Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

この作業は、NIH grants, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) によってサポートされています。

すべての動物ケアは、マサチューセッツ総合病院の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていました。野生型C57/B6雄マウス(8週齢)を本研究に使用した。
1. 実験準備
<ol><li>作業ソリューションを準備します。<ol>
<li>1x ハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca2+およびMg2+ 、およびpHを20mM HEPESと平衡、 材料表を参照)を調製する。...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

PCLSの準備には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、不均一なアガロース分布からの組織剛性の変動を避けるために、肺葉を均質に膨張させることが不可欠である。液体アガロースは、37°C未満の温度で薄いカテーテルまたは気道で急速にゲル化するので、結果として生じる遠位肺野の充填欠陥は、肺組織の硬さの格差を増加させ、ビブラトーム切片中に組織を引き裂く可能性が?...

平滑筋細胞(SMC)は、肺の主要な構造細胞型であり、主に気道および肺血管の培地壁に常在する。SMCは管腔口径を変化させるために収縮し、空気と血流を調節する 1,2.したがって、SMCの収縮性調節は、空気換気および肺循環の恒常性を維持するために不可欠である。対照的に、異常なSMC収縮性は、閉塞性気道または喘息および肺動脈性高血圧症のような肺血管疾患を引き起こす。しかしながら、肺SMCの機能評価は、肺組織、特に肺の遠位部にあるそれらの小さな気道および微小血管への限られたアクセスによって挑戦されてきた2,3。現在のソリューションは、気道狭窄を反映するためにFlexiventによって気流抵抗を測定し、肺血管収縮を評価するために右心カテーテル法によって肺動脈血圧をチェックするなどの間接アッセイに頼っています4,5。しかし、これらの間接アッセイには、構造的要因によって交絡される、肺スケール全体における気道または血管応答の空間的多様性を捉えることができない、細胞レベルでの収縮調節の機構的研究に適さないなど、複数の欠点がある。したがって、単離された初代細胞、気管/気管支筋ストリップ8、9、または大きな血管セグメント10を使用する代替アプローチが、インビトロでのSMC研究に適用されている。それにもかかわらず、これらの方法にも制限があります。例えば、培養条件11、12における初代SMCの迅速な表現型適応は、細胞培養からインビボ設定への所見を推定することを問題にする。加えて、単離された近位気道または血管セグメントにおけるSMCsの収縮表現型は、遠位肺におけるSMCsを表していなくてもよい6,7。さらに、組織レベルでの筋力測定は、収縮調節への機構的洞察に不可欠な分子的および細胞的事象から解離したままである。
生きた肺組織切片である精密切断肺スライス(PCLS)は、生体内に近い微小環境(すなわち、保存された多細胞構造と相互作用)で肺SMCを特徴付けるための理想的なエクスビボツールを提供します13。Placke博士とFisher博士が1980年代にアガロースで膨張したラットとハムスターの肺からの肺スライスの調製を初めて導入して以来、14,15、この技術はPCLSに生物医学研究のためのより高い品質と汎用性を提供するために継続的に進歩してきました。1つの重要な改善は、気管を介したアガロースによる肺膨張に加えて、ゼラチン注入による肺動脈保存の増強である。その結果、気道および肺動脈の両方が、エクスビボアッセイ16のためのPCLSにおいて無傷に保たれる。さらに、PCLSは、培養において長期間にわたって生存可能である。例えば、マウスPCLSは、培養において最低12日間、細胞生存率および代謝に有意な変化を示さず、ならびに、気道収縮性を最大7日間保持した17。さらに、PCLSは収縮およびリラクゼーションアッセイのために異なるサイズの気道または血管を保持します。さらに、SMCsの細胞内Ca2+シグナル伝達は、細胞収縮性の決定因子であり、共焦点または2光子顕微鏡13によって画像化されたCa2+レポーター色素を用いてアッセイすることができる。
肺研究におけるマウスモデルの広範な適用を考慮すると、 エクスビボ 肺研究のために無傷の気道および肺内動脈を有するマウスPCLSを調製するための詳細なプロトコルがここに記載されている。調製したPCLSを用いて、我々はその後、狭窄性または弛緩性刺激に対する気道および肺動脈応答を評価する方法を実証した。さらに、PCLSにCa2+ レポーター色素をロードし、次いで収縮性または弛緩性応答に関連するSMCのCa2+ シグナル伝達をイメージングする方法も記載されている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

