Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Diese Arbeit wird durch NIH-Zuschüsse, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) unterstützt.

Die gesamte Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Massachusetts General Hospital. Wildtyp C57/B6 männliche Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet.
1. Versuchsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor.<ol>
<li>Bereiten Sie 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, mit Ca 2+ und Mg 2+ und pH ausgewogen mit20 mM HEPES, siehe ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

Die Vorbereitung von PCLS umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist es wichtig, den Lungenlappen homogen aufzublasen, um die Variation der Gewebesteifigkeit durch ungleichmäßige Agaroseverteilung zu vermeiden. Da die flüssige Agarose bei einer Temperatur unter 37 °C schnell in dünnen Kathetern oder Atemwegen geliert, könnte der daraus resultierende Fülldefekt im distalen Lungenfeld die Disparität der Lungengewebesteifigkeit erhöhen und Geweberisse während des Vibratomabschnitts verursachen. Daher kann ge?...

Die glatte Muskelzelle (SMC) ist ein wichtiger struktureller Zelltyp in der Lunge, der sich hauptsächlich in der Medienwand der Atemwege und Lungengefäße befindet. SMCs ziehen sich zusammen, um das luminale Kaliber zu verändern und so den Luft- und Blutfluss zu regulieren 1,2. Daher ist die kontraktile Regulierung von SMCs unerlässlich, um die Homöostase der Luftbelüftung und der Lungenzirkulation aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu provoziert die aberrante SMC-Kontraktilität obstruktive Atemwegs- oder pulmonale Gefäßerkrankungen wie Asthma und pulmonale arterielle Hypertonie. Die funktionelle Beurteilung von Lungen-SMCs wurde jedoch durch den begrenzten Zugang zum Lungengewebe in Frage gestellt, insbesondere zu den kleinen Atemwegen und Mikrogefäßen im distalen Teil der Lunge 2,3. Aktuelle Lösungen greifen auf indirekte Assays zurück, wie z.B. die Messung des Luftstromwiderstands durch Flexivent, um die Verengung der Atemwege zu reflektieren, und die Überprüfung des pulmonalen arteriellen Blutdrucks durch Rechtsherzkatheterisierung zur Beurteilung der pulmonalen Vasokontraktion 4,5. Diese indirekten Assays haben jedoch mehrere Nachteile, wie z.B. strukturelle Faktoren zu verwirren, die räumliche Vielfalt der Atemwegs- oder Gefäßreaktionen in der gesamten Lungenskala nicht zu erfassen 6,7 und sind für die mechanistische Untersuchung der kontraktilen Regulation auf zellulärer Ebene ungeeignet. Daher wurden alternative Ansätze mit isolierten Primärzellen, Luftröhren-/Bronchi-Muskelstreifen 8,9 oder großen Gefäßsegmenten10 für die SMC-Studie in vitro angewendet. Dennoch haben diese Methoden auch Grenzen. Zum Beispiel macht es eine schnelle phänotypische Anpassung primärer SMCs im Kulturzustand11,12 problematisch, Befunde aus der Zellkultur auf In-vivo-Einstellungen zu extrapolieren. Darüber hinaus kann der kontraktile Phänotyp von SMCs in den isolierten proximalen Atemwegs- oder Gefäßsegmenten nicht die SMCs in der distalen Lungedarstellen 6,7. Darüber hinaus bleibt die Muskelkraftmessung auf Gewebeebene von molekularen und zellulären Ereignissen getrennt, die für den mechanistischen Einblick in die kontraktile Regulation unerlässlich sind.
Precision-cut lung slice (PCLS), ein lebender Lungengewebeabschnitt, bietet ein ideales Ex-vivo-Werkzeug zur Charakterisierung pulmonaler SMCs in einer nahezu in vivo Mikroumgebung (d. h. erhaltene multizelluläre Architektur und Interaktion)13. Seit Dr. Placke und Dr. Fisher in den 1980er Jahren erstmals die Herstellung von Lungenscheiben aus mit Agarose aufgeblasenen Ratten- und Hamsterlungen eingeführt haben14,15, wurde diese Technik kontinuierlich weiterentwickelt, um PCLS eine höhere Qualität und größere Vielseitigkeit für die biomedizinische Forschung zu bieten. Eine signifikante Verbesserung ist die Verbesserung der pulmonalen arteriellen Erhaltung durch Gelatineinfusion zusätzlich zur Lungeninflation mit Agarose über die Luftröhre. Infolgedessen werden sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien im PCLS für die Ex-vivo-Beurteilung intakt gehalten 16. Darüber hinaus ist das PCLS für eine längere Zeit in der Kultur lebensfähig. Zum Beispiel hatten Maus-PCLS für mindestens 12 Tage in Kultur keine signifikante Veränderung der Zelllebensfähigkeit und des Metabolismus, und sie behielten die Kontraktilität der Atemwege für bis zu 7 Tagebei 17. Darüber hinaus hält PCLS unterschiedlich große Atemwege oder Gefäße für Kontraktions- und Entspannungsassays. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Ca 2 + -Signalgebung von SMCs, dem Determinantenfaktor der Zellkontraktilität, mit Ca 2+ -Reporterfarbstoffen untersucht werden, die von einem konfokalen oder 2-Photonen-Mikroskop13 aufgenommen wurden.
