Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Massachusetts General Hospital. Wild-type C57/B6 mannelijke muizen, 8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Experimentele voorbereiding
<ol><li>Bereid de werkoplossing voor.<ol>
<li>Bereid 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, met Ca2+ en Mg2+, en pH gebalanceerd met 20 mM HEPES, zie Materiaaltabel)....

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

De voorbereiding van PCLS omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het essentieel om de longkwab homogeen op te blazen om de variatie van weefselstijfheid door ongelijke agaroseverdeling te voorkomen. Aangezien de vloeistof snel in dunne katheters of luchtwegen gels bij een temperatuur onder 37 °C, kan het resulterende vuldefect in het distale longveld de ongelijkheid van longweefselstijfheid vergroten en weefselscheuren veroorzaken tijdens de vibratomsectie. Daarom kan worden geoefend om de laagsmeltende aga...

Gladde spiercel (SMC) is een belangrijk structureel celtype in de longen, voornamelijk woonachtig in de mediawand van luchtwegen en longvaten. SMC's trekken samen om het luminale kaliber te veranderen, waardoor de lucht- en bloedstroomwordt geregeld 1,2. Daarom is contractiele regulatie van SMC's essentieel om de homeostase van luchtventilatie en pulmonale circulatie te behouden. Afwijkende SMC-contractiliteit daarentegen veroorzaakt obstructieve luchtweg- of pulmonale vaatziekten zoals astma en pulmonale arteriële hypertensie. De functionele beoordeling van long-SMC's is echter uitgedaagd door beperkte toegang tot het longweefsel, met name die kleine luchtwegen en microvessels in het distale deel van de long 2,3. Huidige oplossingen nemen hun toevlucht tot indirecte testen, zoals het meten van luchtstroomweerstand door Flexivent om luchtwegvernauwing te weerspiegelen, en het controleren van pulmonale arteriële bloeddruk door rechterhartkatheterisatie om pulmonale vasocontractie te beoordelen 4,5. Deze indirecte testen hebben echter meerdere nadelen, zoals verward worden door structurele factoren, het niet vastleggen van de ruimtelijke diversiteit van luchtweg- of vasculaire reacties in de hele longschaal 6,7, en ongeschikt voor de mechanistische studie van contractiele regulatie op cellulair niveau. Daarom zijn alternatieve benaderingen met behulp van geïsoleerde primaire cellen, luchtpijp /bronchiën spierstrips 8,9 of grote vasculaire segmenten10 toegepast voor de SMC-studie in vitro. Toch hebben deze methoden ook beperkingen. Een snelle fenotypische aanpassing van primaire SMC's in de kweekconditie11,12 maakt het bijvoorbeeld problematisch om bevindingen uit celcultuur naar in vivo instellingen te extrapoleren. Bovendien vertegenwoordigt het contractiele fenotype van SMC's in de geïsoleerde proximale luchtweg- of vasculaire segmenten mogelijk niet de SMC's in de distale long 6,7. Bovendien blijft de spierkrachtmeting op weefselniveau losgekoppeld van moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die essentieel zijn voor mechanistisch inzicht in contractiele regulatie.
Precision-cut lung slice (PCLS), een levend longweefselgedeelte, biedt een ideaal ex vivo hulpmiddel om pulmonale SMC's te karakteriseren in een bijna in vivo micro-omgeving (d.w.z. bewaarde multicellulaire architectuur en interactie)13. Sinds Drs. Placke en Fisher voor het eerst de bereiding van longplakken van agarose-opgeblazen ratten- en hamsterlongen introduceerden in de jaren1980 14,15, is deze techniek voortdurend geavanceerd om PCLS'en te voorzien van hogere kwaliteit en grotere veelzijdigheid voor biomedisch onderzoek. Een belangrijke verbetering is de verbetering van pulmonale arteriële conservering door gelatine-infusie naast longinflatie met agarose via de luchtpijp. Als gevolg hiervan worden zowel de luchtweg als de longslagader intact gehouden in de PCLS voor ex vivo beoordeling16. Bovendien is de PCLS levensvatbaar voor een langere tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, muis PCLS'en hadden geen significante verandering in de levensvatbaarheid van de cel en het metabolisme gedurende minimaal 12 dagen in cultuur, evenals, ze behielden de contractiliteit van de luchtwegen gedurende maximaal 7 dagen17. Bovendien houdt PCLS luchtwegen of bloedvaten van verschillende grootte bij voor contractie- en ontspanningstests. Bovendien kan intracellulaire Ca2+ signalering van SMC's, de determinante factor van celcontractiliteit, worden getest met Ca2+ reporterkleurstoffen afgebeeld door een confocale of 2-fotonenmicroscoop13.
