Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
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सभी पशु देखभाल मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार थी। वर्तमान अध्ययन के लिए जंगली प्रकार के सी 57 / बी 6 नर चूहों, 8 सप्ताह की उम्र का उपयोग किया गया थ...

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	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. 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J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

पीसीएलएस की तैयारी में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। सबसे पहले, असमान एगरोज़ वितरण से ऊतक कठोरता की भिन्नता से बचने के लिए फेफड़ों के लोब को सजातीय रूप से फुलाना आवश्यक है। चूंकि तरल एगरोज 37 डिग्री सेल्?...

चिकनी मांसपेशी कोशिका (एसएमसी) फेफड़ों में एक प्रमुख संरचनात्मक कोशिका प्रकार है, जो मुख्य रूप से वायुमार्ग और फुफ्फुसीय वाहिकाओं की मीडिया दीवार में रहती है। एसएमसी ल्यूमिनल कैलिबर को बदलने के लिए अनुबंध करते हैं, इस प्रकार हवा और रक्त प्रवाह 1,2 को विनियमित करते हैं। इसलिए, वायु वेंटिलेशन और फुफ्फुसीय परिसंचरण के होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए एसएमसी का सिकुड़ा हुआ विनियमन आवश्यक है। इसके विपरीत, विचलित एसएमसी संकुचन प्रतिरोधी वायुमार्ग या फुफ्फुसीय संवहनी रोगों जैसे अस्थमा और फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप को उत्तेजित करता है। हालांकि, फेफड़ों के एसएमसी के कार्यात्मक मूल्यांकन को फेफड़ों के ऊतकों तक सीमित पहुंच से चुनौती दी गई है, विशेष रूप से फेफड़ोंके 2,3 के बाहर के हिस्से में उन छोटे वायुमार्ग और माइक्रोवेसल्स। वर्तमान समाधान अप्रत्यक्ष परख का सहारा लेते हैं, जैसे वायुमार्ग कसना को प्रतिबिंबित करने के लिए फ्लेक्सिवेंट द्वारा एयरफ्लो प्रतिरोध को मापना, और फुफ्फुसीय वाहिकासंकीर्णन 4,5 का आकलन करने के लिए सही हृदय कैथीटेराइजेशन द्वारा फुफ्फुसीय धमनी रक्तचाप की जांच करना। हालांकि, इन अप्रत्यक्ष परखों के कई नुकसान हैं, जैसे संरचनात्मक कारकों से भ्रमित होना, पूरे फेफड़ों के पैमाने 6,7 में वायुमार्ग या संवहनी प्रतिक्रियाओं की स्थानिक विविधता को पकड़ने में विफल रहना, और सेलुलर स्तर पर सिकुड़ा हुआ विनियमन के यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुपयुक्त। इसलिए, पृथक प्राथमिक कोशिकाओं, श्वासनली / ब्रांकाई मांसपेशी स्ट्रिप्स 8,9, या बड़े संवहनी खंड10 का उपयोग करके वैकल्पिक दृष्टिकोण इन विट्रो में एसएमसी अध्ययन के लिए लागू किए गए हैं। फिर भी, इन तरीकों की सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, संस्कृति की स्थिति11,12 में प्राथमिक एसएमसी का एक त्वरित फेनोटाइपिकल अनुकूलन सेल संस्कृति से विवो सेटिंग्स में निष्कर्षों को एक्सट्रपलेशन करने के लिए समस्याग्रस्त बनाता है। इसके अलावा, पृथक समीपस्थ वायुमार्ग या संवहनी खंडों में एसएमसी का सिकुड़ा हुआ फेनोटाइप डिस्टल फेफड़े 6,7 में एसएमसी का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसके अलावा, ऊतक स्तर पर मांसपेशी बल माप आणविक और सेलुलर घटनाओं से अलग रहता है जो सिकुड़ा हुआ विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए आवश्यक हैं।
प्रेसिजन-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस), एक जीवित फेफड़े के ऊतक अनुभाग, फुफ्फुसीय एसएमसी को निकट विवो माइक्रोएनवायरनमेंट (यानी, संरक्षित बहु-सेलुलर वास्तुकला और बातचीत) में चिह्नित करने के लिए एक आदर्श पूर्व विवो उपकरण प्रदान करता है। प्लैक और फिशर ने पहली बार 1980 के दशक 14,15 में एगरोज-फुलाए हुए चूहे और हैम्स्टर फेफड़ों से फेफड़ों के स्लाइसकी तैयारी शुरू की थी, इसलिए इस तकनीक को जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता और अधिक बहुमुखी प्रतिभा के साथ पीसीएलएसएस प्रदान करने के लिए लगातार उन्नत