Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Ce travail est soutenu par des subventions des NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee du Massachusetts General Hospital. Des souris mâles de type sauvage C57/B6, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude.
1. Préparation expérimentale
<ol><li>Préparez la solution de travail.<ol>
<li>Préparez 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS, avec Ca2+ et Mg2+, et pH équilibré avec 20 mM HEPES, voir ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. 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J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

La préparation du PCLS implique plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est essentiel de gonfler le lobe pulmonaire de manière homogène pour éviter la variation de la rigidité tissulaire due à une distribution inégale de l’agarose. Comme l’agarose liquide se gélifie rapidement dans de minces cathéters ou des voies respiratoires à une température inférieure à 37 ° C, le défaut de remplissage résultant dans le champ pulmonaire distal pourrait augmenter la disparité de la rigidité du tissu pulm...

La cellule musculaire lisse (SMC) est un type de cellule structurelle majeur dans le poumon, résidant principalement dans la paroi médiale des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires. Les SMC se contractent pour modifier le calibre luminal, régulant ainsi le flux d’air et de sang 1,2. Par conséquent, la régulation contractile des SMC est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la ventilation de l’air et de la circulation pulmonaire. En revanche, la contractilité aberrante du SMC provoque des maladies vasculaires obstructives ou pulmonaires comme l’asthme et l’hypertension artérielle pulmonaire. Cependant, l’évaluation fonctionnelle des SMC pulmonaires a été remise en question par un accès limité au tissu pulmonaire, en particulier aux petites voies respiratoires et aux microvaisseaux dans la partie distale du poumon 2,3. Les solutions actuelles ont recours à des tests indirects, tels que la mesure de la résistance au flux d’air par Flexivent pour refléter la constriction des voies respiratoires et la vérification de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit pour évaluer la vasocontraction pulmonaire 4,5. Cependant, ces essais indirects présentent de multiples inconvénients, tels que le fait d’être confondus par des facteurs structurels, de ne pas capturer la diversité spatiale des réponses vasculaires ou vasculaires dans l’ensemble de l’échelle pulmonaire 6,7 et de ne pas convenir à l’étude mécaniste de la régulation contractile au niveau cellulaire. Par conséquent, des approches alternatives utilisant des cellules primaires isolées,des bandes musculaires trachées/ bronchiques 8,9 ou de grands segments vasculaires10 ont été appliquées pour l’étude SMC in vitro. Néanmoins, ces méthodes ont également des limites. Par exemple, une adaptation phénotypique rapide des SMC primaires dans la condition de culture11,12 rend problématique l’extrapolation des résultats de la culture cellulaire aux contextes in vivo. De plus, le phénotype contractile des SMC dans les voies respiratoires proximales isolées ou les segments vasculaires peut ne pas représenter les SMC dans le poumon distal 6,7. De plus, la mesure de la force musculaire au niveau tissulaire reste dissociée des événements moléculaires et cellulaires qui sont essentiels pour la compréhension mécaniste de la régulation contractile.
La tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS), une section de tissu pulmonaire vivant, fournit un outil ex vivo idéal pour caractériser les SMC pulmonaires dans un microenvironnement quasi in vivo (c.-à-d. architecture et interaction multicellulaires préservées)13. Depuis que les Drs Placke et Fisher ont introduit pour la première fois la préparation de tranches pulmonaires à partir de poumons de rat et de hamster gonflés à l’agarose dans les années 1980 14,15, cette technique a été continuellement avancée pour fournir aux PCLS une qualité supérieure et une plus grande polyvalence pour la recherche biomédicale. Une amélioration significative est l’amélioration de la préservation artérielle pulmonaire par perfusion de gélatine en plus de l’inflation pulmonaire avec l’agarose via la trachée. En conséquence, les artères respiratoires et pulmonaires sont maintenues intactes dans le PCLS pour l’évaluation ex vivo 16. De plus, le PCLS est viable pendant une période prolongée en culture. Par exemple, les PCLS de souris n’ont eu aucun changement significatif dans la viabilité cellulaire et le métabolisme pendant au moins 12 jours en culture, ainsi que, ils ont conservé la contractilité des voies respiratoires jusqu’à 7 jours17. En outre, PCLS conserve des voies respiratoires ou des vaisseaux de différentes tailles pour les tests de contraction et de relaxation. De plus, la signalisation intracellulaire Ca2+ des SMC, le facteur déterminant de la contractilité cellulaire, peut être dosée avec des colorants rapporteurs Ca2+ imagés par un microscope confocal ou à 2 photons13.
