Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af NIH-tilskud, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Vildtype C57/B6 hanmus, 8 uger gamle, blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Eksperimentel forberedelse
<ol><li>Forbered arbejdsløsningen.<ol>
<li>Forbered 1x Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS, med Ca2+ og Mg2+, og pH afbalanceret med 20 mM HEPES, se Materialetabel). Brug HBSS-løsningen t...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

Forberedelsen af PCLS involverer flere kritiske trin. For det første er det vigtigt at blæse lungeloben homogent for at undgå variation af vævsstivhed fra ujævn agarosefordeling. Da den flydende agarose hurtigt gelerer i tynde katetre eller luftveje ved en temperatur under 37 ° C, kan den resulterende påfyldningsfejl i det distale lungefelt øge forskellen i lungevævsstivhed og forårsage vævsrivning under vibratomsektionen. Derfor kan det praktiseres at holde den lavsmeltende agaroseopløsning ved 42 ° C i et ...

Glat muskelcelle (SMC) er en vigtig strukturel celletype i lungen, der primært befinder sig i medievæggen i luftveje og lungekar. SMC'er indgår kontrakt om at ændre luminalkaliberen og dermed regulere luft og blodgennemstrømning 1,2. Derfor er kontraktil regulering af SMC'er afgørende for at opretholde homeostase af luftventilation og lungecirkulation. I modsætning hertil fremkalder afvigende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvejs- eller lunge vaskulære sygdomme som astma og pulmonal arteriel hypertension. Den funktionelle vurdering af lunge-SMC'er er imidlertid blevet udfordret af begrænset adgang til lungevævet, især de små luftveje og mikrofartøjer i den distale del af lungen 2,3. Nuværende løsninger anvender indirekte assays, såsom måling af luftstrømsmodstand af Flexivent for at afspejle luftvejsforsnævring og kontrol af lungearterielt blodtryk ved højre hjertekateterisering for at vurdere lungevaokontraktion 4,5. Disse indirekte assays har imidlertid flere ulemper, såsom at være forvirret af strukturelle faktorer, undlade at fange den rumlige mangfoldighed af luftvejs- eller vaskulære reaktioner i hele lungeskalaen 6,7 og uegnet til den mekanistiske undersøgelse af kontraktil regulering på celleniveau. Derfor er alternative tilgange ved hjælp af isolerede primære celler, luftrør / bronchi muskelstrimler 8,9 eller store vaskulære segmenter10 blevet anvendt til SMC-undersøgelsen in vitro. Ikke desto mindre har disse metoder også begrænsninger. For eksempel gør en hurtig fænotypisk tilpasning af primære SMC'er i kulturtilstanden11,12 det problematisk at ekstrapolere fund fra cellekultur til in vivo-indstillinger. Desuden repræsenterer den kontraktile fænotype af SMC'er i de isolerede proksimale luftvejs- eller vaskulære segmenter muligvis ikke SMC'erne i den distale lunge 6,7. Desuden forbliver muskelkraftmålingen på vævsniveau adskilt fra molekylære og cellulære begivenheder, der er afgørende for mekanistisk indsigt i kontraktil regulering.
Præcisionsskåret lungeskive (PCLS), en levende lungevævssektion, giver et ideelt ex vivo-værktøj til at karakterisere lunge-SMC'er i et nær in vivo-mikromiljø (dvs. bevaret multicellulær arkitektur og interaktion)13. Siden Dr. Placke og Fisher først introducerede fremstillingen af lungeskiver fra agaroseoppustede rotte- og hamsterlunger i 1980'erne 14,15, er denne teknik blevet avanceret kontinuerligt for at give PCLS'er højere kvalitet og større alsidighed til biomedicinsk forskning. En væsentlig forbedring er forbedringen af lungearteriel konservering ved gelatineinfusion ud over lungeinflation med agarose via luftrøret. Som følge heraf holdes både luftvejene og lungearterierne intakte i PCLS til ex vivo-vurdering 16. Desuden, PCLS er levedygtig i længere tid i kultur. For eksempel havde mus PCLS'er ingen signifikant ændring i cellelevedygtighed og metabolisme i mindst 12 dage i kultur, såvel som de bevarede luftvejskontraktilitet i op til 7 dage17. Derudover, PCLS holder luftveje eller skibe i forskellige størrelser til sammentræknings- og afslapningsassays. Desuden kan intracellulær Ca2+ signalering af SMC'er, den afgørende faktor for cellekontraktilitet, analyseres med Ca2+ reporterfarvestoffer afbildet af et konfokalt eller 2-fotonmikroskop13.