किया गया है। एक महत्वपूर्ण सुधार श्वासनली के माध्यम से एगरोज के साथ फेफड़ों की मुद्रास्फीति के अलावा जिलेटिन जलसेक द्वारा फुफ्फुसीय धमनी संरक्षण की वृद्धि है। नतीजतन, वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों दोनों को पूर्व विवो मूल्यांकन16 के लिए पीसीएलएस में बरकरार रखा जाता है। इसके अलावा, पीसीएलएसएस संस्कृति में लंबे समय तक व्यवहार्य है। उदाहरण के लिए, माउस पीसीएलएसएस में संस्कृति में कम से कम 12 दिनों के लिए सेल व्यवहार्यता और चयापचय में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ, साथ ही, उन्होंने 7 दिनों17 दिनों तक वायुमार्ग संकुचन को बनाए रखा। इसके अलावा, पीसीएलएस संकुचन और विश्राम परख के लिए विभिन्न आकार के वायुमार्ग या जहाजों को रखता है। इसके अलावा, एसएमसी के इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग, सेल सिकुड़न का निर्धारक कारक, सीए2 + रिपोर्टर रंगों के साथ एक कॉन्फोकल या 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप13 द्वारा चित्रित किया जा सकता है।
फेफड़ों के अनुसंधान में माउस मॉडल के व्यापक अनुप्रयोग को ध्यान में रखते हुए, पूर्व विवो फेफड़ों के अनुसंधान के लिए बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनियों के साथ माउस पीसीएलएस तैयार करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तैयार पीसीएलएसएस का उपयोग करते हुए, हमने बाद में दिखाया कि संकुचित या आराम उत्तेजनाओं के लिए वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कैसे किया जाए। इसके अलावा, सीए2 + रिपोर्टर डाई के साथ पीसीएलएस लोड करने की विधि और फिर सिकुड़ा हुआ या आराम प्रतिक्रियाओं से जुड़े एसएमसी के इमेजिंग सीए2 + सिग्नलिंग का भी वर्णन किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) क्रमशः एयरफ्लो प्रतिरोध और फुफ्फुसीय परिसंचरण को संशोधित करने के लिए वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी के संकुचन की मध्यस्थता करती हैं, इसलिए फुफ्फुसीय प्रणाली के होमोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एसएमसी संकुचन का विनियमन अस्थमा और फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप सहित कई फुफ्फुसीय बीमारियों में योगदान देता है। हालांकि, सीमित ऊतक पहुंच और विवो एसएमसी फेनोटाइप में बनाए रखने के लिए संस्कृति प्रणालियों की कमी के कारण, इन बीमारियों में विनियमित एसएमसी संकुचन के अंतर्निहित आणविक तंत्र पूरी तरह से पहचाने जाते हैं। सटीक कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) एक पूर्व विवो मॉडल प्रदान करता है जो इन तकनीकी कठिनाइयों को दरकिनार करता है। एक जीवित, पतले फेफड़ों के ऊतक अनुभाग के रूप में, पीसीएलएस प्राकृतिक परिवेश में एसएमसी को बरकरार रखता है और एसएमसी संकुचन और इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग के सीटू ट्रैकिंग में अनुमति देता है जो एसएमसी संकुचन को नियंत्रित करता है। यहां, एक विस्तृत माउस पीसीएलएस तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनियों को संरक्षित करता है। इस प्रोटोकॉल में फेफड़ों के लोब को टुकड़ा करने की क्रिया के अधीन करने से पहले दो आवश्यक चरण शामिल हैं: श्वासनली के माध्यम से कम पिघलने-बिंदु एगरोज के साथ वायुमार्ग को फुलाना और दाएं वेंट्रिकल के माध्यम से जिलेटिन के साथ फुफ्फुसीय वाहिकाओं को भरना। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए पीसीएलएस का उपयोग वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी डिब्बों दोनों में एसएमसी के सीए2 +-मध्यस्थता सिकुड़ा हुआ विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए बायोएसेस के लिए किया जा सकता है। जब श्वसन रोगों के माउस मॉडल पर लागू किया जाता है, तो यह प्रोटोकॉल एसएमसी की कार्यात्मक जांच को सक्षम बनाता है, जिससे रोगों में एसएमसी संकुचन विनियमन के अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है।