Compte tenu de l’application étendue du modèle murin dans la recherche pulmonaire, un protocole détaillé est décrit ici pour préparer le PCLS de souris avec des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires intactes pour la recherche pulmonaire ex vivo . À l’aide des LPC préparés, nous avons ensuite démontré comment évaluer les réponses artérielles et pulmonaires aux stimuli constrictifs ou relaxants. En outre, la méthode de chargement du PCLS avec un colorant rapporteur Ca2+ , puis l’imagerie de la signalisation Ca2+ des SMC associés à des réponses contractiles ou relaxantes sont également décrites.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Les cellules musculaires lisses (SMC) médient la contraction des voies respiratoires et de l’artère intrapulmonaire pour modifier la résistance au flux d’air et la circulation pulmonaire, respectivement, jouant ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie du système pulmonaire. La dérégulation de la contractilité SMC contribue à plusieurs maladies pulmonaires, y compris l’asthme et l’hypertension pulmonaire. Cependant, en raison de l’accès limité aux tissus et d’un manque de systèmes de culture pour maintenir les phénotypes SMC in vivo , les mécanismes moléculaires sous-jacents à la contractilité DÉRÉGULée du SMC dans ces maladies restent pleinement identifiés. La tranche de poumon découpée avec précision (PCLS) offre un modèle ex vivo qui contourne ces difficultés techniques. En tant que section de tissu pulmonaire mince et vivant, le PCLS retient le SMC dans un environnement naturel et permet un suivi in situ de la contraction du SMC et de la signalisation intracellulaire Ca2+ qui régule la contractilité du SMC. Ici, un protocole détaillé de préparation PCLS de souris est fourni, qui préserve les voies respiratoires intactes et les artères intrapulmonaires. Ce protocole implique deux étapes essentielles avant de soumettre le lobe pulmonaire au tranchage: gonfler les voies respiratoires avec de l’agarose à faible point de fusion à travers la trachée et remplir les vaisseaux pulmonaires de gélatine à travers le ventricule droit. Le PCLS préparé à l’aide de ce protocole peut être utilisé pour des essais biologiques afin d’évaluer la régulation contractile médiée par ca2+ de la SMC dans les voies respiratoires et les compartiments artériels intrapulmonaires. Lorsqu’il est appliqué à des modèles murins de maladies respiratoires, ce protocole permet l’étude fonctionnelle de la SMC, fournissant ainsi un aperçu du mécanisme sous-jacent de la dérégulation de la contractilité SMC dans les maladies.

