Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee del Massachusetts General Hospital. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi di tipo C57/B6 di tipo selvatico, di 8 settimane di età.
1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Preparare la soluzione di lavoro.<ol>
<li>Preparare 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, con Ca2+ e Mg2+, e pH bilanciato con 20 mM HEPES, vedere Tabel...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

La preparazione di PCLS comporta diversi passaggi critici. In primo luogo, è essenziale gonfiare il lobo polmonare in modo omogeneo per evitare la variazione della rigidità dei tessuti da distribuzione irregolare dell'agarosio. Poiché l'agarosio liquido si gelifica rapidamente in cateteri sottili o vie aeree a una temperatura inferiore a 37 °C, il conseguente difetto di riempimento nel campo polmonare distale potrebbe aumentare la disparità di rigidità del tessuto polmonare e causare lacerazione del tessuto durante...

Le cellule muscolari lisce (SMC) sono un importante tipo di cellula strutturale nel polmone, che risiede principalmente nella parete media delle vie aeree e dei vasi polmonari. Gli SMC si contraggono per alterare il calibro luminale, regolando così l'aria e il flusso sanguigno 1,2. Pertanto, la regolazione contrattile delle SMC è essenziale per mantenere l'omeostasi della ventilazione dell'aria e della circolazione polmonare. Al contrario, la contrattilità Aberrante SMC provoca vie aeree ostruttive o malattie vascolari polmonari come l'asma e l'ipertensione arteriosa polmonare. Tuttavia, la valutazione funzionale delle SMC polmonari è stata messa in discussione da un accesso limitato al tessuto polmonare, in particolare quelle piccole vie aeree e microvasi nella parte distale del polmone 2,3. Le soluzioni attuali ricorrono a saggi indiretti, come la misurazione della resistenza del flusso d'aria da parte di Flexivent per riflettere la costrizione delle vie aeree e il controllo della pressione arteriosa polmonare mediante cateterizzazione del cuore destro per valutare la vasocontrazione polmonare 4,5. Tuttavia, questi saggi indiretti presentano molteplici svantaggi, come essere confusi da fattori strutturali, non riuscire a catturare la diversità spaziale delle vie aeree o delle risposte vascolari nell'intera scala polmonare 6,7 e inadatti allo studio meccanicistico della regolazione contrattile a livello cellulare. Pertanto, per lo studio SMC sono stati applicati approcci alternativi che utilizzano cellule primarie isolate, strisce muscolari trachea/bronchi 8,9 o grandi segmenti vascolari10. Tuttavia, questi metodi hanno anche delle limitazioni. Ad esempio, un rapido adattamento fenotipico delle SMC primarie nella condizione di coltura11,12 rende problematico estrapolare i risultati dalla coltura cellulare alle impostazioni in vivo. Inoltre, il fenotipo contrattile delle SMC nelle vie aeree prossimali isolate o nei segmenti vascolari può non rappresentare le SMC nel polmone distale 6,7. Inoltre, la misurazione della forza muscolare a livello tissutale rimane dissociata dagli eventi molecolari e cellulari che sono essenziali per la comprensione meccanicistica della regolazione contrattile.
La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS), una sezione di tessuto polmonare vivo, fornisce uno strumento ex vivo ideale per caratterizzare le SMC polmonari in un microambiente quasi in vivo (cioè l'architettura e l'interazione multicellulare conservate)13. Da quando i dottori Placke e Fisher hanno introdotto per la prima volta la preparazione di fette polmonari da polmoni di ratto e criceto gonfiati di agarosio negli anni 1980 14,15, questa tecnica è stata continuamente avanzata per fornire AI PCLS una qualità superiore e una maggiore versatilità per la ricerca biomedica. Un miglioramento significativo è il miglioramento della conservazione arteriosa polmonare mediante infusione di gelatina oltre al gonfiaggio polmonare con agarosio attraverso la trachea. Di conseguenza, sia le vie aeree che le arterie polmonari sono mantenute intatte nel PCLS per la valutazione ex vivo 16. Inoltre, il PCLS è praticabile per un tempo prolungato in coltura. Ad esempio, i PCLS di topo non hanno avuto cambiamenti significativi nella vitalità cellulare e nel metabolismo per un minimo di 12 giorni in coltura, oltre a mantenere la contrattilità delle vie aeree fino a 7 giorni17. Inoltre, PCLS mantiene vie aeree o vasi di dimensioni diverse per i test di contrazione e rilassamento. Inoltre, la segnalazione intracellulare Ca2+ delle SMC, il fattore determinante della contrattilità cellulare, può essere dosata con coloranti Reporter Ca2+ ripresi da un microscopio confocale o a 2 fotoni13.