I betragtning af den omfattende anvendelse af musemodellen i lungeforskning, en detaljeret protokol er beskrevet her til forberedelse af mus PCLS med intakte luftveje og intrapulmonale arterier til ex vivo lungeforskning. Ved hjælp af de forberedte PCLS'er demonstrerede vi efterfølgende, hvordan man evaluerer luftvejene og lungearterielle reaktioner på snærende eller afslappende stimuli. Derudover beskrives metoden til indlæsning af PCLS med Ca2+ reporterfarvestof og derefter billeddannelse ca2+ signalering af SMC'er forbundet med kontraktile eller afslappende reaktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrækningen af luftvejene og den intrapulmonale arterie for at ændre henholdsvis luftstrømsmodstand og lungecirkulation og spiller dermed en kritisk rolle i lungesystemets homeostase. Deregulering af SMC-kontraktilitet bidrager til flere lungesygdomme, herunder astma og pulmonal hypertension. På grund af begrænset vævsadgang og mangel på kultursystemer til opretholdelse af in vivo SMC-fænotyper forbliver molekylære mekanismer, der ligger til grund for den deregulerede SMC-kontraktilitet i disse sygdomme, imidlertid fuldt identificeret. Den præcisionsskårne lungeskive (PCLS) tilbyder en ex vivo-model , der omgår disse tekniske vanskeligheder. Som en levende, tynd lungevævssektion bevarer PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillader in situ-sporing af SMC-sammentrækning og intracellulær Ca2+ signalering, der regulerer SMC-kontraktilitet. Her leveres en detaljeret mus PCLS-forberedelsesprotokol, som bevarer intakte luftveje og intrapulmonale arterier. Denne protokol involverer to væsentlige trin, før lungeloben udsættes for udskæring: oppustning af luftvejene med lavsmeltepunktsagarose gennem luftrøret og påfyldning af lungekar med gelatine gennem højre ventrikel. PCLS udarbejdet ved hjælp af denne protokol kan bruges til bioassays til at evaluere Ca2 + -medieret kontraktil regulering af SMC i både luftvejene og de intrapulmonale arterielle rum. Når den anvendes på musemodeller af luftvejssygdomme, muliggør denne protokol den funktionelle undersøgelse af SMC og giver derved indsigt i den underliggende mekanisme for SMC-kontraktilitetsderegulering i sygdomme.

Mus PCLS-præparat, der bevarer intakte intrapulmonale luftveje og arterier En 150 μm tyk PCLS blev observeret under det omvendte fasekontrastmikroskop. I musens lunger ledsages ledende luftveje af intrapulmonale arterier, der løber fra hilus til den perifere lunge. Et repræsentativt lungeluftvejsarteriebundt i en mus PCLS er vist i figur 2B. Luftvejene kan let identificeres ved hjælp af kuboidale epitelceller med aktiv cilial slag, der forer den indre overflade af lu...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Den nuværende protokol beskriver forberedelse og anvendelse af musepræcisionsskårne lungeskiver til at vurdere luftvejene og intrapulmonal arteriel glat muskelkontraktilitet i et næsten in vivo miljø.