माउस पीसीएलएस तैयारी बरकरार इंट्रापल्मोनरी वायुमार्ग और धमनियों को संरक्षित करना उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत एक 150 μm मोटी पीसीएलएस देखी गई थी। माउस फेफड़ों में, प्रवाहकीय वायुमार्ग ?...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

वर्तमान प्रोटोकॉल लगभग विवो परिवेश में वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के संकुचन का आकलन करने के लिए माउस परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस तैयार करने और उपयोग करने का वर्णन करता है।

वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ विनियमन का अध्ययन करने के लिए प्रेसिजन-कट फेफड़े के टुकड़े का उपयोग करना

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

पीसीएलएस लगभग बरकरार ऊतक वातावरण में वायुमार्ग और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका गतिविधि के मूल्यांकन का समर्थन करता है, जिससे फुफ्फुसीय अनुसंधान के लिए एक अमूल्य पूर्व विवो मॉडल प्रदान किया जाता है। चिकनी मांसपेशियों के अनुसंधान के संदर्भ में, सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के विवो फेनोटाइप और आसपास की संरचनाओं के साथ उनकी बातचीत को संरक्षित करते हैं, जबकि चिकनी मांसपेशी कोशिका तक पहुंच की अनुमति देते हैं, जो सेलुलर स्तर पर एक यांत्रिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, लापरवाह स्थिति में एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस शरीर जगह।पूंछ, सामने के पंजे, और सिर को 25 जी सिरिंज सुइयों के साथ पिन करें और 70% इथेनॉल के साथ शरीर को साफ करें। डायाफ्राम के ऊपर उरोस्थि और द्विपक्षीय अवर रिब पिंजरे के साथ छाती गुहा को सावधानीपूर्वक खोलें। फिर, तेज कैंची टिप को फेफड़ों के ऊतकों से दूर इंगित करें और दिल को उजागर करने के लिए द्विपक्षीय उदर रिब पिंजरों के हिस्से को हटा दें।ध्यान दें कि छाती गुहा खुलने पर फेफड़ों के लोब गिर जाते हैं। श्वासनली को उजागर करने के लिए माउस गर्दन में नरम ऊतक को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें। श्वासनली के ऊपरी छोर पर 1.2 मिलीमीटर व्यास का एक छोटा छेद बनाएं जो 20 जी वाई के आकार के चतुर्थ कैथेटर टिप के पारित होने की अनुमति देनी चाहिए।वाई-आकार के कैथेटर के एक एडाप्टर पोर्ट को 0.5 मिलीलीटर हवा के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज के साथ कनेक्ट करें और 3 मिलीलीटर सिरिंज के साथ दूसरे बंदरगाह को 1.5% एगरोज समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। कैथेटर को भरने के लिए एगरोज़ समाधान इंजेक्ट करें और फिर कैथेटर को खोलने के माध्यम से श्वासनली में 5 से 8 मिलीमीटर तक धक्का दें। धीरे-धीरे 1 मिलीलीटर प्रति 5 सेकंड की दर से एगरोज़ समाधान इंजेक्ट करें।ध्यान दें कि फेफड़े समीपस्थ से डिस्टल अक्ष के साथ फैलता है। इंजेक्शन बंद करो जब प्रत्येक फेफड़े के लोब के किनारे फुलाया जाता है। फिर, अवशिष्ट एगरोज को प्रवाहकीय वायुमार्ग में डिस्टल एल्वियोली स्पेस में धकेलने के लिए अन्य सिरिंज से 0.2 से 0.3 मिलीलीटर हवा इंजेक्ट करें।क्लिप घुमावदार हेमोस्टैटिक संदंश की एक जोड़ी के साथ श्वासनली बंद कर दिया. फुफ्फुसीय वास्कुलचर को भरने के लिए, गर्म 6% जिलेटिन के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और इसे सुई खोपड़ी नस कैथेटर से कनेक्ट करें। जिलेटिन समाधान के साथ कैथेटर को भरें और फिर सुई के साथ अवर दीवार के करीब दाएं वेंट्रिकल को पंचर करें।