Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

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모든 동물 보호는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 이루어졌습니다. 8주령의 야생형 C57/B6 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 실험 준비
<ol><li>작업 솔루션을 준비하십시오.<ol>
<li>1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS, Ca2+ 및Mg2+ ,pH는 20mM HEPES로 균형을 이룬다, 자료표 참조)을 준비한다. HBSS 용?...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

PCLS의 준비에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 고르지 않은 아가로스 분포로부터 조직 경화의 변화를 피하기 위해 폐 엽을 균질하게 팽창시키는 것이 필수적이다. 액체 아가로스가 37°C 이하의 온도에서 얇은 카테터 또는 기도에서 빠르게 겔화됨에 따라, 원위 폐 필드의 결과적인 충전 결함은 폐 조직 강성의 불균형을 증가시키고 비브라톰 섹션 동안 조직 찢어짐을 야기할 수 있다. 따?...

평활근 세포 (SMC)는 폐의 주요 구조 세포 유형으로, 주로기도와 폐 혈관의 배지 벽에 상주합니다. SMC는 발광 구경을 변경하여 공기와 혈류를 조절하는 계약을 체결합니다 1,2. 따라서 SMC의 수축 조절은 공기 환기 및 폐 순환의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 대조적으로, 비정상적인 SMC 수축성은 천식 및 폐 동맥 고혈압과 같은 폐쇄성 기도 또는 폐 혈관 질환을 유발합니다. 그러나, 폐 SMCs의 기능적 평가는 폐 조직, 특히 폐 2,3의 원위 부분에서의 작은 기도 및 미세혈관에 대한 제한된 접근에 의해 도전 받고 있다. 현재의 솔루션은 기도 수축을 반영하기 위해 Flexivent에 의한 기류 저항을 측정하고, 폐 혈관 수축을 평가하기 위해 우심 카테터 삽입에 의한 폐 동맥 혈압을 검사하는 것과 같은 간접 분석에 의존합니다 4,5. 그러나, 이러한 간접 분석은 구조적 요인에 의해 혼동되고, 전체 폐 규모6,7에서 기도 또는 혈관 반응의 공간적 다양성을 포착하지 못하고, 세포 수준에서 수축 조절에 대한 기계론적 연구에 부적합하다는 것과 같은 여러 단점을 갖는다. 따라서, 단리된 일차 세포, 기관지/기관지 근육 스트립(8,9) 또는 큰 혈관 세그먼트(10)를 사용하는 대안적인 접근법이 시험관내 SMC 연구를 위해 적용되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법에도 한계가 있습니다. 예를 들어, 배양 조건(11,12)에서 일차 SMCs의 빠른 표현형 적응은 세포 배양으로부터 생체내 설정으로 소견을 추정하는 것을 문제시한다. 또한, 단리된 근위 기도 또는 혈관 세그먼트 내의 SMCs의 수축성 표현형은 원위 폐 6,7에서 SMCs를 나타내지 않을 수 있다. 또한, 조직 수준에서의 근육력 측정은 수축 조절에 대한 기계론적 통찰력에 필수적인 분자 및 세포 사건과 분리되어 있습니다.
살아있는 폐 조직 절편인 정밀 절단 폐 절편(PCLS)은 근적외선 미세환경(즉, 보존된 다세포 구조 및 상호작용)13에서 폐 SMC를 특성화하기 위한 이상적인 생체외 도구를 제공한다. Placke 박사와 Fisher 박사는 1980 년대14,15 년대에 아가로스 팽창 쥐와 햄스터 폐에서 폐 조각의 제조를 처음 도입 한 이래로,이 기술은 PCLS에 생물 의학 연구를위한 더 높은 품질과 더 큰 다양성을 제공하기 위해 지속적으로 발전해 왔습니다. 한 가지 중요한 개선은 기관을 통한 아가로오스로 인한 폐 인플레이션 외에도 젤라틴 주입에 의한 폐 동맥 보존의 향상입니다. 그 결과, 기도 및 폐동맥 둘 모두는 생체외 평가(16)를 위해 PCLS에서 온전하게 유지된다. 또한, PCLS는 문화에서 오랜 시간 동안 실행 가능합니다. 예를 들어, 마우스 PCLSs는 배양에서 최소 12일 동안 세포 생존력 및 대사에 큰 변화가 없었으며, 뿐만 아니라,17일까지 7일 동안 기도 수축성을 유지하였다. 또한 PCLS는 수축 및 이완 분석을 위해 다양한 크기의 기도 또는 혈관을 유지합니다. 더욱이, 세포 수축성의 결정인자인 SMCs의 세포내 Ca2+ 신호전달은 공초점 또는2-광자 현미경(13)에 의해 이미지화된Ca2+ 리포터 염료로 검정될 수 있다.
