Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة ، K08135443 (Y.B) ، 1R01HL132991 (X.A).

كانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى ماساتشوستس العام. تم استخدام الفئران الذكور من النوع البري C57 / B6 ، التي يبلغ عمرها 8 أسابيع ، لهذه الدراسة.
1. التحضير التجريبي
<ol><li>إعداد حل العمل.<ol>
<li>قم بإعداد ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

يتضمن إعداد PCLS عدة خطوات حاسمة. أولا ، من الضروري تضخيم فص الرئة بشكل متجانس لتجنب اختلاف تصلب الأنسجة عن توزيع الأغاروز غير المتساوي. نظرا لأن الأغاروز السائل يتدفق بسرعة في القسطرة الرقيقة أو الشعب الهوائية عند درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، فإن عيب الملء الناتج في مجال الرئة البعيد يم?...

خلية العضلات الملساء (SMC) هي نوع رئيسي من الخلايا الهيكلية في الرئة ، وتقيم في المقام الأول في الجدار الإعلامي للممرات الهوائية والأوعية الرئوية. تتعاقد SMCs لتغيير العيار المضيء ، وبالتالي تنظيم تدفق الهواء والدم 1,2. لذلك ، فإن التنظيم الانقباضي ل SMCs ضروري للحفاظ على توازن تهوية الهواء والدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، يثير انقباض SMC الشاذ انسداد مجرى الهواء أو أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل الربو وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. ومع ذلك ، فقد واجه التقييم الوظيفي ل SMCs الرئة تحديا بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة الرئة ، وخاصة تلك الشعب الهوائية الصغيرة والأوعية الدقيقة في الجزء البعيد من الرئة 2,3. تلجأ الحلول الحالية إلى المقايسات غير المباشرة ، مثل قياس مقاومة تدفق الهواء بواسطة Flexivent لتعكس انقباض مجرى الهواء ، وفحص ضغط الدم الشرياني الرئوي عن طريق قسطرة القلب اليمنى لتقييم تقلص الأوعية الرئوية 4,5. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات غير المباشرة لها عيوب متعددة ، مثل الارتباك بسبب العوامل الهيكلية ، والفشل في التقاط التنوع المكاني للمجرى الهوائي أو الاستجابات الوعائية في مقياس الرئة بأكمله 6,7 ، وغير مناسب للدراسة الميكانيكية للتنظيم الانقباضي على المستوى الخلوي. لذلك ، تم تطبيق طرق بديلة باستخدام الخلايا الأولية المعزولة ، أو شرائط عضلات القصبة الهوائية / الشعب الهوائية 8,9 ، أو شرائح الأوعية الدموية الكبيرة10 لدراسة SMC في المختبر. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها قيود أيضا. على سبيل المثال ، فإن التكيف الظاهري السريع ل SMCs الأولية في حالة الثقافة11,12 يجعل من الصعب استقراء النتائج من زراعة الخلايا إلى إعدادات الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يمثل النمط الظاهري المقلص ل SMCs في مجرى الهواء القريب المعزول أو الأجزاء الوعائية SMCs في الرئة البعيدة 6,7. علاوة على ذلك ، يظل قياس قوة العضلات على مستوى الأنسجة منفصلا عن الأحداث الجزيئية والخلوية الضرورية للرؤية الميكانيكية لتنظيم الانقباض.
توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS)، وهي قسم أنسجة رئوية حية، أداة مثالية خارج الجسم الحي لتوصيف SMCs الرئوية في بيئة دقيقة قريبة من الجسم الحي (أي البنية والتفاعل متعدد الخلايا المحفوظة)13. منذ أن قدم الدكتوران بلاكي وفيشر لأول مرة إعداد شرائح الرئة من رئتي الفئران والهامستر المنفوخة بالأغاروز في1980s 14,15 ، تم تطوير هذه التقنية باستمرار لتزويد PCLSs بجودة أعلى وتنوع أكبر للبحوث الطبية الحيوية. أحد التحسينات الهامة هو تعزيز الحفاظ على الشرايين الرئوية عن طريق ضخ الجيلاتين بالإضافة إلى تضخم الرئة مع الأغاروز عبر القصبة الهوائية. ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كل من مجرى الهواء والشرايين الرئوية سليمة في PCLS لتقييم خارج الجسم الحي 16. علاوة على ذلك ، فإن PCLS قابل للتطبيق لفترة طويلة في الثقافة. على سبيل المثال ، لم يكن لدى PCLSs الفئران أي تغيير كبير في صلاحية الخلايا والتمثيل الغذائي لمدة لا تقل عن 12 يوما في الثقافة ، وكذلك احتفظت بانقباض مجرى الهواء لمدة تصل إلى 7 أيام17. بالإضافة إلى ذلك ، يحتفظ PCLS بممرات هوائية أو أوعية مختلفة الأحجام لفحوصات الانكماش والاسترخاء. علاوة على ذلك ، يمكن فحص إشارات Ca 2 + داخل الخلايا ل SMCs ، العامل المحدد لانقباض الخلايا ، باستخدام أصباغ مراسل Ca 2+ التي تم تصويرها بواسطة مجهر متحد البؤرة أو2-photon 13.
بالنظر إلى التطبيق المكثف لنموذج الماوس في أبحاث الرئة ، يتم وصف بروتوكول مفصل هنا لإعداد PCLS للفأر مع الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة لأبحاث الرئة خارج الجسم الحي . باستخدام PCLSs المعدة ، أوضحنا لاحقا كيفية تقييم استجابات مجرى الهواء والشرايين الرئوية للمحفزات الانقباضية أو المرخية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة تحميل PCLS بصبغة مراسل Ca2 + ثم تصوير إشارات Ca2 + ل SMCs المرتبطة بالاستجابات الانقباضية أو المرخية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