Gezien de uitgebreide toepassing van het muismodel in longonderzoek, wordt hier een gedetailleerd protocol beschreven voor het voorbereiden van muis PCLS met intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders voor ex vivo longonderzoek. Met behulp van de voorbereide PCLS'en hebben we vervolgens aangetoond hoe we de luchtweg- en pulmonale arteriële reacties op vernauwende of ontspannende stimuli kunnen evalueren. Daarnaast wordt ook de methode beschreven om de PCLS te laden met Ca2+ reporterkleurstof en vervolgens Ca2+ signalering van SMC's geassocieerd met contractiele of relaxante reacties in beeld te brengen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Gladde spiercellen (SMC) bemiddelen de samentrekking van de luchtwegen en de intrapulmonale slagader om respectievelijk de luchtstroomweerstand en de pulmonale circulatie te wijzigen, waardoor ze een cruciale rol spelen in de homeostase van het longsysteem. Deregulering van SMC-contractiliteit draagt bij aan verschillende longziekten, waaronder astma en pulmonale hypertensie. Vanwege de beperkte toegang tot weefsel en een gebrek aan kweeksystemen om in vivo SMC-fenotypen te behouden, blijven moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gedereguleerde SMC-contractiliteit bij deze ziekten echter volledig geïdentificeerd. De precision-cut lung slice (PCLS) biedt een ex vivo model dat deze technische problemen omzeilt. Als een levende, dunne longweefselsectie behoudt de PCLS SMC in een natuurlijke omgeving en maakt het in situ tracking van SMC-contractie en intracellulaire Ca2 + -signalering mogelijk die de SMC-contractiliteit reguleert. Hier wordt een gedetailleerd PCLS-voorbereidingsprotocol voor muizen verstrekt, dat intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders behoudt. Dit protocol omvat twee essentiële stappen voordat de longkwab aan snijwonden wordt onderworpen: het opblazen van de luchtweg met laagsmeltpunt agarose door de luchtpijp en het vullen van longvaten met gelatine door de rechter ventrikel. De PCLS bereid met behulp van dit protocol kan worden gebruikt voor bioassays om Ca2+-gemedieerde contractiele regulatie van SMC in zowel de luchtwegen als de intrapulmonale arteriële compartimenten te evalueren. Toegepast op muismodellen van luchtwegaandoeningen maakt dit protocol het functioneel onderzoek van SMC mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende mechanisme van SMC-contractiliteitsderegulatie bij ziekten.