Brug af den præcisionsskårne lungeskive til at studere den kontraktile regulering af luftveje og intrapulmonal arteriel glat muskel

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS understøtter vurderingen af luftvejs- og vaskulær glat muskelcelleaktivitet i et næsten intakt vævsmiljø og giver derved en uvurderlig ex vivo-model til lungeforskning. Med hensyn til glat muskelforskning bevarer de præcisionsskårne lungeskiver in vivo-fænotypen af glatte muskelceller og deres interaktion med omgivende strukturer, samtidig med at de giver adgang til glat muskelcelle, hvilket er vigtigt for en mekanistisk undersøgelse på celleniveau. Til at begynde med skal du placere musekroppen på et dissektionsbræt i liggende stilling.Fastgør halen, forpoterne og hovedet med 25G sprøjtenåle, og desinficer kroppen med 70% ethanol. Åbn brysthulen forsigtigt langs brystbenet og bilateralt ringere ribbenbur over membranen. Peg derefter den skarpe saksespids væk fra lungevævet og fjern en del af de bilaterale ventrale brystkasser for at udsætte hjertet.Bemærk, at lungeloberne kollapser, når brysthulen åbner. Brug en saks til at fjerne blødt væv i musehalsen for at udsætte luftrøret. I den øvre ende af luftrøret laves et lille hul med diameter 1,2 millimeter, der skal tillade passage af en 20G Y-formet IV kateterspids.Tilslut den ene adapterport på det Y-formede kateter med en 3 ml sprøjte fyldt med 0,5 ml luft og den anden port med en 3 milliliter sprøjte fyldt med 2 ml 1,5% agaroseopløsning opvarmet til 42 grader Celsius. Injicer agaroseopløsning for at fylde kateteret, og skub derefter kateteret gennem åbningen ind i luftrøret til 5 til 8 millimeter. Injicer langsomt agaroseopløsningen med en hastighed på 1 ml pr. 5 sekunder.Bemærk, at lungen udvider sig langs den proksimale til distale akse. Stop injektionen, når kanten af hver lungelap er oppustet. Injicer derefter 0,2 til 0,3 ml luft fra den anden sprøjte for at skubbe den resterende agarose ind i ledende luftveje til det distale alveolrum.Klip lukkede luftrøret med et par buede hæmostatiske tang. For at udfylde lungevaskulaturen skal du fylde en 1 milliliter sprøjte med varm 6% gelatine og forbinde den til et nålehovedbundsvenekateter. Fyld kateteret med gelatineopløsning og punkter derefter højre ventrikel tæt på den ringere væg med nålen.Skub nålen i 2 til 3 millimeter ind i højre ventrikel og peg nålespidsen mod hovedpulmonalarterien. Injicer ca. 0,2 ml gelatineopløsning langsomt i højre ventrikel og lungearteriekar. Hold nålen på plads i fem minutter efter injektion og afkøl lungeloberne ved at hælde iskold HBSS-opløsning på hjertet og lungen og læg kroppen i køleskab.Efter dette trin skal du fjerne muselungen og hjertet fra omgivende bindevæv med en saks. Adskil derefter hver lungelap og opbevar dem i HBSS-opløsning på is. Trim lungelappen og orienter den således, at skæreretningen er vinkelret på de fleste luftveje fra hila til lungeoverfladen.Fastgør den oven på prøvekolonnen med superlim. Brug en vibratom med et frisk tyndt barberblad til at skære lungelappen i 150 mikrometer skiver. Saml skiverne i sterile petriskåle fyldt med kold HBSS-opløsning.Overfør skiverne til petriskåle fyldt med DMEM/F-12 kulturmedium. Placer opvasken i en 37 grader Celsius inkubator natten over før forsøgene. Anbring en enkelt præcisionsskåret lungeskive i hver brønd af en 24 brøndkulturplade fyldt med HBSS.Find skiven midt i brønden, og fjern derefter HBSS-opløsningen med en pipette. Under et mikroskop skal du finde målluftvejen og fartøjet i skiven og derefter dække det ved hjælp af et nylonnet med et forskåret centralt hul for at udsætte det målrettede luftvejsfartøjsområde. Sæt en hul metalskive oven på masken for at