تتوسط خلايا العضلات الملساء (SMC) في تقلص مجرى الهواء والشريان داخل الرئة لتعديل مقاومة تدفق الهواء والدورة الدموية الرئوية ، على التوالي ، وبالتالي تلعب دورا حاسما في توازن الجهاز الرئوي. يساهم تحرير انقباض SMC في العديد من الأمراض الرئوية ، بما في ذلك الربو وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية الوصول إلى الأنسجة وعدم وجود أنظمة استزراع للحفاظ على الأنماط الظاهرية SMC في الجسم الحي ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء انقباض SMC غير المنظم في هذه الأمراض لا تزال محددة بالكامل. توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) نموذجا خارج الجسم الحي يتحايل على هذه الصعوبات التقنية. كقسم أنسجة رئوية حي ورقيق ، يحتفظ PCLS ب SMC في المناطق الطبيعية المحيطة ويسمح في الموقع بتتبع تقلص SMC وإشارات Ca2 + داخل الخلايا التي تنظم انقباض SMC. هنا ، يتم توفير بروتوكول إعداد PCLS مفصل للماوس ، والذي يحافظ على الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة. يتضمن هذا البروتوكول خطوتين أساسيتين قبل إخضاع فص الرئة للتقطيع: تضخيم مجرى الهواء باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار عبر القصبة الهوائية وملء الأوعية الرئوية بالجيلاتين من خلال البطين الأيمن. يمكن استخدام PCLS المعد باستخدام هذا البروتوكول للمقايسات الحيوية لتقييم تنظيم الانقباض بوساطة Ca2 + ل SMC في كل من مجرى الهواء ومقصورات الشرايين داخل الرئة. عند تطبيقه على نماذج الفئران لأمراض الجهاز التنفسي ، يمكن هذا البروتوكول من التحقيق الوظيفي ل SMC ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة على الآلية الأساسية لإزالة الانقباض SMC في الأمراض.

إعداد PCLS الماوس الحفاظ على الشعب الهوائية داخل الرئة سليمة والشرايين وقد لوحظت PCLS بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور المقلوب. في رئتي الفأر ، تكون الشعب الهوائية الموصلة مصحوبة بشرايين داخل الرئة ، تمتد من التلال إلى الرئة الطرفية. يظهر الشكل 2B حزمة تمثيلية...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.

استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

يدعم PCLS تقييم نشاط خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء والأوعية الدموية في بيئة أنسجة سليمة تقريبا ، وبالتالي توفير نموذج لا يقدر بثمن خارج الجسم الحي للأبحاث الرئوية. من حيث أبحاث العضلات الملساء ، تحافظ شرائح الرئة المقطوعة بدقة على النمط الظاهري لخلايا العضلات الملساء في الجسم الحي وتفاعلها مع الهياكل المحيطة مع السماح بالوصول إلى خلايا العضلات الملساء ، وهو أمر مهم لدراسة ميكانيكية على المستوى الخلوي. للبدء ، ضع جسم الماوس على لوحة تشريح في وضع ضعيف.قم بتثبيت الذيل والكفوف الأمامية والرأس باستخدام إبر حقنة 25G وقم بتعقيم الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول. افتح تجويف الصدر بعناية على طول القص والقفص الصدري السفلي الثنائي فوق الحجاب الحاجز. بعد ذلك، قم بتوجيه طرف المقص الحاد بعيدا عن أنسجة الرئة وقم بإزالة جزء من الأقفاص الصدرية البطنية الثنائية لفضح القلب.لاحظ أن فصوص الرئة تنهار عندما يفتح تجويف الصدر. استخدم المقص لإزالة الأنسجة الرخوة في عنق الفأر لفضح القصبة الهوائية. في الطرف العلوي من القصبة الهوائية ، قم بعمل ثقب صغير قطره 1.2 ملم من شأنه أن يسمح بمرور طرف قسطرة وريدية على شكل حرف Y 20G.قم بتوصيل منفذ محول واحد من القسطرة على شكل حرف Y بحقنة 3 ملليلتر معبأة مسبقا ب 0.5 ملليلتر من الهواء والمنفذ الآخر بحقنة 3 ملليلتر معبأة مسبقا بمحلول أغاروز 2 ملليلتر من محلول الأغاروز 1.5٪ الذي تم تسخينه إلى 42 درجة مئوية. حقن محلول الأغاروز لملء القسطرة ثم دفع القسطرة من خلال الفتحة إلى القصبة الهوائية إلى 5 إلى 8 ملم. حقن محلول الأغاروز ببطء بمعدل 1 ملليلتر لكل 5 ثوان.لاحظ أن الرئة تتوسع على طول المحور القريب إلى البعيد. أوقف الحقن عندما يتم تضخيم حافة كل فص رئة. ثم ، حقن 0.2 إلى 0.3 ملليلتر من الهواء من المحقنة الأخرى لدفع الأغاروز المتبقي إلى الشعب الهوائية الموصلة إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.أغلق كليب القصبة الهوائية بزوج من ملقط مرقئ منحني. لملء الأوعية الدموية الرئوية ، املأ حقنة 1 ملليلتر بالجيلاتين الدافئ بنسبة 6٪ وقم بتوصيلها بقسطرة وريد فروة الرأس بالإبرة. املأ القسطرة بمحلول الجيلاتين ثم ثقب البطين الأيمن بالقرب من الجدار السفلي بالإبرة.ادفع الإبرة لمدة 2 إلى 3 ملليمترات في البطين الأيمن ووجه طرف الإبرة إلى الشريان الرئوي الرئيسي. حقن ما يقرب من 0.2 ملليلتر من محلول الجيلاتين ببطء في البطين الأيمن والأوعية الشريانية الرئوية. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق بعد الحقن وقم بتبريد فصوص الرئة عن طريق سكب محلول HBSS البارد على القلب والرئة ووضع الجسم في الثلاجة.بعد هذه الخطوة ، قم بإزالة رئة الفأر والقلب من الأنسجة الضامة المحيطة بالمقص. ثم افصل كل فص رئوي واحتفظ به في محلول HBSS على الجليد. قم بتقليم فص الرئة وتوجيهه بحيث يكون اتجاه القطع عموديا على معظم الشعب الهوائية من الهلة إلى سطح الرئة.قم بإرفاقه أعلى عمود العينة باستخدام الغراء الفائق. استخدم اهتزازا مع شفرة حلاقة رقيقة جديدة لقطع فص الرئة إلى شرائح 150 ميكرومتر. اجمع الشرائح في أطباق بتري معقمة معبأة مسبقا بمحلول HBSS البارد.انقل الشرائح إلى أطباق بتري المليئة بوسط ثقافة DMEM / F-12. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل التجارب. ضع شريحة رئوية واحدة مقطوعة بدقة في كل بئر من لوحة زراعة 24 بئرا مملوءة ب HBSS.حدد موقع الشريحة في منتصف البئر ثم قم بإزالة محلول HBSS باستخدام ماصة. تحت المجهر ، ابحث عن مجرى الهواء المستهدف والسفينة في الشريحة ثم قم بتغطيتها باستخدام شبكة نايلون مع ثقب مركزي مسبق القطع لفضح منطقة وعاء مجرى الهواء المستهدف. ضع غسالة معدنية مجوفة فوق الشبكة لتثبيت الشرائح في مكانها.