Unter Berücksichtigung der umfangreichen Anwendung des Mausmodells in der Lungenforschung wird hier ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Maus-PCLS mit intakten Atemwegen und intrapulmonalen Arterien für die Ex-vivo-Lungenforschung beschrieben. Anhand der präparierten PCLS demonstrierten wir anschließend, wie die Reaktionen der Atemwege und der Lungenarterien auf konstriktive oder relaxante Reize bewertet werden können. Darüber hinaus wird auch das Verfahren beschrieben, das PCLS mit Ca 2 + -Reporterfarbstoff zu beladen und dann die Ca2 + -Signalgebung von SMCs in Verbindung mit kontraktilen oder relaxanten Reaktionen abzubilden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Glatte Muskelzellen (SMC) vermitteln die Kontraktion der Atemwege und der intrapulmonalen Arterie, um den Luftströmungswiderstand bzw. die Lungenzirkulation zu modifizieren, und spielen somit eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Lungensystems. Die Deregulation der SMC-Kontraktilität trägt zu mehreren Lungenerkrankungen bei, einschließlich Asthma und pulmonaler Hypertonie. Aufgrund des begrenzten Gewebezugangs und des Mangels an Kultursystemen zur Aufrechterhaltung von In-vivo-SMC-Phänotypen bleiben molekulare Mechanismen, die der deregulierten SMC-Kontraktilität bei diesen Krankheiten zugrunde liegen, jedoch vollständig identifiziert. Die präzisionsgeschnittene Lungenscheibe (PCLS) bietet ein Ex-vivo-Modell , das diese technischen Schwierigkeiten umgeht. Als lebender, dünner Lungengewebeschnitt behält das PCLS SMC in natürlicher Umgebung und ermöglicht die In-situ-Verfolgung der SMC-Kontraktion und der intrazellulären Ca 2 + -Signalgebung, die dieSMC-Kontraktilität reguliert. Hier wird ein detailliertes PCLS-Vorbereitungsprotokoll für die Maus bereitgestellt, das intakte Atemwege und intrapulmonale Arterien bewahrt. Dieses Protokoll umfasst zwei wesentliche Schritte, bevor der Lungenlappen dem Schneiden unterzogen wird: Aufblasen der Atemwege mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch die Luftröhre und Auffüllen der Lungengefäße mit Gelatine durch den rechten Ventrikel. Das mit diesem Protokoll hergestellte PCLS kann für Bioassays verwendet werden, um die Ca2+-vermittelte kontraktile Regulation von SMC sowohl in den Atemwegen als auch in den intrapulmonalen arteriellen Kompartimenten zu bewerten. Bei der Anwendung auf Mausmodelle von Atemwegserkrankungen ermöglicht dieses Protokoll die funktionelle Untersuchung von SMC und gibt so Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der SMC-Kontraktilitätsderegulierung bei Krankheiten.