holde skiverne på plads.Tilsæt derefter 600 mikroliter HBSS-opløsning for at nedsænke skiverne. Efter 10 minutter skal du optage de grundlæggende billeder. For at inducere luftvejene eller vaskulær sammentrækning skal du forsigtigt fjerne HBSS-opløsningen med en pipette og tilsætte 600 mikroliter HBSS med en agonist.For at forberede calciumfarvestofbelastningsbufferen opløses først 50 mikrogram farvestof med 10 mikroliter DMSO og 0,2 gram Pluronic F-12 pulver i 1 milliliter DMSO. Bland 10 mikroliter af den pleuroniske opløsning med 10 mikroliter calciumfarvestofopløsning. Denne blanding tilsættes til 2 ml HBSS-opløsning indeholdende 200 mikromolar sulfobromphthalein.Placer derefter 15 præcisionsskårne lungeskiver i 2 ml calciumbelastningsbuffer og inkuberes ved 30 grader Celsius i en time efterfulgt af inkubation i HBSS indeholdende 100 mikromolar sulfobromophthalein i 30 minutter. Placer derefter calciumfarvestofbelastede skiver på et stort dækglas. Fyld silikonefedt med høj vakuum i en 3 ml sprøjte fastgjort til 18 G stump nål eller en 200 mikroliter pipettespids og tegn to parallelle linjer over dækglasset, over og under skiven.Dæk skiven med et nylonnet mellem to fedtlinjer. Placer det andet dækglas oven på masken for at generere et kammer. Tilsæt HBSS eller en agonistopløsning i kammeret fra den ene ende med en pipette.Fjern væsken fra kammeret ved at suge fra den anden ende med silkepapir. Skivens kammer er nu klar til calcium billeddannelse med et højhastigheds laserscanning konfokal mikroskop. Lungeluftvejsarteriebundter blev observeret i præcisionsskårne lungeskiver med tykkelse 150 mikrometer under et fasekontrastmikroskop.I hviletilstand blev en luftvej identificeret af kuboide epitelceller med en nærliggende lungearterie. Efter eksponering for methacholin blev luminalområdet reduceret, mens lungearterien ikke viste noget respons på stimuli. Luftvejskontraktile reaktioner blev kvantificeret ved procentdelen af luminal områdereduktion og viste lignende dosisafhængige reaktioner i en dag og fem dages kulturer.Når de når det perifere lungefelt, forgrener de ledende luftveje sig i åndedrætskanaler og sække, der omgiver de små intra-acinar arterioler. Når de udsættes for endotel, indsnævres både luftveje og lungearterier, hvilket efterfølges af NOC-5-induceret afslapning. I hviletilstand viste de calciumfarvestofbelastede skiver lav fluorescens i de glatte muskelceller i luftvejene og vaskulærsystemet under et konfokalt fluorescerende mikroskop.Ved eksponering for agonister forhøjede calciumfluorescensintensiteten i cellerne og forplantede sig til hele cellen, hvilket korrelerede med de oscillerende signaler. Teknisk set er det vigtigt at blæse lungen op med agarose homogent og undgå hurtig eller overdreven agaroseinjektion. Skub altid luft i slutningen for at skylle agarosen fra den ledende luftvej til det distale alveolrum.Sammenfattende kan man ved hjælp af den præcisionsskårne lungeskivekultur tilvejebringe et særligt udvalg af lungeglatte muskelfunktioner og modellere den glatte muskelderegulering in vitro. Det giver også en ideel platform til at screene novo vasodilatoriske eller bronkodilatator medicin.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Påvisning af nitrogenoxid og superoxid Radical anion ved elektron paramagnetisk resonans-spektroskopi fra celler under anvendelse Spin Fælder

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Udforskning arteriernes glatte muskulatur Kv7 kaliumkanal Funktion hjælp Patch Clamp Elektrofysiologi og Pressure Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling af Glat muskel funktion i den isolerede vævsbad-ansøgninger til Farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...