ثم أضف 600 ميكرولتر من محلول HBSS لغمر الشرائح. بعد 10 دقائق، سجل الصور الأساسية. للحث على مجرى الهواء أو تقلص الأوعية الدموية ، قم بإزالة محلول HBSS بحذر باستخدام ماصة وإضافة 600 ميكرولتر من HBSS باستخدام ناهض.لإعداد المخزن المؤقت لتحميل صبغة الكالسيوم ، قم أولا بإذابة 50 ميكروغرام من الصبغة مع 10 ميكرولترات من DMSO و 0.2 جرام من مسحوق Pluronic F-12 في 1 ملليلتر من DMSO. امزج 10 ميكرولترات من محلول Pluronic مع 10 ميكرولترات من محلول صبغة الكالسيوم. أضف هذا الخليط إلى 2 ملليلتر من محلول HBSS الذي يحتوي على 200 ميكرومولار من السلفوبروموفثالين.ثم ، ضع 15 شريحة رئوية مقطوعة بدقة في 2 ملليلتر من مخزن الكالسيوم المخزن المؤقت للتحميل واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، تليها الحضانة في HBSS التي تحتوي على 100 ميكرومولار سلفوبروموفثالين لمدة 30 دقيقة. ثم ، ضع شرائح محملة بصبغة الكالسيوم على كوب غطاء كبير. املأ شحوم السيليكون عالية الفراغ في حقنة سعة 3 ملليلتر متصلة بإبرة حادة 18G أو طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وارسم خطين متوازيين عبر زجاج الغطاء ، أعلى وأسفل الشريحة.غطي الشريحة باستخدام شبكة نايلون بين خطين من الشحوم. ضع زجاج الغطاء الثاني فوق الشبكة لإنشاء غرفة. أضف HBSS أو محلول ناهض إلى الغرفة من طرف واحد باستخدام ماصة.قم بإزالة السائل من الغرفة عن طريق الشفط من الطرف الآخر باستخدام المناديل الورقية. غرفة الشريحة جاهزة الآن لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر عالي السرعة. لوحظت حزم شريان مجرى الهواء الرئوي في شرائح رئوية مقطوعة بدقة بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور.في حالة الراحة ، تم تحديد مجرى الهواء بواسطة الخلايا الظهارية المكعبة مع الشريان الرئوي القريب. بعد التعرض للميثاكولين ، تم تقليل المنطقة المضيئة بينما لم يظهر الشريان الرئوي أي استجابة للمحفزات. تم تحديد استجابات انقباض مجرى الهواء كميا من خلال النسبة المئوية لانخفاض المساحة المضيئة وأظهرت استجابات مماثلة تعتمد على الجرعة في مزارع يوم واحد وخمسة أيام.عند الوصول إلى حقل الرئة المحيطي ، تتفرع الشعب الهوائية الموصلة إلى القنوات التنفسية والأكياس المحيطة بالشرايين الصغيرة داخل الأسينار. عند التعرض للبطانة ، تنقبض كل من الشعب الهوائية والشرايين الرئوية ، والتي يتبعها الاسترخاء الناجم عن NOC-5. في حالة الراحة ، أظهرت الشرائح المحملة بصبغة الكالسيوم تألقا منخفضا في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء ونظام الأوعية الدموية تحت المجهر الفلوري البؤري.عند التعرض للناهضات ، ارتفعت شدة تألق الكالسيوم في الخلايا وانتشرت إلى الخلية بأكملها ، والتي ارتبطت بالإشارات المتذبذبة. من الناحية التقنية ، من الضروري تضخيم الرئة باستخدام الأغاروز بشكل متجانس وتجنب حقن الأغاروز السريع أو المفرط. ادفع الهواء دائما في النهاية لطرد الأغاروز من مجرى الهواء الموصل إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.باختصار ، باستخدام ثقافة شرائح الرئة المقطوعة بدقة ، يمكن للمرء أن يوفر مجموعة خاصة من وظائف العضلات الملساء الرئوية ونمذجة تحرير العضلات الملساء في المختبر. كما أنه يوفر منصة مثالية لفحص الأدوية الموسعة للأوعية الدموية أو الموسعة للشعب الهوائية.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

زرع القصبة الهوائية ومنتبذ مثلي في الفئران المستخدمة كنماذج لدراسة الأمراض تنمية إيرواي مسد

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...