平滑筋細胞(SMC)は、気道および肺内動脈の収縮を媒介して、それぞれ気流抵抗および肺循環を変化させ、したがって肺系の恒常性において重要な役割を果たしている。SMC収縮性の調節解除は、喘息および肺高血圧症を含むいくつかの肺疾患に寄与する。しかしながら、組織アクセスが制限され、インビボSMC表現型を維持するための培養系の欠如のために、これらの疾患における制御解除されたSMC収縮性の根底にある分子機構は完全に同定されたままである。精密切断肺スライス(PCLS)は、これらの技術的困難を回避するex vivoモデルを提供します。生きた薄い肺組織切片として、PCLSは自然環境においてSMCを保持し、SMC収縮およびSMC収縮性を調節する細胞内Ca2+シグナル伝達のその場での追跡を可能にする。ここでは、無傷の気道および肺内動脈を保存する詳細なマウスPCLS調製プロトコルが提供される。このプロトコルには、肺葉をスライスする前に、気管を通る低融点アガロースで気道を膨張させることと、右心室を通して肺血管にゼラチンを充填することの2つの重要なステップが含まれます。このプロトコルを使用して調製されたPCLSは、気道および肺内動脈区画の両方におけるSMCのCa2+媒介性収縮調節を評価するためのバイオアッセイに使用することができる。呼吸器疾患のマウスモデルに適用すると、このプロトコルはSMCの機能的調査を可能にし、それによって疾患におけるSMC収縮性調節緩和の根底にあるメカニズムへの洞察を提供する。

無傷の肺内気道および動脈を保存するマウスPCLS調製物 厚さ150μmのPCLSを倒立位相差顕微鏡で観察した。マウス肺では、伝導性気道は肺内動脈を伴い、丘陵から末梢肺まで走る。マウスPCLSにおける代表的な肺気道 - 動脈束を 図2Bに示す。気道は、内腔の内面を覆う活発な繊毛拍動を有する直方体上皮細胞によって容易に同定することができる。対照的に、?...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における 気道および肺内動脈平滑筋収縮性を評価することを記載している。

