Protokolümüz, bir dizi optik mikroskopi tekniği kullanarak birçok sistemdeki dinamikleri ölçebilir. Bu yöntemin, özellikle, yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini karakterize etmeye nasıl yardımcı olabileceğini vurguluyoruz. Diferansiyel Dinamik Mikroskopi yazılım paketimizi kullanmanın temel avantajı, iyi belgelenmiş olması, birden fazla örnek analiz dosyasına sahip olması ve farklı dinamik türlerini incelemek için kolayca uyarlanabilmesidir.
Yazılım paketimiz sadece yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarında değil, aynı zamanda diğer yumuşak ve biyolojik olarak ilgili malzemelerde de dinamikleri ölçmek için kullanılabilir. Probun zaman ve uzunluk ölçeklerine bağlı olarak, Micro-Manager gibi mikroskop kontrol yazılımı kullanılarak 1.000'den fazla karelik görüntü dizileri elde edilir. PyDDM kod deposunda sağlanan örnekler klasörünün altında, example_parameter_file.yml adlı parametre dosyasının bir kopyasını oluşturun.
Bu EML dosyasını Notepad + gibi bir metin düzenleyicisiyle veya JupyterLab'daki metin düzenleyicisiyle açın. Kopyalanan EML dosyasında, analiz edilecek görüntü dizisine karşılık gelen veri dizinini ve dosya adını sağlayın. Meta veriler bölümünün altında, piksel boyutunu ve kare hızını belirtin.
Analiz parametresi bölümünün altında, DDM matrisinin hesaplanması için farklı gecikme sürelerinin sayısı ve en uzun gecikme süresi gibi parametreleri seçin. Montaj parametresi bölümünde DDM matrisinin veya ara saçılma işlevinin takılması hakkında, model ve model parametresinin adı, ilk tahmin, alt sınır ve üst sınır gibi ayrıntıları sağlayın. EML dosyasının dosya adını DDM çözümlemesine tam dosya yolu ile geçirerek çözümleme parametrelerindeki meta verileri sağlayarak DDM çözümleme sınıfının bir örneğini başlatın.
Alternatif olarak, meta verileri ve parametreleri Python sözlük veri yapısı olarak geçirin. DDM matrisini hesaplamak için işlevi çalıştırın. Döndürülen verileri, Xarray paketinde veri kümesi olarak depolanan ilişkili değişkenler ve meta verilerle inceleyin.
Ardından, PDF dosyası ve veri dizini olarak kaydedilen grafikleri ve şekilleri inceleyin. Bu grafiklerden biri, arka planın nasıl tahmin edildiğine ilişkin varsayılan yöntemi gösterir. Gerekirse, EML dosyasındaki parametre arka plan yöntemini kullanarak veya isteğe bağlı anahtar sözcük bağımsız değişkeni olarak DDM matrisini hesapla işlevine arka planın tahmin edildiği yöntemi değiştirin.
Görüntü meta verilerini ve sığdırma parametrelerini içeren EML dosyasının dosya adını ileterek DDM fit sınıfının bir örneğini başlatın. İşlev baskı montaj modellerini yürüterek kullanılabilir modelleri listeleyin. EML parametre dosyasında veya yeniden yükleme uygun modeli ada göre kullanarak kullanılacak modeli belirtin.
Seçilen modeldeki her parametre için, başlangıç tahminini ayarla ve parametre sınırlarını ayarla işlevlerini kullanarak EML dosyasında belirtilen değerlerden farklıysa başlangıç tahminlerini ve sınırlarını ayarlayın. İşlev uyumu ile uyumu gerçekleştirin. İşlev uyum raporuyla fit parametrelerinin q bağımlılığındaki uyumları incelemek için grafikler oluşturun.
DDM matrisini veya ISF'yi sığdırma ile birlikte dört q değerinde gösteren iki x iki alt grafiklerle şekil de dahil olmak üzere çıktıyı kontrol edin. DDM matrisini veya ISF'yi etkileşimli bir şekilde en uygun şekilde çizmek için Jupyter Notebook ortamında DDM uyumlarına göz atma sınıfını kullanın. Dalga sayısı grafiğine karşı bozunma süresindeki bir noktaya tıklamak, verileri ve uyumu gösterecektir.
Bir Xarray veri kümesine kaydedilen uyumun sonuçlarını kontrol edin ve bu veri yapısını diske kaydetmek için iki netCDF veya Python'un yerleşik turşu modülü işlevini kullanın. DDM analizi, bir vimentin ağındaki 0.6 mikron boncukların parlak alan görüntü serisi ve spektral olarak farklı floresan etiketlere sahip aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağından konfokal mikroskop görüntüleri üzerinde gerçekleştirildi. Ara saçılma fonksiyonları, farklı dalga sayılarında gecikme süresinin bir fonksiyonu ve 19 mikromolar ve 34 mikromolar vimentin konsantrasyonuna sahip bir ağ olarak çizildi.
Fonksiyonun sıfırın çok üzerinde bir değerdeki uzun gecikme süresi platosu, ergodisiteyi gösterir. Farklı vimentin konsantrasyonlarına sahip iki ağ için q'nun bir fonksiyonu olarak çizilen bozunma süresi tau, alt difüzyon veya sınırlı harekete işaret eder. 34 ve 49 mikromolar vimentin ile ağ için q karesinin bir fonksiyonu olarak çizilen ergodisite olmayan c parametreleri, c'nin kütüğünün sınırlı hareket için beklendiği gibi q karesi ile orantılı olduğunu göstermiştir.
Ortalama kareli yer değiştirmelere karşı gecikme süresi grafikleri, DDM'den belirlenen değerlerin, tek parçacık izleme yoluyla bulunanlarla iyi bir şekilde uyuştuğunu göstermiştir. Daha konsantre ağ için, değer daha uzun gecikme sürelerinde platolar. Aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağı için gecikme süresine karşı DDM matrisi, belirli bir q değeri için DDM matrisinin düşük gecikme zamanlarında bir platoya sahip olduğunu, daha sonra büyük gecikme zamanlarında daha da platolaştığını göstermiştir.
DDM matrisine uyumdan gelen karakteristik bozunma süreleri tau, tau ve q arasındaki ilişkinin balistik hareketi gösterdiğini göstermektedir. Bu PyDDM yazılım paketini geliştirdikten sonra, aktif sitoiskelet ağlarının ve diğer sistemlerin anizotropik ve zamanla değişen dinamiklerini araştırmak için kullandık.