Maus-PCLS-Präparat zur Erhaltung intakter intrapulmonaler Atemwege und Arterien Ein 150 μm dickes PCLS wurde unter dem invertierten Phasenkontrastmikroskop beobachtet. In der Mauslunge werden leitfähige Atemwege von intrapulmonalen Arterien begleitet, die vom Hilus bis zur peripheren Lunge verlaufen. Ein repräsentatives Lungen-Atemwegs-Arterie-Bündel in einem Maus-PCLS ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Atemwege können leicht durch quaderförmige Epithelzellen ide...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

Das PCLS unterstützt die Beurteilung der Aktivität der Atemwege und der glatten Gefäßmuskulatur in einer nahezu intakten Gewebeumgebung und liefert damit ein unschätzbares Ex-vivo-Modell für die Lungenforschung. In Bezug auf die glatte Muskelforschung erhalten die präzisionsgeschnittenen Lungenschnitte den In-vivo-Phänotyp der glatten Muskelzellen und ihre Interaktion mit umgebenden Strukturen und ermöglichen gleichzeitig den Zugang zu glatten Muskelzellen, was für eine mechanistische Untersuchung auf zellulärer Ebene wichtig ist. Platzieren Sie zunächst den Mauskörper auf einem Sezierbrett in Rückenlage.Stecken Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25G Spritzennadeln fest und desinfizieren Sie den Körper mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell. Richten Sie dann die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe weg und entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen.Beobachten Sie, dass die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet. Verwenden Sie eine Schere, um Weichgewebe im Maushals zu entfernen, um die Luftröhre freizulegen. Am oberen Ende der Luftröhre machen Sie ein kleines Loch mit einem Durchmesser von 1,2 Millimetern, das das Passieren einer 20G Y-förmigen IV-Katheterspitze ermöglichen sollte.Verbinden Sie einen Adapteranschluss des Y-förmigen Katheters mit einer 3-Milliliter-Spritze, die mit 0,5 Millilitern Luft vorgefüllt ist, und den anderen Anschluss mit einer 3-Milliliter-Spritze, die mit 2 Millilitern 1,5% Agaroselösung vorgefüllt ist, die auf 42 Grad Celsius erwärmt ist. Injizieren Sie Agaroselösung, um den Katheter zu füllen, und drücken Sie dann den Katheter durch die Öffnung in die Luftröhre auf 5 bis 8 Millimeter. Injizieren Sie die Agaroselösung langsam mit einer Rate von 1 Milliliter pro 5 Sekunden.Beobachten Sie, dass sich die Lunge entlang der proximalen bis distalen Achse ausdehnt. Stoppen Sie die Injektion, wenn der Rand jedes Lungenlappens aufgeblasen ist. Injizieren Sie dann 0,2 bis 0,3 Milliliter Luft aus der anderen Spritze, um die Restagarose in leitende Atemwege in den distalen Alveolenraum zu drücken.Clip schloss die Luftröhre mit einem Paar gekrümmter hämostatischer Pinzetten. Um das Lungengefäßsystem zu füllen, füllen Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit warmer 6% Gelatine und verbinden Sie sie mit einem Nadel-Kopfhautvenenkatheter. Füllen Sie den Katheter mit Gelatinelösung und punktieren Sie dann den rechten Ventrikel in der Nähe der unteren Wand mit der Nadel.Drücken Sie die Nadel für 2 bis 3 Millimeter in den rechten Ventrikel und richten Sie die Nadelspitze auf die Hauptlungenarterie. Injizieren Sie etwa 0,2 Milliliter Gelatinelösung langsam in den rechten Ventrikel und die pulmonalen arteriellen Gefäße. Halten Sie die Nadel nach der Injektion fünf Minuten an Ort und Stelle und kühlen Sie die Lungenlappen, indem Sie eiskalte HBSS-Lösung auf Herz und Lunge gießen und den Körper in einen Kühlschrank stellen.Entfernen Sie nach diesem Schritt die Mauslunge und das Herz mit einer Schere aus dem umgebenden Bindegewebe. Trennen Sie dann jeden Lungenlappen und bewahren Sie ihn in HBSS-Lösung auf Eis auf. Schneiden Sie den Lungenlappen und richten Sie ihn so aus, dass die Schnittrichtung senkrecht zu den meisten Atemwegen von der Hila bis zur Lungenoberfläche verläuft.Befestigen Sie es mit Sekundenkleber auf der Probensäule. Verwenden Sie ein Vibratom mit einer frischen, dünnen Rasierklinge, um den Lungenlappen in 150-Mikrometer-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie die Scheiben in sterilen Petrischalen vorgefüllt mit kalter HBSS-Lösung.Die Scheiben in Petrischalen geben, die mit DMEM/F-12-Kulturmedium gefüllt sind. Stellen Sie das Geschirr über Nacht vor den Experimenten in einen 37 