kelepçesi devresinin seçilmesine izin veren dört edinme kanalının her biri için bir geri besleme direnci (değiştirilebilir) içeriyordu. Dört edinme kanalının tümü için tek bir kafaya ve karşılıklı topraklama / referans devresine sahip bir sahne ünitesi de cihazı göğsün yakınına tek bir fiziksel modüle yerleştirmek için inşa edildi. Bildirilen tüm verileri toplamak için 1 MOhm geri besleme direnci ayarı kullanılmıştır.
Filtre ve kazanç ayarları amplifikatörden telgrafla çekildi ve veri dosyasına kaydedildi. Veriler, 10 kHz'de sayısallaştırılmış 2 kutuplu analog Bessel filtresi ile 1 kHz'de filtrelendi. Prob ve çevresindeki iletken çözelti arasındaki potansiyel farkı, prob ucunda bir Helmholtz kapasitif tabaka oluşturur. Ligandın prob ucundaki antikora bağlanması, lokal yükün değişmesine ve dolayısıyla Helmholtz kapasitansında bir değişikliğe neden olur. Devrenin kapasitif bileşenindeki bu değişiklik, probu adım fonksiyonlu voltaj protokolündeki potansiyele getirmek için gereken enjekte edilen yükün büyüklüğünde bir kaymaya neden olur. Böylece, belirli bir ligandın işlevselleştirilmiş proba bağlanması, pik kapasitif akımda bir değişiklik olarak elektrot kapasitans ölçümünde bir değişikliğe neden olur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AgCl disc electrode</td>
			<td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td>
			<td>64-1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam, (Cambridge, MA)</td>
			<td>ab112473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom multichannel amplifier/ 1 M&#937; feedback resistor multichannel headstage</td>
			<td>NPI Electronic, (Tamm, Germany)</td>
			<td>NA</td>
			<td>Based on NPI VA-10M multichannel amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>H8502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold-plated male connector pin</td>
			<td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td>
			<td>6-66506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device</td>
			<td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data acquisition software, v. 7.08</td>
			<td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software driving command potential and data acquisition was custom written</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump</td>
			<td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated platinum wire</td>
			<td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td>
			<td>773000</td>
			<td>0.005&#8221; bare diameter, 0.008&#8221; coated diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic porcine NPY peptide</td>
			<td>Bachem (Torrance, CA)</td>
			<td>4011654</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved in vivo measurement of neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in porcine heart

Hastalığın ilerlemesinin değerlendirilmesi ile ilgili biyobelirteçleri in vivo olarak ölçme yeteneği, bilimsel ve tıbbi topluluklar için büyük ilgi çekicidir. Belirli biyobelirteçleri ölçmenin mevcut yöntemlerinden elde edilen sonuçların çözünürlüğü, hem mekansal hem de geçici olarak çözünürlükte sınırlı olabileceğinden elde edilmesi birkaç gün veya hafta sürebilir (örneğin, enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA], yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC] veya kütle spektrometrisi ile analiz edilen interstisyel sıvının sıvı bölmesi mikrodiyalizi); böylece zamanında tanı ve tedavi rehberlikleri bozulur. Bu çalışmada, kapasitif immünoprob biyosensörü (CI probu) kullanılarak peptid transmitterlerinin in vivo olarak saptanması ve ölçülmesi için benzersiz bir teknik bildirilmiştir. Bu probların üretim protokolü ve in vitro karakterizasyonu tanımlanmıştır. Sempatik stimülasyonla uyarılan nöropeptit Y (NPY) salınımının in vivo ölçümleri sağlanmaktadır. NPY salınımı referans olarak norepinefrin sempatik salınımı ile ilişkilidir. Veriler, nöropeptitlerin in vivo hızlı ve lokalize ölçümü için bir yaklaşım göstermektedir. Gelecekteki uygulamalar, hastalık progresyonunun intraoperatif gerçek zamanlı değerlendirmesini ve bu probların minimal invaziv kateter bazlı yayılımını içermektedir.

Elektrot üretimi ve karakterizasyonu Esnek bir kapasitif immünoprob (CI probları) üretildi ve Şekil 1A'da temsili bir görüntü tasvir edildi. Elektrot potansiyeli, bilgisayar kontrollü bir voltaj kelepçesi devresi tarafından ayarlandı (Şekil 1B) ve elektrot, PBS'de yapılan bir polidopamin çözeltisine daldırıldı. Polidopamin, işlevselleştirme için iletken elektrot ucu13 üzerine elektro-olarak yatı...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart at JoVE.com

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Peptit vericilerini in vivo olarak ölçmek için yerleşik immünokimyasal yöntemler, çevrimdışı analiz için numune almak üzere mikrodiyaliz veya dökme sıvı çekilmesine dayanır. Bununla birlikte, bunlar mekansal zamansal sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, mevcut tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelen kapasitif bir immünoprob biyosensörünün üretimini ve uygulanmasını açıklamaktadır.

Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Bu, peptid verici seviyelerinin in vivo olarak zamana bağlı ölçümü için ilk kez bir yöntem geliştirilmiştir. Tek deneklerdeki ve ayrık konumlardaki peptid verici seviyelerini neredeyse gerçek zamanlı analizlerle ölçebiliriz. İlk olarak, 25 santimetre uzunluğunda perfloroalkoksi kaplı platin tel kesin.Daha sonra, bir neşter kullanarak, platin teli kesmemeye dikkat ederek, bir ucundan yaklaşık beş milimetre perfloroalkoksi kaplamayı sıyırın. Şimdi, platin telin soyulmuş ucunu altın kaplamalı, bir milimetrelik erkek konektör pimine yerleştirin. Daha sonra, iğne burunlu pense kullanarak, konektör pimi dişlerini platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın ve platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin.Daha sonra, pH altı ile 50 mililitre 10 milimolar PBS'ye 50 miligram dopamin hidroklorür ekleyerek dopamin çözeltisini hazırlayın ve karıştırarak karıştırın. Dopamini tamamen çözdükten sonra, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Gümüş klorür disk elektrodunu baş aşamasındaki toprak kanalına bağlayın.Daha sonra, gümüş klorür diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin. Daha fazla ilerlemeden önce, baş sahnenin referans kanallarına bir tel şönt bağlayın. Etkileşimli veri toplama yazılımını açın ve Başlangıç potansiyelini eksi 0,6 volt, Bitiş potansiyelini 0,65 volt, Tarama hızını saniyede 0,04 volt ve Biriktirme süresini 420 saniye olarak ayarlayarak bir testere dişi elektro-biriktirme komutu potansiyel protokolü ayarlayın.Poli-dopamin birikimini tamamladıktan sonra, gümüş klorür öğütülmüş peleti ve platin telin ucunu damardan çıkarın. Tel ucunu iki ila beş dakika boyunca pH 7.4 PBS içeren bir mikrotüpe yerleştirin ve tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun. Daha sonra, ilgili antikoru pH 7.4 PBS ile uygun büyüklükte bir kapta 1:20 oranında birleştirerek antikor çözeltisini hazırlayın.Daha sonra, platin elektrodun poli-dopamin biriken ucunu oda sıcaklığında iki saat boyunca antikor çözeltisine batırın, platin tel ucunun çözelti içinde asılı kalmasını ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmamasını sağlayın. Kapasitif immünoprobun fonksiyonel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu hiçbir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak probun duyusal ucuna zarar verebilir. İlk deneysel testten önce, kapasitif immünoprob probunu koşullandırmak için TBS standart çalışmasını gerçekleştirin ve voltaj protokolü için pozitif adım potansiyelini 110 milivolta, negatif adım potansiyelini eksi beş milivolta, adım süresini 20 milisaniyeye ve edinme süresini 600 saniyeye ayarlayın.Daha sonra, süperfüzyonun bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptid çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun TBS ve peptid takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun. TBS standart parametrelerini kullanın ve edinme süresini 360 saniyeye ayarlayarak peptid algılama veri toplama protokolünü ayarlayın.Poli-dopamin birikiminden önce, platin tel elektrodunun açıkta kalan ucunu 22 gauge hipodermik bir iğneden geçirin ve iğnenin ucunun yaklaşık iki milimetre ötesinde bırakın. Forseps kullanın ve hipodermik iğnenin ucundan sarkan bir diken oluşturmak için platin tel elektrodunun ucunu hafifçe bükün. İğneyi dikenli uçtan yavaşça çekin, iğne sıvıya temas etmeden kaba yerleştirmek için yeterli tel bırakın ve daha önce gösterildiği gibi dopamin birikimine devam edin.Şimdi, dikenli prob ucunu PBS ile durulayın ve antikor çözeltisine yerleştirin. Ardından, işlevselleştirilmiş ucu PBS'den yavaşça çıkarın. Hipodermik iğneyi dikenli kapasitif immünoproba taşıyın ve altın konektör pimini baş aşamasına takmadan önce nazikçe ilgilenilen bölgeye implante edin.İmplante edildikten sonra, elektrodu yerinde bırakarak hipodermik iğneyi geri çekin. Komuta potansiyelindeki olumlu bir adım, prob voltajını sıkıştırmak için gereken enjeksiyon akımını ölçer ve kapasitif akımın ölçülmesini sağlar. Negatif komut potansiyel adımı, bağlı peptidi elektrostatik itme yoluyla antikordan temizler.Adım fonksiyonu komutu dalga formu, peptidin zamana bağlı yinelemeli tespitini ve nicelleştirilmesini tasvir etti. Alt iz, komut potansiyelini ve TBS'deki probun süperfüzyonu altında ortaya çıkan akımı temsil ediyordu. Dengeli kapasitif immünoprob, daha küçük başlangıç çürümesi ve altı dakika boyunca stabil bir taban çizgisi gösterdi.Nöropeptit Y'nin akış odasına akışı, kapasitif akımları taban çizgisi üzerinde arttırdı. Bir nöropeptit Y antikoru işlevselleştirilmiş prob ile ölçülen kapasitif immünoprob akımları, düşük pikomol nöropeptid Y'ye duyarlı konsantrasyona bağımlı bir sinyal gösterdi Kalibrasyon için, test edilen tüm konsantrasyonlar için standart bir eğri ölçüldü. Bilateral stellat ganglionun uyarılması, negatif kontrol kapasitif akımları ile birlikte çizildiğinde yüksek nöropeptid Y gösterdi.Stellat stimülasyonu altında ölçülen norepinefrin salınım, uyarılmış bir sempatik yanıt ile tutarlı olarak nöropeptit Y ile senkron bir salınım gösterdi. Bu tekniklerin geliştirilmesi, kardiyak aktivitenin anahtar modülatörlerinin intraoperatif okumalarını sağlayabilir, böylece potansiyel hızlı terapötik veya girişimsel rehberlik sağlayabilir. Burada sunulan teknik kardiyovasküler dağılım için spesifiktir, ancak tekniğin kendisi idrar, iskelet kası, böbrekler, yağ dokusu vb. gibi diğer fizyolojik ayarlar için uygundur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Kimyasal Sentez ve Zaman-çözülmesi Mekanistiksel Çalışmaları Millifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...