Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. עכברים זכרים מסוג C57/B6 מסוג בר, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי.
1. הכנה ניסיונית
<ol><li>הכן את פתרון העבודה.<ol>
<li>הכינו תמיסת מלח מאוזנת של 1x Hank (HBSS, עם Ca2...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

הכנת PCLS כוללת מספר שלבים קריטיים. ראשית, חיוני לנפח את אונת הריאה באופן הומוגני כדי למנוע את השונות של נוקשות הרקמה מהתפלגות אגרוז לא אחידה. מכיוון שהאגרוז הנוזלי מתנגש במהירות בצנתרים דקים או בדרכי הנשימה בטמפרטורה הנמוכה מ-37 מעלות צלזיוס, פגם המילוי שנוצר כתוצאה מכך בשדה הריאה הדיסטלי ע?...

תא שריר חלק (SMC) הוא סוג של תא מבני עיקרי בריאה, השוכן בעיקר בדופן המדיה של דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים. עסקים קטנים ובינוניים מתכווצים כדי לשנות את קליבר הלומינלי, ובכך לווסת את זרימת האוויר והדם 1,2. לכן, ויסות התכווצות של SMCs חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס של אוורור אוויר וזרימת ריאות. לעומת זאת, התכווצות SMC חריגה מעוררת מחלות חסימתיות בדרכי הנשימה או בכלי הדם הריאתיים כמו אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי עורקי. עם זאת, ההערכה התפקודית של SMCs של הריאה אותגרה על ידי גישה מוגבלת לרקמת הריאה, במיוחד אלה דרכי הנשימה הקטנות והמיקרו-ווסלים בחלק הדיסטלי של הריאה 2,3. הפתרונות הנוכחיים משתמשים בבדיקות עקיפות, כגון מדידת עמידות זרימת האוויר על ידי Flexivent כדי לשקף התכווצות דרכי הנשימה, ובדיקת לחץ דם עורקי ריאתי על ידי צנתור לב ימין כדי להעריך את כלי הדם הריאתיים 4,5. עם זאת, לבדיקות עקיפות אלה יש חסרונות מרובים, כגון בלבול על ידי גורמים מבניים, כישלון ללכוד את המגוון המרחבי של תגובות דרכי הנשימה או כלי הדם בכל סולם הריאות 6,7, ובלתי מתאים למחקר המכניסטי של ויסות התכווצות ברמה התאית. לכן, גישות חלופיות המשתמשות בתאים ראשוניים מבודדים, רצועות שריר קנה הנשימה/ברונכי 8,9, או מקטעי כלי דם גדולים10 יושמו עבור מחקר SMC במבחנה. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות. לדוגמה, התאמה פנוטיפית מהירה של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים בתנאי התרבית11,12 הופכת את זה לבעייתי לאקסטרפולציה של ממצאים מתרבית תאים להגדרות in vivo. בנוסף, ייתכן שהפנוטיפ המתכווץ של SMCs בדרכי הנשימה הפרוקסימליות המבודדות או בקטעי כלי הדם של כלי הדם אינו מייצג את ה-SMCs בריאה הדיסטלית 6,7. יתר על כן, מדידת כוח השריר ברמת הרקמה נותרה מנותקת מאירועים מולקולריים ותאיים החיוניים לתובנה מכניסטית לגבי ויסות התכווצות.
פרוסת ריאה חתוכה במדויק (PCLS), מקטע רקמת ריאה חיה, מספקת כלי אקס-ויוו אידיאלי לאפיון SMCs ריאתיים במיקרו-סביבה כמעט in vivo (כלומר, ארכיטקטורה רב-תאית משומרת ואינטראקציה)13. מאז שד"ר פלאקה ופישר הציגו לראשונה את הכנת פרוסות הריאה מריות של חולדה מנופחת אגרוז וריאות אוגר בשנות ה-80של המאה ה-20, 14,15, טכניקה זו קודמה ברציפות כדי לספק ל-PCLSs איכות גבוהה יותר ורב-תכליתיות רבה יותר למחקר ביו-רפואי. שיפור משמעותי אחד הוא שיפור שימור עורקי הריאה על ידי עירוי ג'לטין בנוסף לניפוח הריאות עם אגרוז דרך קנה הנשימה. כתוצאה מכך, הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים נשמרים שלמים ב- PCLS להערכת ex vivo 16. יתר על כן, ה- PCLS הוא בר קיימא במשך זמן ממושך בתרבות. לדוגמה, ל-PCLS של עכברים לא היה שינוי משמעותי בכדאיות התאים ובחילוף החומרים במשך 12 ימים לפחות בתרבית, כמו גם, הם שמרו על התכווצות דרכי הנשימה עד 7 ימיםו-17 ימים. בנוסף, PCLS שומר על דרכי אוויר או כלי דם בגדלים שונים לבדיקות התכווצות והרפיה. יתר על כן, ניתן לבחון איתות Ca2+ תוך-תאי של SMCs, הגורם הקובע של התכווצות התאים, באמצעות צבעי כתב Ca2+ המצולמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או 2-פוטון13.
בהתחשב ביישום הנרחב של מודל העכבר בחקר הריאות, פרוטוקול מפורט מתואר כאן להכנת PCLS של עכבר עם דרכי נשימה שלמות ועורקים תוך-פולמונריים למחקר ריאות ex vivo . באמצעות ה- PCLSs המוכנים, הדגמנו לאחר מכן כיצד להעריך את תגובות דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים לגירויים מכווצים או מרגיעים. בנוסף, מתוארת גם השיטה של טעינת ה- PCLS עם צבע כתב Ca2+ ולאחר מכן הדמיה של איתות Ca2+ של SMCs הקשורים לתגובות מתכווצות או מרגיעות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