Considerando l'ampia applicazione del modello murino nella ricerca polmonare, qui viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di PCLS murini con vie aeree intatte e arterie intrapolmonari per la ricerca polmonare ex vivo . Utilizzando i PCLS preparati, abbiamo successivamente dimostrato come valutare le vie aeree e le risposte arteriose polmonari a stimoli costrittivi o rilassanti. Inoltre, viene descritto anche il metodo di caricamento del PCLS con colorante reporter Ca2+ e quindi l'imaging della segnalazione Ca2+ di SMC associati a risposte contrattili o rilassanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Le cellule muscolari lisce (SMC) mediano la contrazione delle vie aeree e dell'arteria intrapolmonare per modificare rispettivamente la resistenza al flusso d'aria e la circolazione polmonare, svolgendo quindi un ruolo critico nell'omeostasi del sistema polmonare. La deregolamentazione della contrattilità SMC contribuisce a diverse malattie polmonari, tra cui l'asma e l'ipertensione polmonare. Tuttavia, a causa del limitato accesso ai tessuti e della mancanza di sistemi di coltura per mantenere fenotipi SMC in vivo , i meccanismi molecolari alla base della contrattilità SMC deregolata in queste malattie rimangono pienamente identificati. La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS) offre un modello ex vivo che aggira queste difficoltà tecniche. Come sezione di tessuto polmonare vivo e sottile, il PCLS mantiene l'SMC in un ambiente naturale e consente il monitoraggio in situ della contrazione SMC e della segnalazione intracellulare Ca2+ che regola la contrattilità SMC. Qui viene fornito un protocollo dettagliato di preparazione PCLS del topo, che conserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari. Questo protocollo prevede due passaggi essenziali prima di sottoporre il lobo polmonare all'affettamento: gonfiare le vie aeree con agarosio a basso punto di fusione attraverso la trachea e riempire i vasi polmonari con gelatina attraverso il ventricolo destro. Il PCLS preparato utilizzando questo protocollo può essere utilizzato per biosaggi per valutare la regolazione contrattile mediata da Ca2+ di SMC sia nelle vie aeree che nei compartimenti arteriosi intrapolmonari. Quando applicato a modelli murini di malattie respiratorie, questo protocollo consente l'indagine funzionale di SMC, fornendo così informazioni sul meccanismo alla base della deregolazione della contrattilità SMC nelle malattie.