폐 연구에서 마우스 모델의 광범위한 적용을 고려할 때, 생체외 폐 연구를 위해 무손상 기도 및 폐동맥을 갖는 마우스 PCLS를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 준비된 PCLS를 사용하여, 우리는 수축성 또는 이완제 자극에 대한기도 및 폐 동맥 반응을 평가하는 방법을 후속 시연했습니다. 또한, PCLS를 Ca2+ 리포터 염료로 로딩한 다음, 수축성 또는 이완제 반응과 관련된 SMCs의Ca2+ 신호전달을 이미징하는 방법이 또한 기재되어 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

평활근 세포 (SMC)는기도와 폐 동맥의 수축을 매개하여 기류 저항과 폐 순환을 각각 수정하므로 폐 시스템의 항상성에 중요한 역할을합니다. SMC 수축성의 규제 완화는 천식 및 폐 고혈압을 포함한 여러 폐 질환에 기여합니다. 그러나, 제한된 조직 접근과 생체내 SMC 표현형을 유지하기 위한 배양 시스템의 부족으로 인해, 이들 질환에서 탈조절된 SMC 수축성의 기초가 되는 분자 메커니즘은 완전히 확인된 채로 남아 있다. 정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 이러한 기술적 어려움을 우회하는 생체 외 모델을 제공합니다. 살아있는 얇은 폐 조직 절편으로서 PCLS는 자연 환경에서 SMC를 유지하고 SMC 수축을 조절하는 SMC 수축 및 세포 내 Ca2+ 신호전달의 현장 추적을 허용합니다. 여기에서, 상세한 마우스 PCLS 준비 프로토콜이 제공되며, 이는 온전한 기도 및 폐동맥을 보존한다. 이 프로토콜은 폐 엽을 슬라이스하기 전에 두 가지 필수 단계를 포함합니다 : 기관을 통해 저융점 아가로오스로기도를 팽창시키고 우심실을 통해 젤라틴으로 폐 혈관을 채우십시오. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 PCLS는 기도 및 폐내 동맥 구획 모두에서 SMC의Ca2+ 매개 수축 조절을 평가하기 위한 생물 검정에 사용될 수 있습니다. 호흡기 질환의 마우스 모델에 적용될 때,이 프로토콜은 SMC의 기능적 조사를 가능하게하여 질병에서 SMC 수축성 조절 완화의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.