Pcls-preparaat bij muizen met behoud van intacte intrapulmonale luchtwegen en slagaders Een 150 μm dikke PCLS werd waargenomen onder de omgekeerde fase-contrastmicroscoop. In muizenlongen gaan geleidende luchtwegen gepaard met intrapulmonale slagaders, die van de hilus naar de perifere long lopen. Een representatieve pulmonale luchtweg-slagaderbundel in een muis PCLS is weergegeven in figuur 2B. De luchtweg kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door kubusvormige epithe...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

De PCLS ondersteunt de beoordeling van de activiteit van luchtweg- en vasculaire gladde spiercellen in een bijna intacte weefselomgeving, waardoor een waardevol ex vivo model voor longonderzoek wordt geboden. In termen van onderzoek naar gladde spieren behouden de nauwkeurig gesneden longplakken het in vivo fenotype van gladde spiercellen en hun interactie met omliggende structuren terwijl ze toegang bieden tot gladde spiercellen, wat belangrijk is voor een mechanistische studie op cellulair niveau. Plaats om te beginnen het muislichaam op een snijplank in rugligging.Pin de staart, voorpoten en kop vast met 25G spuitnaalden en ontsmet het lichaam met 70% ethanol. Open de borstholte voorzichtig langs het borstbeen en bilaterale inferieure ribbenkast boven het diafragma. Richt vervolgens de scherpe schaarpunt weg van het longweefsel en verwijder een deel van de bilaterale ventrale ribbenkasten om het hart bloot te leggen.Merk op dat de longlobben instorten wanneer de borstholte opengaat. Gebruik een schaar om zacht weefsel in de muizenhals te verwijderen om de luchtpijp bloot te leggen. Maak aan het bovenste uiteinde van de luchtpijp een klein gat met een diameter van 1,2 millimeter dat het passeren van een 20G Y-vormige IV-katheterpunt mogelijk moet maken.Sluit de ene adapterpoort van de Y-vormige katheter aan op een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 0,5 milliliter lucht en de andere poort met een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 2 milliliter 1,5% agarose-oplossing verwarmd tot 42 graden Celsius. Injecteer agarose-oplossing om de katheter te vullen en duw de katheter vervolgens door de opening in de luchtpijp tot 5 tot 8 millimeter. Injecteer de agarose-oplossing langzaam met een snelheid van 1 milliliter per 5 seconden.Merk op dat de long uitzet langs de proximale tot distale as. Stop de injectie wanneer de rand van elke longkwab is opgeblazen. Injecteer vervolgens 0,2 tot 0,3 milliliter lucht uit de andere spuit om de resterende agarose in geleidende luchtwegen naar de distale longblaasjesruimte te duwen.Clip sloot de luchtpijp met een paar gebogen hemostatische tangen. Om de pulmonale vasculatuur te vullen, vult u een spuit van 1 milliliter met warme 6% gelatine en sluit u deze aan op een naald-hoofdhuidaderkatheter. Vul de katheter in met gelatine-oplossing en prik vervolgens de rechter ventrikel dicht bij de inferieure wand met de naald.Duw de naald gedurende 2 tot 3 millimeter in de rechter ventrikel en richt de naaldpunt op de hoofdlongslagader. Injecteer ongeveer 0,2 milliliter gelatine-oplossing langzaam in de rechter ventrikel en pulmonale arteriële vaten. Houd de naald vijf minuten na injectie op zijn plaats en koel de longlobben door ijskoude HBSS-oplossing op het hart en de longen te gieten en plaats het lichaam in een koelkast.Verwijder na deze stap de long en het hart van de muis uit de omliggende bindweefsels met een schaar. Scheid vervolgens elke longkwab en bewaar ze in HBSS-oplossing op ijs. Trim de longkwab en oriënteer deze zodanig dat de snijrichting loodrecht staat op de meeste luchtwegen van de hila tot het longoppervlak.Bevestig het bovenop de monsterkolom met superlijm. Gebruik een vibratoom met een vers dun scheermesje om de longkwab in plakjes van 150 micrometer te snijden. Verzamel de plakjes in steriele petrischalen voorgevuld met koude HBSS-oplossing.Breng de plakjes over in petrischalen gevuld met DMEM/F-12 kweekmedium. Plaats de gerechten een nacht voor de experimenten in een incubator van 37 graden Celsius. Plaats een enkele precisiegesneden