תאי שריר חלקים (SMC) מתווכים את התכווצות דרכי הנשימה ואת העורק התוך-פולמונרי כדי לשנות את ההתנגדות לזרימת האוויר ואת זרימת הדם הריאתית, בהתאמה, ומכאן ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס של מערכת הריאה. דה-רגולציה של התכווצות SMC תורמת למספר מחלות ריאה, כולל אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי. עם זאת, בשל גישה מוגבלת לרקמות והיעדר מערכות תרבית לשמירה על פנוטיפים של in vivo SMC, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התכווצות SMC ללא פיקוח במחלות אלה נותרים מזוהים במלואם. פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) מציעה מודל ex vivo שעוקף את הקשיים הטכניים הללו. כמקטע רקמת ריאה חי ודק, ה-PCLS שומר על SMC בסביבה טבעית ומאפשר מעקב באתרו אחר התכווצות SMC ואיתות Ca2+ תוך-תאי המווסת את התכווצות ה-SMC. כאן, פרוטוקול הכנה מפורט של PCLS עכבר מסופק, אשר משמר דרכי אוויר שלמות ועורקים intrapulmonary. פרוטוקול זה כולל שני שלבים חיוניים לפני הכפפת אונת הריאה לחיתוך: ניפוח דרכי הנשימה עם אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה דרך קנה הנשימה ומילוי כלי ריאתיים בג'לטין דרך החדר הימני. ה- PCLS שהוכן באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקות ביולוגיות כדי להעריך את ויסות ההתכווצות בתיווך Ca2+ של SMC הן בדרכי הנשימה והן בתאי העורקים התוך-פולמונריים. כאשר הוא מיושם על מודלים של עכברים של מחלות בדרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר חקירה תפקודית של SMC, ובכך מספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של דה-רגולציה של התכווצות SMC במחלות.

הכנת PCLS של עכבר המשמרת דרכי אוויר ועורקים תוך-פולמונריים שלמים PCLS בעובי 150 מיקרומטר נצפה תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוכה. בריאות עכבר, דרכי הנשימה המוליכות מלוות בעורקים תוך-פולמונריים, העוברים מההילוס לריאה ההיקפית. צרור עורקי דרכי הנשימה הריאתיים הייצוגי ב-PCLS של עכבר מוצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