온전한 폐내 기도와 동맥을 보존하는 마우스 PCLS 제제 150 μm 두께의 PCLS를 반전된 위상차 현미경 하에서 관찰하였다. 마우스 폐에서 전도성 기도는 폐동맥을 동반하며, 힐러스에서 말초 폐까지 이어집니다. 마우스 PCLS에서 대표적인 폐기도-동맥 다발이 도 2B에 도시되어 있다. 기도는 루멘의 내부 표면을 감싸는 활성 실리얼 박동을 가진 입방체 상피 세포에 의?...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS는 거의 손상되지 않은 조직 환경에서기도 및 혈관 평활근 세포 활성의 평가를 지원하여 폐 연구를위한 귀중한 생체 외 모델을 제공합니다. 평활근 연구의 용어로, 정밀 절단 폐 조각은 평활근 세포의 생체 내 표현형과 주변 구조와의 상호 작용을 보존하면서 평활근 세포에 대한 접근을 허용하며, 이는 세포 수준에서 기계론적 연구에 중요합니다. 시작하려면 마우스 몸체를 수핀 위치의 해부 보드에 놓습니다.꼬리, 앞발 및 머리를 25G 주사기 바늘로 고정하고 70 % 에탄올로 몸을 살균하십시오. 흉강을 따라 조심스럽게 흉강을 열고 횡격막 위의 양측 열등한 흉곽을 엽니 다. 그런 다음 날카로운 가위 끝을 폐 조직에서 멀어지게하고 양측 복부 흉곽의 일부를 제거하여 심장을 노출시킵니다.흉강이 열리면 폐 엽이 붕괴되는 것을 관찰하십시오. 가위를 사용하여 마우스 목의 연조직을 제거하여 기관을 노출시킵니다. 기관의 상단부에서 직경 1.2 밀리미터의 작은 구멍을 만들어 20G Y 자형 IV 카테터 팁을 통과시켜야합니다.Y자형 카테터의 어댑터 포트 하나를 0.5밀리리터의 공기로 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결하고, 다른 포트에는 섭씨 42도까지 가온된 1.5%agarose 용액 2밀리리터가 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결합니다. 카테터를 채우기 위해 아가로스 용액을 주입 한 다음 카테터를 통해 기관 내로 5 ~ 8 밀리미터로 밀어 넣습니다. 천천히 아가로스 용액을 5 초 당 1 밀리리터의 속도로 주입하십시오.폐가 근위축에서 원위 축을 따라 확장되는 것을 관찰하십시오. 각 폐 엽의 가장자리가 팽창 될 때 주사를 중단하십시오. 그런 다음 다른 주사기에서 0.2 ~ 0.3 밀리리터의 공기를 주입하여 잔류 아가로스를 전도성 기도로 밀어 원위 폐포 공간으로 밀어 넣습니다.클립은 한 쌍의 곡선 지혈 포셉으로 기관을 닫았습니다. 폐 혈관 조직을 채우려면 따뜻한 6 % 젤라틴으로 1 밀리리터 주사기를 채우고 바늘 두피 정맥 카테터에 연결하십시오. 카테터에 젤라틴 용액을 채우고 바늘로 열등한 벽 가까이에서 우심실을 뚫습니다.바늘을 우심실에 2 ~ 3 밀리미터 동안 밀어 넣고 바늘 끝을 주요 폐동맥으로 향하게하십시오. 약 0.2 밀리리터의 젤라틴 용액을 우심실 및 폐 동맥 혈관에 천천히 주입하십시오. 주사 후 다섯 분 동안 바늘을 제자리에 유지하고 심장과 폐에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 부어 폐 엽을 식히고 몸을 냉장고에 넣으십시오.이 단계 후, 가위로 주변 결합 조직에서 마우스 폐와 심장을 제거한다. 그런 다음 각 폐엽을 분리하고 얼음 위의 HBSS 용액에 보관하십시오. 폐 엽을 다듬고 절단 방향이 힐라에서 폐 표면까지의 대부분의 기도에 수직이 되도록 방향을 정합니다.슈퍼 접착제로 표본 기둥 위에 부착하십시오. 신선한 얇은 면도날이있는 비브라 톰을 사용하여 폐 엽을 150 마이크로 미터 조각으로 자릅니다. 차가운 HBSS 용액으로 미리 채워진 멸균 페트리 접시에 조각을 모으십시오.슬라이스를 DMEM/F-12 배지로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 실험 전에 하룻밤 사이에 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 단일 정밀 절단된 폐 슬라이스를 HBSS로 채워진 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 배치한다.