longschijf in elk putje van een 24-putjes kweekplaat gevuld met HBSS.Plaats het plakje in het midden van het putje en verwijder vervolgens de HBSS-oplossing met een pipet. Zoek onder een microscoop de doelluchtweg en het vat in de plak en bedek deze vervolgens met een nylon gaas met een voorgesneden centraal gat om het beoogde luchtwegvatgebied bloot te leggen. Leg een holle metalen ring bovenop het gaas om de plakjes op hun plaats te houden.Voeg vervolgens 600 microliter HBSS-oplossing toe om de plakjes onder te dompelen. Neem na 10 minuten de basislijnafbeeldingen op. Om de luchtweg- of vasculaire contractie te induceren, verwijdert u voorzichtig de HBSS-oplossing met een pipet en voegt u 600 microliter HBSS toe met een agonist.Om de calciumkleurstofbelastingsbuffer te bereiden, lost u eerst 50 microgram kleurstof op met 10 microliter DMSO en 0,2 gram Pluronic F-12-poeder in 1 milliliter DMSO. Meng 10 microliter van de Pluronic-oplossing met 10 microliter calciumkleurstofoplossing. Voeg dit mengsel toe aan 2 milliliter HBSS-oplossing met 200 micromolair sulfobroomftaleïne.Plaats vervolgens 15 nauwkeurig gesneden longplakken in 2 milliliter calciumlaadbuffer en incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius, gevolgd door gedurende 30 minuten incuberen in HBSS met 100 micromolaire sulfobroomftaleïne. Plaats vervolgens met calciumkleurstof geladen plakjes op een groot afdekglas. Vul hoogvacuüm siliconenvet in een spuit van 3 milliliter bevestigd aan een stompe naald van 18 G of een pipetpunt van 200 microliter en teken twee parallelle lijnen over het afdekglas, boven en onder de plak.Bedek de plak met een nylon gaas tussen twee vetlijnen. Plaats het tweede afdekglas op het gaas om een kamer te genereren. Voeg HBSS of een agonistoplossing aan het ene uiteinde met een pipet toe aan de kamer.Verwijder de vloeistof uit de kamer door aan het andere uiteinde te zuigen met tissuepapier. De kamer van de plak is nu klaar voor de calciumbeeldvorming met een high speed laser scanning confocale microscoop. Pulmonale luchtwegslagaderbundels werden waargenomen in nauwkeurig gesneden longplakken met een dikte van 150 micrometer onder een fasecontrastmicroscoop.In rusttoestand werd een luchtweg geïdentificeerd door kubusvormige epitheelcellen met een nabijgelegen longslagader. Na blootstelling aan methacholine werd het luminale gebied verminderd, terwijl de longslagader geen reactie op de stimuli vertoonde. Luchtwegcontractiele responsen werden gekwantificeerd door het percentage luminale gebiedsreductie en vertoonden vergelijkbare dosisafhankelijke responsen in één dag- en vijfdaagse culturen.Bij het bereiken van het perifere longveld vertakken de geleidende luchtwegen zich in ademhalingskanalen en zakjes rond de kleine intra-acinaire arteriolen. Bij blootstelling aan endotheel vernauwen zowel de luchtwegen als de longslagaders, gevolgd door noc-5 geïnduceerde ontspanning. In de rusttoestand vertoonden de met calciumkleurstof geladen plakjes een lage fluorescentie in de gladde spiercellen van de luchtwegen en het vasculaire systeem onder een confocale fluorescerende microscoop.Bij blootstelling aan agonisten steeg de calciumfluorescentie-intensiteit in de cellen en verspreidde zich naar de hele cel, wat correleerde met de oscillerende signalen. Qua techniek is het essentieel om de long met agarose homogeen op te blazen en snelle of overmatige agarose-injectie te vermijden. Duw altijd lucht aan het einde om de agarose van de geleidende luchtweg naar de distale longblaasjesruimte te spoelen.Samenvattend, met behulp van de precisie-gesneden longplakjescultuur, kan men een speciale verscheidenheid aan pulmonale gladde spierfuncties bieden en de deregulatie van gladde spieren in vitro modelleren. Het biedt ook een ideaal platform om novo vaatverwijdende of bronchodilatator medicijnen te screenen.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotope en orthotope Tracheale transplantatie in Muizen worden gebruikt als modellen voor de ontwikkeling van de obliterans luchtwegaandoeningen Study

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...