精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLSは、ほぼ無傷の組織環境における気道および血管平滑筋細胞活性の評価をサポートし、それによって肺研究のための非常に貴重なエクスビボモデルを提供する。平滑筋研究の面では、精密に切断された肺スライスは、平滑筋細胞のin vivo表現型およびそれらの周囲構造との相互作用を維持しながら、平滑筋細胞へのアクセスを可能にするが、これは細胞レベルでの機構的研究にとって重要である。まず、マウスの本体を仰臥位の解剖ボードの上に置きます。尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定し、70%エタノールで体を消毒します。胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を慎重に開きます。次に、鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけ、両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。胸腔が開くと肺葉が崩壊することを確認します。はさみを使用してマウス首の軟部組織を除去し、気管を露出させます。気管の上端に直径1.2ミリメートルの小さな穴を開けて、20G Y字型のIVカテーテルチップを通過させる必要があります。Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを、0.5ミリリットルの空気を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続し、もう一方のポートを摂氏42度に温めた2ミリリットルの1.5%アガロース溶液を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続します。アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、次にカテーテルを開口部から気管内に5〜8ミリメートルに押し込む。アガロース溶液を5秒あたり1ミリリットルの速度でゆっくりと注入する。肺が近位から遠位軸に沿って膨張するのを観察してください。各肺葉の端が膨らんだら注射を停止します。次に、他のシリンジから0.2〜0.3ミリリットルの空気を注入し、残留アガロースを遠位肺胞腔への導電性気道に押し込む。クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じた。肺血管系を充填するには、1ミリリットルのシリンジに暖かい6%ゼラチンを入れ、針頭皮静脈カテーテルに接続します。カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。針を右心室に2〜3ミリメートル押し込み、針先を主肺動脈に向けます。約0.2ミリリットルのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、体を冷蔵庫に入れます。このステップの後、はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。肺葉をトリミングし、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるように向きます。スーパー接着剤で試料カラムの上に取り付けます。新鮮な薄いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150マイクロメートルのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した滅菌ペトリ皿にスライスを集める。スライスをDMEM/F-12培養液で満たされたペトリ皿に移します。実験の前に一晩37°Cのインキュベーターに皿を置きます。HBSSで満たされた24ウェル培養プレートの各ウェルに単一の精密切断肺スライスを置きます。ウェルの中央にあるスライスの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。顕微鏡下で、スライス内の標的気道および血管を見つけ、次に、標的気道血管領域を露出させるために、予め切断された中央穴を有するナイロンメッシュを使用してそれを覆う。メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します。次に、600マイクロリットルのHBSS溶液を加えてスライスを沈める。10 分後、ベースライン イメージを記録します。気道または血管収縮を誘導するには、HBSS溶液をピペットで慎重に除去し、アゴニストと共に600マイクロリットルのHBSSを加える。カルシウム色素ローディングバッファーを調製するには、まず、50マイクログラムの色素を10マイクロリットルのDMSOおよび0.2グラムのプルロニックF-12粉末とともに1ミリリットルのDMSOに溶解する。10マイクロリットルのプルロニック溶液と10マイクロリットルのカルシウム色素溶液を混合する。この混合物を、200マイクロモルのスルホブロモフタレインを含む2ミリリットルのHBSS溶液に加える。次いで、2ミリリットルのカルシウムローディングバッファーに15個の精密切断肺スライスを入れ、摂氏30度で1時間インキュベートし、続いて100マイクロモルのスルホブロモフタレインを含むHBSS中で30分間インキュベートした。次に、カルシウム色素を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。高真空シリコーングリースを18G鈍針または200マイクロリットルピペットチップに取り付けられた3ミリリットルのシリンジに充填し、カバーガラスを横切ってスライスの上下に2本の平行線を引きます。2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。2 番目のカバー ガラスをメッシュの上に置き、チャンバーを生成します。HBSSまたはアゴニスト溶液をピペットで一端からチャンバーに入れる。ティッシュペーパーでもう一方の端から吸引することによってチャンバから流体を取り出す。スライスのチャンバーは、高速レーザー走査共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングの準備が整いました。肺気道動脈束を、位相差顕微鏡下で厚さ150マイクロメートルの精密切断肺スライスで観察した。安静状態では、近くの肺動脈を有する直方体上皮細胞によって気道が同定された。メタコリンへの曝露後、肺動脈は刺激に対する応答を示さなかったが、内腔領域は減少した。気道収縮応答は、管腔面積減少の割合によって定量化され、1日および5日間の培養において同様の用量依存性応答を示した。末梢肺野に到達すると、導電性気道は、小さな腺房内細動脈を囲む気管および嚢に分岐する。内皮に曝されると、気道および肺動脈の両方が収縮し、続いてNOC-5誘導弛緩が続く。安静状態では、カルシウム色素装填スライスは、共焦点蛍光顕微鏡下で気道および血管系の平滑筋細胞において低い蛍光を示した。アゴニストに曝露すると、カルシウム蛍光強度は細胞内で上昇し、細胞全体に伝播し、これは振動シグナルと相関した。賢明なテクニックでは、肺をアガロースで均質に膨張させ、迅速または過剰なアガロース注射を避けることが不可欠です。常に最後に空気を押して、アガロースを導電性気道から遠位肺胞空間に洗い流します。要約すると、精密切断肺スライス培養物を使用して、特別な様々な肺平滑筋機能を提供し、インビトロで平滑筋調節解除をモデル化することができる。また、novo血管拡張薬または気管支拡張薬をスクリーニングするための理想的なプラットフォームを提供します。

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

閉塞性気道疾患の発生研究のモデルとして使用されるマウスにおける異所性と同所性気管移植

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...