Grad Celsius-Inkubator. Legen Sie eine einzelne präzisionsgeschnittene Lungenscheibe in jede Vertiefung einer mit HBSS gefüllten 24-Well-Kulturplatte.Suchen Sie die Scheibe in der Mitte der Vertiefung und entfernen Sie dann die HBSS-Lösung mit einer Pipette. Suchen Sie unter einem Mikroskop die Zielatemwege und das Zielgefäß in der Scheibe und bedecken Sie sie dann mit einem Nylonnetz mit einem vorgeschnittenen zentralen Loch, um den Zielbereich des Atemwegsgefäßes freizulegen. Legen Sie eine hohle Metallscheibe auf das Netz, um die Scheiben an Ort und Stelle zu halten.Fügen Sie dann 600 Mikroliter HBSS-Lösung hinzu, um die Scheiben einzutauchen. Zeichnen Sie nach 10 Minuten die Baseline-Bilder auf. Um die Atemwegs- oder Gefäßkontraktion zu induzieren, entfernen Sie vorsichtig die HBSS-Lösung mit einer Pipette und fügen Sie 600 Mikroliter HBSS mit einem Agonisten hinzu.Um den Calciumfarbstoff-Ladepuffer herzustellen, lösen Sie zunächst 50 Mikrogramm Farbstoff mit 10 Mikrolitern DMSO und 0,2 Gramm Pluronic F-12-Pulver in 1 Milliliter DMSO auf. Mischen Sie 10 Mikroliter der Plunonic-Lösung mit 10 Mikrolitern Calciumfarbstofflösung. Fügen Sie diese Mischung zu 2 Millilitern HBSS-Lösung hinzu, die 200 Mikromolar Sulfobromphthalein enthält.Legen Sie dann 15 präzisionsgeschnittene Lungenscheiben in 2 Milliliter Kalziumladepuffer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation in HBSS mit 100 Mikromolar Sulfobromphthalein für 30 Minuten. Legen Sie dann mit Kalziumfarbstoff beladene Scheiben auf ein großes Deckglas. Füllen Sie Hochvakuum-Silikonfett in eine 3-Milliliter-Spritze, die an einer 18G stumpfen Nadel oder einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze befestigt ist, und zeichnen Sie zwei parallele Linien über das Deckglas, über und unter der Scheibe.Decken Sie die Scheibe mit einem Nylonnetz zwischen zwei Fettlinien ab. Legen Sie das zweite Deckglas auf das Netz, um eine Kammer zu erzeugen. Fügen Sie HBSS oder eine Agonistenlösung von einem Ende mit einer Pipette in die Kammer hinzu.Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Kammer, indem Sie vom anderen Ende mit Seidenpapier absaugen. Die Kammer der Scheibe ist nun bereit für die Kalziumbildgebung mit einem Hochgeschwindigkeits-Laserscanning-Konfokalmikroskop. Lungenarterienbündel wurden in präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten von 150 Mikrometern Dicke unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet.Im Ruhezustand wurde ein Atemweg durch quaderförmige Epithelzellen mit einer nahe gelegenen Lungenarterie identifiziert. Nach der Exposition gegenüber Methacholin wurde die luminale Fläche reduziert, während die Lungenarterie keine Reaktion auf die Reize zeigte. Die kontraktilen Reaktionen der Atemwege wurden durch den Prozentsatz der luminalen Flächenreduktion quantifiziert und zeigten ähnliche dosisabhängige Reaktionen in Ein-Tages- und Fünf-Tages-Kulturen.Beim Erreichen des peripheren Lungenfeldes verzweigen sich die leitfähigen Atemwege in Atemwege und Säcke, die die kleinen intra-acinaren Arteriolen umgeben. Bei Exposition gegenüber Endotheln verengen sich sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien, gefolgt von einer NOC-5-induzierten Relaxation. Im Ruhezustand zeigten die mit Kalziumfarbstoffen beladenen Scheiben eine geringe Fluoreszenz in den glatten Muskelzellen der Atemwege und des Gefäßsystems unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.Bei Exposition gegenüber Agonisten erhöhte sich die Kalziumfluoreszenzintensität in den Zellen und breitete sich auf die gesamte Zelle aus, was mit den oszillierenden Signalen korrelierte. Technisch ist es wichtig, die Lunge homogen mit Agarose aufzublasen und eine schnelle oder übermäßige Agaroseinjektion zu vermeiden. Drücken Sie immer Luft am Ende, um die Agarose von den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu spülen.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass man mit der präzisionsgeschnittenen Lungenschnittkultur eine besondere Vielfalt an Funktionen der glatten Lungenmuskulatur bereitstellen und die Deregulation der glatten Muskulatur in vitro modellieren kann. Es bietet auch eine ideale Plattform, um novo vasodilatatorische oder bronchodilatatorische Medikamente zu screenen.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...