Preparazione PCLS del topo che preserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari Un PCLS di 150 μm di spessore è stato osservato al microscopio a contrasto di fase invertito. Nei polmoni di topo, le vie aeree conduttive sono accompagnate da arterie intrapolmonari, che vanno dall'ilo al polmone periferico. Un fascio rappresentativo delle vie aeree-arterie polmonari in un PCLS di topo è mostrato nella Figura 2B. Le vie aeree possono essere facilmente identificate...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

Il PCLS supporta la valutazione dell'attività delle cellule muscolari lisce delle vie aeree e vascolari in un ambiente tissutale quasi intatto, fornendo così un prezioso modello ex vivo per la ricerca polmonare. In termini di ricerca sulla muscolatura liscia, le fette polmonari tagliate con precisione preservano il fenotipo in vivo delle cellule muscolari lisce e la loro interazione con le strutture circostanti, consentendo al contempo l'accesso alla cellula muscolare liscia, che è importante per uno studio meccanicistico a livello cellulare. Per iniziare, posizionare il corpo del mouse su una scheda di dissezione in posizione supina.Fissa la coda, le zampe anteriori e la testa con aghi per siringhe da 25 G e disinfetta il corpo con il 70% di etanolo. Aprire attentamente la cavità toracica lungo lo sterno e la gabbia toracica inferiore bilaterale sopra il diaframma. Quindi, puntare la punta affilata della forbice lontano dal tessuto polmonare e rimuovere parte delle gabbie costali ventrali bilaterali per esporre il cuore.Osservare che i lobi polmonari collassano quando si apre la cavità toracica. Utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti molli nel collo del topo per esporre la trachea. All'estremità superiore della trachea fare un piccolo foro di diametro 1,2 millimetri che dovrebbe consentire il passaggio di una punta del catetere IV a forma di Y da 20 G.Collegare una porta adattatore del catetere a forma di Y con una siringa da 3 millilitri preriempita con 0,5 millilitri di aria e l'altra porta con una siringa da 3 millilitri preriempita con 2 millilitri di soluzione di agarosio all'1,5% riscaldata a 42 gradi Celsius. Iniettare la soluzione di agarosio per riempire il catetere e quindi spingere il catetere attraverso l'apertura nella trachea a 5-8 millimetri. Iniettare lentamente la soluzione di agarosio ad una velocità di 1 millilitro ogni 5 secondi.Osservare che il polmone si espande lungo l'asse prossimale a quello distale. Interrompere l'iniezione quando il bordo di ciascun lobo polmonare è gonfiato. Quindi, iniettare da 0,2 a 0,3 millilitri di aria dall'altra siringa per spingere l'agarosio residuo nelle vie aeree conduttive nello spazio degli alveoli distali.Clip chiuse la trachea con un paio di pinze emostatiche curve. Per riempire la vascolarizzazione polmonare, riempire una siringa da 1 millilitro con gelatina calda al 6% e collegarla a un catetere venoso aghino. Riempire il catetere con una soluzione di gelatina e quindi perforare il ventricolo destro vicino alla parete inferiore con l'ago.Spingere l'ago per 2-3 millimetri nel ventricolo destro e puntare la punta dell'ago verso l'arteria polmonare principale. Iniettare lentamente circa 0,2 millilitri di soluzione di gelatina nel ventricolo destro e nei vasi arteriosi polmonari. Tenere l'ago in posizione per cinque minuti dopo l'iniezione e raffreddare i lobi polmonari versando la soluzione di HBSS ghiacciata sul cuore e sui polmoni e mettere il corpo in frigorifero.Dopo questo passaggio, rimuovere il polmone e il cuore del topo dai tessuti connettivi circostanti con le forbici. Quindi, separare ogni lobo polmonare e tenerli in soluzione HBSS sul ghiaccio. Tagliare il lobo polmonare e orientarlo in modo tale che la direzione di taglio sia perpendicolare alla maggior parte delle vie aeree dall'hila alla superficie polmonare.Attaccalo sopra la colonna del campione con super colla. Utilizzare un vibratoma con una lama di rasoio sottile fresca per tagliare il lobo polmonare in fette di 150 micrometri. Raccogliere le fette in piastre di Petri sterili preriempite con soluzione fredda di HBSS.Trasferire le fette in piastre di Petri riempite con terreno di coltura DMEM/F-12. Metti i piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte prima degli esperimenti. Posizionare una singola fetta polmonare tagliata con precisione in ogni pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti riempita con HBSS.Posizionare la fetta al centro del pozzetto e quindi rimuovere la soluzione HBSS con una pipetta. Al microscopio, trova le vie aeree e la nave bersaglio nella fetta e poi coprila usando una rete di nylon con un foro centrale pretagliato per esporre l'area del vaso delle vie aeree mirato. Metti una rondella metallica cava sopra la rete per tenere le fette in posizione.Quindi, aggiungere 600 microlitri di soluzione HBSS per immergere le fette. Dopo 10 minuti, registrare le immagini di base. Per indurre le vie aeree o la contrazione vascolare, rimuovere con cautela la soluzione HBSS con una pipetta e aggiungere 600 microlitri di HBSS con un agonista.Per preparare il tampone di carico del colorante di calcio, prima sciogliere 50 microgrammi di colorante con 10 microlitri di DMSO e 0,2 grammi di polvere Pluronic F-12 in 1 millilitro di DMSO. Mescolare 10 microlitri della soluzione Pluronic con 10 microlitri di soluzione di colorante di calcio. Aggiungere questa miscela a 2 millilitri di soluzione HBSS contenente 200 micromolari di sulfobromophthalein.Quindi, posizionare 15 fette polmonari tagliate con precisione in 2 millilitri di tampone di carico di calcio e incubare a 30 gradi Celsius per un'ora, seguite dall'incubazione in HBSS contenente 100 sulfobromophthalein micromolare per 30 minuti. Quindi, posizionare le fette caricate con colorante di calcio su un grande vetro di copertura. Riempire il grasso siliconico ad alto vuoto in una siringa da 3 millilitri attaccata ad un ago smussato da 18 G o una punta di pipetta da 200 microlitri e disegnare due linee parallele attraverso il vetro di copertura, sopra e sotto la fetta.Coprire la fetta con una rete di nylon tra due linee di grasso. Posizionare il secondo vetro di copertura sopra la rete per generare una camera. Aggiungere HBSS o una soluzione agonista nella camera da un'estremità con una pipetta.Rimuovere il fluido dalla camera aspirando dall'altra estremità con carta velina. La camera della fetta è ora pronta per l'imaging del calcio con un microscopio confocale a scansione laser ad alta velocità. Fasci di arterie delle vie aeree polmonari sono stati osservati in fette polmonari tagliate con precisione di spessore 150 micrometri al microscopio a contrasto di fase.Allo stato di riposo, una via aerea è stata identificata da cellule epiteliali cuboidali con un'arteria polmonare vicina. Dopo l'esposizione alla metacolina, l'area luminale è stata ridotta mentre l'arteria polmonare non ha mostrato alcuna risposta agli stimoli. Le risposte contrattili delle vie aeree sono state quantificate dalla percentuale di riduzione dell'area luminale e hanno mostrato risposte dose-dipendenti simili in colture di un giorno e cinque giorni.Dopo aver raggiunto il campo polmonare periferico, le vie aeree conduttive si ramificano nei dotti respiratori e nelle sacche che circondano le piccole arteriole intra-acinari. Quando esposti agli endoteli, sia le vie aeree che le arterie polmonari si restringono, che è seguito da un rilassamento indotto da NOC-5. Allo stato di riposo, le fette caricate con colorante di calcio hanno mostrato una bassa fluorescenza nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree e del sistema vascolare sotto un microscopio fluorescente confocale.Dopo l'esposizione agli agonisti, l'intensità della fluorescenza del calcio aumentava nelle cellule e si propagava all'intera cellula, che si correlava con i segnali oscillatori. Dal punto di vista tecnico, è essenziale gonfiare il polmone con agarosio in modo omogeneo ed evitare un'iniezione rapida o eccessiva di agarosio. Spingere sempre l'aria alla fine per lavare l'agarosio dalle vie aeree conduttive allo spazio degli alveoli distali.In sintesi, utilizzando la coltura di fette polmonari tagliate con precisione, si può fornire una speciale varietà di funzioni muscolari lisce polmonari e modellare la deregolazione della muscolatura liscia in vitro. Fornisce anche una piattaforma ideale per lo screening di farmaci novo vasodilatatori o broncodilatatori.

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