सुई को दाएं वेंट्रिकल में 2 से 3 मिलीमीटर के लिए धक्का दें और सुई टिप को मुख्य फुफ्फुसीय धमनी में इंगित करें। लगभग 0.2 मिलीलीटर जिलेटिन समाधान को धीरे-धीरे दाहिने वेंट्रिकल और फुफ्फुसीय धमनी वाहिकाओं में इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद सुई को पांच मिनट तक रखें और दिल और फेफड़ों पर बर्फ ठंडा एचबीएसएस घोल डालकर फेफड़ों के लोब को ठंडा करें और शरीर को रेफ्रिजरेटर में रखें।इस कदम के बाद, कैंची के साथ आसपास के संयोजी ऊतकों से माउस फेफड़े और दिल को हटा दें। फिर, प्रत्येक फेफड़े के लोब को अलग करें और उन्हें बर्फ पर एचबीएसएस समाधान में रखें। फेफड़ों के लोब को ट्रिम करें और इसे इस तरह उन्मुख करें कि काटने की दिशा हिला से फेफड़ों की सतह तक अधिकांश वायुमार्गों के लंबवत हो।सुपर गोंद के साथ नमूना स्तंभ के शीर्ष पर इसे संलग्न करें। फेफड़ों के लोब को 150 माइक्रोमीटर स्लाइस में काटने के लिए एक ताजा पतली रेजर ब्लेड के साथ एक वाइब्रेटोम का उपयोग करें। ठंडे एचबीएसएस समाधान के साथ पहले से भरे बाँझ पेट्री व्यंजनों में स्लाइस ले लीजिए।एफ -12 संस्कृति माध्यम से भरे पेट्री व्यंजनों में स्लाइस स्थानांतरित करें। प्रयोगों से पहले रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में व्यंजन रखें। एचबीएसएस से भरे 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक एकल परिशुद्धता-कट फेफड़ों का टुकड़ा रखें।अच्छी तरह से के बीच में टुकड़ा का पता लगाएं और फिर एक पिपेट के साथ एचबीएसएस समाधान को हटा दें। माइक्रोस्कोप के तहत, स्लाइस में लक्ष्य वायुमार्ग और पोत ढूंढें और फिर लक्षित वायुमार्ग पोत क्षेत्र को उजागर करने के लिए एक प्रीकट केंद्रीय छेद के साथ नायलॉन जाल का उपयोग करके इसे कवर करें। स्लाइस को जगह में रखने के लिए जाल के ऊपर एक खोखला धातु वॉशर रखें।फिर, स्लाइस को डुबोने के लिए एचबीएसएस समाधान के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। 10 मिनट के बाद, आधारभूत छवियों को रिकॉर्ड करें। वायुमार्ग या संवहनी संकुचन को प्रेरित करने के लिए, सावधानीपूर्वक एक पिपेट के साथ एचबीएसएस समाधान को हटा दें और एगोनिस्ट के साथ एचबीएसएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें।कैल्शियम डाई लोडिंग बफर तैयार करने के लिए, पहले डीएमएसओ के 10 माइक्रोलीटर और डीएमएसओ के 1 मिलीलीटर में 0.2 ग्राम प्लूरोनिक एफ -12 पाउडर के साथ 50 माइक्रोग्राम डाई भंग करें। कैल्शियम डाई समाधान के 10 माइक्रोलीटर के साथ प्लूरोनिक समाधान के 10 माइक्रोलीटर मिलाएं। इस मिश्रण को एचबीएसएस समाधान के 2 मिलीलीटर में जोड़ें जिसमें सल्फोब्रोमोफ्थेलिन के 200 माइक्रोमोलर होते हैं।फिर, कैल्शियम लोडिंग बफर के 2 मिलीलीटर में 15 सटीक-कट फेफड़ों के स्लाइस रखें और एक घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, इसके बाद एचबीएसएस में 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोमोलर सल्फोब्रोमोफथेलिन युक्त इनक्यूबेट करें। फिर, एक बड़े कवर ग्लास पर कैल्शियम डाई लोडेड स्लाइस रखें। 18 जी कुंद सुई या 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप से जुड़ी 3 मिलीलीटर सिरिंज में उच्च वैक्यूम सिलिकॉन ग्रीस भरें और स्लाइस के ऊपर और नीचे कवर ग्लास में दो समानांतर रेखाएं खींचें।दो तेल लाइनों के बीच एक नायलॉन जाल का उपयोग करके टुकड़ा कवर करें। एक कक्ष उत्पन्न करने के लिए जाल के शीर्ष पर दूसरा कवर ग्लास रखें। एक पिपेट के साथ एक छोर से कक्ष में एचबीएसएस या एक एगोनिस्ट समाधान जोड़ें।