Préparation pcLS de souris préservant les voies respiratoires et les artères intrapulmonaires intactes Un PCLS de 150 μm d’épaisseur a été observé au microscope à contraste de phase inversé. Dans les poumons de souris, les voies respiratoires conductrices sont accompagnées d’artères intrapulmonaires, allant du hile au poumon périphérique. Un faisceau sinusoïdal-artère pulmonaire représentatif dans un PCLS de souris est illustré à la figure 2B. Les v...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

Le PCLS soutient l’évaluation de l’activité des voies respiratoires et des cellules musculaires lisses vasculaires dans un environnement tissulaire presque intact, fournissant ainsi un modèle ex vivo inestimable pour la recherche pulmonaire. En termes de recherche sur les muscles lisses, les tranches pulmonaires coupées avec précision préservent le phénotype in vivo des cellules musculaires lisses et leur interaction avec les structures environnantes tout en permettant l’accès aux cellules musculaires lisses, ce qui est important pour une étude mécaniste au niveau cellulaire. Pour commencer, placez le corps de la souris sur une planche de dissection en position couchée.Épinglez la queue, les pattes avant et la tête avec des aiguilles de seringue 25G et désinfectez le corps avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez soigneusement la cavité thoracique le long du sternum et de la cage thoracique inférieure bilatérale au-dessus du diaphragme. Ensuite, pointez la pointe de ciseaux pointue loin du tissu pulmonaire et retirez une partie des cages thoraciques ventrales bilatérales pour exposer le cœur.Observez que les lobes pulmonaires s’effondrent lorsque la cavité thoracique s’ouvre. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus mous dans le cou de la souris afin d’exposer la trachée. À l’extrémité supérieure de la trachée, faites un petit trou de diamètre de 1,2 millimètre qui devrait permettre le passage d’une pointe de cathéter IV en forme de Y de 20 G.Connectez un port adaptateur du cathéter en forme de Y avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 0,5 millilitre d’air et l’autre port avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 2 millilitres de solution d’agarose à 1,5% chauffée à 42 degrés Celsius. Injecter une solution d’agarose pour remplir le cathéter, puis pousser le cathéter à travers l’ouverture dans la trachée à 5 à 8 millimètres. Injecter lentement la solution d’agarose à raison de 1 millilitre toutes les 5 secondes.Observez que le poumon se dilate le long de l’axe proximal à distal. Arrêtez l’injection lorsque le bord de chaque lobe pulmonaire est gonflé. Ensuite, injectez 0,2 à 0,3 millilitre d’air de l’autre seringue pour pousser l’agarose résiduelle dans les voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.Clip a fermé la trachée avec une paire de pinces hémostatiques incurvées. Pour remplir le système vasculaire pulmonaire, remplissez une seringue de 1 millilitre avec de la gélatine chaude de 6% et connectez-la à un cathéter veineux du cuir chevelu à aiguille. Remplissez le cathéter avec une solution de gélatine, puis perforez le ventricule droit près de la paroi inférieure avec l’aiguille.Poussez l’aiguille de 2 à 3 millimètres dans le ventricule droit et pointez la pointe de l’aiguille vers l’artère pulmonaire principale. Injecter environ 0,2 millilitre de solution de gélatine lentement dans le ventricule droit et les vaisseaux artériels pulmonaires. Gardez l’aiguille en place pendant cinq minutes après l’injection et refroidissez les lobes pulmonaires en versant une solution HBSS glacée sur le cœur et les poumons et placez le corps dans un réfrigérateur.Après cette étape, retirez le poumon et le cœur de la souris des tissus conjonctifs environnants avec des ciseaux. Ensuite, séparez chaque lobe pulmonaire et conservez-les dans une solution HBSS sur de la glace. Coupez le lobe pulmonaire et orientez-le de manière à ce que la direction de coupe soit perpendiculaire à la plupart des voies respiratoires, de la hile à la surface du poumon.Fixez-le sur le dessus de la colonne de l’échantillon avec de la super colle. Utilisez un vibratome avec une lame de rasoir mince et fraîche pour couper le lobe pulmonaire en tranches de 150 micromètres. Recueillir les tranches dans des boîtes de Petri stériles préremplies avec une solution HBSS froide.Transférer les tranches dans des boîtes de Petri remplies de milieu de culture DMEM/F-12. Placez les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant les expériences. Placez une seule tranche de poumon coupée avec précision dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits remplie de HBSS.Placez la tranche au milieu du puits, puis retirez la solution HBSS à l’aide d’une pipette. Au microscope, trouvez les voies respiratoires et le récipient cibles dans la tranche, puis recouvrez-les à l’aide d’un maillage en nylon avec un trou central prédécoupé pour exposer la zone des vaisseaux des voies respiratoires ciblée. Placez une rondelle métallique creuse sur le dessus de la maille pour maintenir les tranches en place.Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution HBSS pour immerger les tranches. Après 10 minutes, enregistrez les images de référence. Pour induire la contraction des voies respiratoires ou vasculaires, retirez prudemment la solution HBSS avec une pipette et ajoutez 600 microlitres de HBSS avec un agoniste.Pour préparer le tampon de chargement du colorant calcique, dissolvez d’abord 50 microgrammes de colorant avec 10 microlitres de DMSO et 0,2 gramme de poudre pluronique F-12 dans 1 millilitre de DMSO. Mélanger 10 microlitres de la solution Pluronic avec 10 microlitres de solution de colorant calcique. Ajouter ce mélange à 2 millilitres de solution HBSS contenant 200 micromolaires de sulfobromophtaléine.Ensuite, placez 15 tranches de poumons coupées avec précision dans 2 millilitres de tampon de charge de calcium et incubez à 30 degrés Celsius pendant une heure, puis incubez dans hbSS contenant 100 micromolaires sulfobromophtaléine pendant 30 minutes. Ensuite, placez les tranches chargées de colorant de calcium sur un grand verre de couverture. Remplissez la graisse de silicone sous vide poussé dans une seringue de 3 millilitres attachée à une aiguille émoussée de 18 G ou à une pointe de pipette de 200 microlitres et tracez deux lignes parallèles à travers le verre de couverture, au-dessus et au-dessous de la tranche.Couvrir la tranche à l’aide d’un maillage en nylon entre deux lignes de graisse. Placez le deuxième verre de couverture sur le dessus de la maille pour générer une chambre. Ajouter HBSS ou une solution agoniste dans la chambre à partir d’une extrémité avec une pipette.Retirez le liquide de la chambre en aspirant de l’autre extrémité avec du papier de soie. La chambre de la tranche est maintenant prête pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal à balayage laser à grande vitesse. Des faisceaux d’artères des voies respiratoires pulmonaires ont été observés dans des tranches pulmonaires découpées avec précision d’une épaisseur de 150 micromètres sous un microscope à contraste de phase.À l’état de repos, une voie respiratoire a été identifiée par des cellules épithéliales cuboïdes avec une artère pulmonaire voisine. Après l’exposition à la méthachiline, la zone luminale a été réduite tandis que l’artère pulmonaire n’a montré aucune réponse aux stimuli. Les réponses contractiles des voies respiratoires ont été quantifiées par le pourcentage de réduction de la surface luminale et ont montré des réponses dose-dépendantes similaires dans des cultures d’un jour et de cinq jours.En atteignant le champ pulmonaire périphérique, les voies respiratoires conductrices se ramifient dans les canaux respiratoires et les sacs entourant les petites artérioles intra-acineuses. Lorsqu’elles sont exposées à des endothélii, les voies respiratoires et les artères pulmonaires se contractent, suivies d’une relaxation induite par le NOC-5. À l’état de repos, les tranches chargées de colorant de calcium ont montré une faible fluorescence dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires et du système vasculaire sous un microscope fluorescent confocal.Lors de l’exposition aux agonistes, l’intensité de la fluorescence du calcium s’est élevée dans les cellules et s’est propagée à la cellule entière, ce qui était en corrélation avec les signaux oscillatoires. Sur le plan technique, il est essentiel de gonfler le poumon avec de l’agarose de manière homogène et d’éviter une injection rapide ou excessive d’agarose. Poussez toujours l’air à la fin pour rincer l’agarose des voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.En résumé, en utilisant la culture de tranches pulmonaires coupées avec précision, on peut fournir une variété spéciale de fonctions musculaires lisses pulmonaires et modéliser la dérégulation des muscles lisses in vitro. Il fournit également une plate-forme idéale pour dépister les médicaments vasodilatateurs ou bronchodilatateurs novos.

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