ה- PCLS תומך בהערכת פעילות תאי השריר החלקים של דרכי הנשימה וכלי הדם בסביבה של רקמה כמעט שלמה, ובכך מספק מודל ex vivo שלא יסולא בפז למחקר ריאתי. במונחים של מחקר שרירים חלקים, פרוסות הריאה החתוכות באופן מדויק משמרות את הפנוטיפ in vivo של תאי שריר חלקים ואת האינטראקציה שלהם עם המבנים הסובבים אותם, תוך מתן גישה לתאי שריר חלקים, החשובים למחקר מכניסטי ברמה התאית. כדי להתחיל, להניח את גוף העכבר על לוח דיסקציה במצב שכיבה.הצמידו את הזנב, כפות הרגליים הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25G וחיטוי הגוף עם 70% אתנול. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת. לאחר מכן, כוון את קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה והסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניות הדו-צדדיות כדי לחשוף את הלב.שימו לב שאונות הריאה קורסות כאשר חלל החזה נפתח. השתמש במספריים כדי להסיר רקמות רכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה. בקצה העליון של קנה הנשימה יוצרים חור קטן בקוטר 1.2 מילימטרים שאמור לאפשר מעבר של קצה צנתר IV בצורת 20G Y.חברו יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מיליליטר ממולא מראש ב-0.5 מיליליטר אוויר והיציאה השנייה עם מזרק 3 מיליליטר הממולא מראש ב-2 מיליליטר של תמיסת אגרוז של 1.5% שחוממה ל-42 מעלות צלזיוס. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח לקנה הנשימה ל-5 עד 8 מילימטרים. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בקצב של 1 מיליליטר ל-5 שניות.שימו לב שהריאה מתרחבת לאורך הציר הפרוקסימלי עד הדיסטלי. עצרו את ההזרקה כאשר קצה כל אונת ריאות מנופח. לאחר מכן, הזריקו 0.2 עד 0.3 מיליליטרים של אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את האגרוז השיורי לתוך דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.קליפ סגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים. כדי למלא את כלי הדם הריאתיים, מלאו מזרק 1 מיליליטר בג'לטין חם של 6% וחברו אותו לצנתר וריד קרקפת מחט. ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.דוחפים את המחט במשך 2 עד 3 מילימטרים לחדר הימני ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי. הזריקו כ-0.2 מיליליטרים של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים. יש לשמור את המחט במקומה במשך חמש דקות לאחר ההזרקה ולקרר את אונות הריאה על ידי שפיכת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות ולהניח את הגוף במקרר.לאחר שלב זה, הסר את ריאת העכבר ואת הלב מרקמות החיבור שמסביב עם מספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח. קצצו את אונת הריאה וכיוונו אותה כך שכיוון החיתוך יהיה מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.חברו אותו על גבי עמוד הדגימה עם דבק-על. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות הממולאות מראש בתמיסת HBSS קרה.העבירו את הפרוסות לצלחות פטרי מלאות במדיום תרבות DMEM/F-12. מניחים את הכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס לילה לפני הניסויים. הניחו פרוסת ריאה אחת חתוכה במדויק בכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות מלאה ב-HBSS.אתר את הפרוסה באמצע הבאר ולאחר מכן הסר את פתרון ה- HBSS עם פיפטה. תחת מיקרוסקופ, מצאו את נתיב הנשימה וכלי הדם של המטרה בפרוסה ולאחר מכן כסו אותה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש כדי לחשוף את אזור כלי הדם הממוקד. הניחו מכונת כביסה ממתכת חלולה על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן.לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטרים של פתרון HBSS כדי להטביע את הפרוסות. לאחר 10 דקות, הקלט את תמונות הבסיס. כדי לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם, הסר בזהירות את תמיסת HBSS עם פיפטה והוסף 600 מיקרוליטרים של HBSS עם אגוניסט.כדי להכין את מאגר טעינת צבע הסידן, תחילה להמיס 50 מיקרוגרם של צבע עם 10 מיקרוליטרים של DMSO ו 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית ב 1 מיליליטר של DMSO. ערבבו 10 מיקרוליטרים של תמיסת פלורוני עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת צבע סידן. הוסיפו את התערובת הזו ל-2 מיליליטרים של תמיסת HBSS המכילה 200 מיקרומולר של סולפובירומופתליין.לאחר מכן, מניחים 15 פרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק ב-2 מיליליטרים של מאגר העמסת סידן ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן דגירה ב-HBSS המכילה 100 מיקרומולאר סולפובירומופתליין למשך 30 דקות. לאחר מכן, מניחים פרוסות טעונות צבע סידן על כיסוי גדולה. מלאו שומן סיליקון בוואקום גבוה במזרק 3 מיליליטר המחובר למחט קהה 18G או לקצה פיפטה 200 מיקרוליטר וציירו שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי, מעל ומתחת לפרוסה.מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. מניחים את זכוכית הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך החדר מקצה אחד עם פיפטה.הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו. תא הפרוסה מוכן כעת להדמיית הסידן עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר במהירות גבוהה. צרורות עורקי דרכי הנשימה הריאתיים נצפו בפרוסות ריאה חתוכות במדויק בעובי 150 מיקרומטרים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.במצב מנוחה, זוהתה דרכי הנשימה על ידי תאי אפיתל קובידליים עם עורק ריאתי סמוך. בעקבות חשיפה למתכולין, האזור הלומינלי הצטמצם ואילו עורק הריאה לא הראה תגובה לגירויים. תגובות התכווצות דרכי הנשימה כומתו על ידי אחוז הירידה באזור הלומינלי והראו תגובות תלויות מינון דומות בתרביות של יום אחד וחמישה ימים.עם ההגעה לשדה הריאה ההיקפי, דרכי הנשימה המוליכות מסתעפות לצינורות נשימה ושקים המקיפים את העורקים התוך-אסינאריים הקטנים. כאשר נחשפים לאנדותלי הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים מתכווצים, ולאחר מכן הרפיה המושרה על ידי NOC-5. במצב המנוחה, פרוסות טעונות צבע הסידן הראו פלואורסצנטיות נמוכה בתאי השריר החלקים של דרכי הנשימה ומערכת כלי הדם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.עם החשיפה לאגוניסטים, עוצמת הפלואורסצנציה של הסידן עלתה בתאים והתפשטה לתא כולו, אשר תאם את האותות המתנדנדים. טכניקה חכמה, זה חיוני כדי לנפח את הריאה עם agarose באופן הומוגני ולהימנע הזרקת אגרוז מהירה או מוגזמת. תמיד לדחוף אוויר בקצה כדי לשטוף את האגרוז מדרכי הנשימה המוליכות אל חלל הנאדיות הדיסטליות.לסיכום, באמצעות תרבית פרוסות הריאה החתוכה באופן מדויק, ניתן לספק מגוון מיוחד של תפקודי שרירים חלקים ריאתיים ולדגום את דה-ויסות השרירים החלק במבחנה. הוא גם מספק פלטפורמה אידיאלית לסינון תרופות נובו vasodilatory או ברונכודילטור.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

השתלת קנה הנשימה Heterotopic ו orthotopic ב עכברים משמשים מודלים לחקר התפתחות המחלה Airway סותם

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...