टिशू पेपर के साथ दूसरे छोर से चूषण करके कक्ष से तरल पदार्थ निकालें। टुकड़ा का कक्ष अब एक उच्च गति लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कैल्शियम इमेजिंग के लिए तैयार है। फुफ्फुसीय वायुमार्ग धमनी बंडलों को एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत 150 माइक्रोमीटर मोटाई के सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस में देखा गया था।आराम की स्थिति में, पास के फुफ्फुसीय धमनी के साथ घनाभ उपकला कोशिकाओं द्वारा एक वायुमार्ग की पहचान की गई थी। मेथाकोलाइन के संपर्क में आने के बाद, ल्यूमिनल क्षेत्र कम हो गया था जबकि फुफ्फुसीय धमनी ने उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखाई। वायुमार्ग सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को ल्यूमिनल क्षेत्र में कमी के प्रतिशत से निर्धारित किया गया था और एक दिन और पांच दिवसीय संस्कृतियों में समान खुराक निर्भर प्रतिक्रियाएं दिखाई गईं।परिधीय फेफड़ों के क्षेत्र तक पहुंचने पर, प्रवाहकीय वायुमार्ग श्वसन नलिकाओं और छोटे इंट्रा-एसिनार धमनियों के आसपास थैली में शाखा करता है। एंडोथेली के संपर्क में आने पर वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियां दोनों संकुचित हो जाती हैं, जिसके बाद एनओसी -5 प्रेरित विश्राम होता है। आराम की स्थिति में, कैल्शियम डाई लोड स्लाइस ने एक कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत वायुमार्ग और संवहनी प्रणाली की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में कम प्रतिदीप्ति दिखाई।एगोनिस्ट के संपर्क में आने पर, कैल्शियम प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं में बढ़ जाती है और पूरे सेल में फैल जाती है, जो दोलन संकेतों के साथ सहसंबद्ध होती है। तकनीक के अनुसार, फेफड़ों को एगरोज़ के साथ सजातीय रूप से फुलाना और त्वरित या अत्यधिक एगरोज़ इंजेक्शन से बचना आवश्यक है। प्रवाहकीय वायुमार्ग से डिस्टल एल्वियोली अंतरिक्ष में एगरोज को फ्लश करने के लिए हमेशा अंत में हवा को धक्का दें।संक्षेप में, परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस संस्कृति का उपयोग करके, कोई भी फुफ्फुसीय चिकनी मांसपेशियों के कार्यों की एक विशेष विविधता प्रदान कर सकता है और इन विट्रो में चिकनी मांसपेशियों के विनियमन को मॉडल कर सकता है। यह नोवो वासोडिलेटरी या ब्रोंकोडायलेटर दवाओं को स्क्रीन करने के लिए एक आदर्श मंच भी प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

छिपकली में और गति की गति और दिशा के लिए दृश्य संवेदनशीलता परीक्षण

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

कंप्यूटर जनित पशु मॉडल उत्तेजनाओं

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

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Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

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Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

नाइट्रिक ऑक्साइड और कोशिकाओं से superoxide इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कट्टरपंथी आयनों की जांच स्पिन जाल का उपयोग

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Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

धमनी चिकनी पेशी Kv7 पोटेशियम चैनल फंक्शन तलाश पैच दबाना इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी और दबाव Myography का उपयोग

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

औषध अनुसंधान के लिए अलग ऊतक स्नान-अनुप्रयोगों में चिकनी मांसपेशी समारोह के मापन

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...