우물 중앙에서 슬라이스를 찾은 다음 피펫으로 HBSS 용액을 제거하십시오. 현미경으로 슬라이스에서 대상 기도와 용기를 찾은 다음 미리 절단된 중앙 구멍이 있는 나일론 메쉬를 사용하여 덮어 표적 기도 용기 영역을 노출시킵니다. 메쉬 위에 중공 금속 세탁기를 올려 조각을 제자리에 고정시킵니다.그런 다음 600 마이크로 리터의 HBSS 용액을 첨가하여 조각을 잠급니다. 10분 후에 기준 이미지를 기록합니다. 기도 또는 혈관 수축을 유도하려면 피펫으로 HBSS 용액을 조심스럽게 제거하고 600 마이크로 리터의 HBSS를 작용제로 첨가하십시오.칼슘 염료 로딩 완충액을 제조하기 위해, 먼저 10 마이크로리터의 DMSO와 0.2 그램의 플루로닉 F-12 분말로 50 마이크로그램의 염료를 DMSO의 1 밀리리터에 용해시킨다. 10 마이크로리터의 플루로닉 용액과 10 마이크로리터의 칼슘 염료 용액을 섞는다. 이 혼합물을 200 마이크로 몰의 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS 용액 2 밀리리터에 첨가한다.이어서, 15개의 정밀 절단된 폐 조각을 2밀리리터의 칼슘 로딩 완충액에 넣고, 섭씨 30도에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 100마이크로몰 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 칼슘 염료가 적재 된 조각을 큰 커버 유리에 놓습니다. 18G 무딘 바늘 또는 200 마이크로리터 피펫 팁에 부착된 3밀리리터 주사기에 고진공 실리콘 그리스를 채우고 슬라이스 위와 아래에 커버 글라스를 가로질러 두 개의 평행선을 그립니다.두 그리스 라인 사이에 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 덮습니다. 두 번째 커버 글라스를 메쉬 위에 올려 놓고 챔버를 생성합니다. HBSS 또는 작용제 용액을 피펫으로 한쪽 끝에서 챔버에 첨가하십시오.티슈 페이퍼로 다른 쪽 끝에서 흡입하여 챔버에서 유체를 제거하십시오. 슬라이스의 챔버는 이제 고속 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 칼슘 이미징을 할 준비가되었습니다. 폐기도 동맥 다발은 위상차 현미경 하에서 두께 150 마이크로미터의 정밀 절단된 폐 조각에서 관찰되었다.휴지 상태에서, 기도는 근처의 폐동맥을 가진 입방체 상피 세포에 의해 확인되었다. 메타콜린에 노출된 후, 발광 영역은 감소하였고, 폐동맥은 자극에 대한 반응을 보이지 않았다. 기도 수축성 반응은 발광 면적 감소의 백분율에 의해 정량화되었고, 하루 및 오일 배양에서 유사한 용량 의존적 반응을 보였다.말초 폐장에 도달하면, 전도성 기도는 호흡 덕트와 작은 acinar 세동맥을 둘러싸는 주머니로 분기합니다. 내피에 노출되면 기도와 폐동맥 모두 수축되고, 이어서 NOC-5가 이완을 유도한다. 휴지 상태에서, 칼슘 염료가 로딩된 슬라이스는 공초점 형광 현미경 하에서 기도 및 혈관 시스템의 평활근 세포에서 낮은 형광을 보였다.작용제에 노출되면, 칼슘 형광 강도는 세포에서 상승하고 발진 신호와 상관 관계가있는 전체 세포로 전파되었습니다. 현명한 기술은, 아가로오스로 폐를 균질하게 팽창시키고 빠르거나 과도한 아가로스 주사를 피하는 것이 필수적입니다. 항상 끝에 공기를 밀어 전도성 기도에서 원위 폐포 공간으로 아가로스를 플러시합니다.요약하면, 정밀-절단된 폐 슬라이스 배양물을 사용하여, 특수한 다양한 폐 평활근 기능을 제공하고 시험관내에서 평활근 조절 완화를 모델링할 수 있다. 또한 novo 혈관 확장 또는 기관지 확장제 약물을 스크리닝하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Computer-Generated Animal Model Stimuli

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative 에어웨이 질환의 발전을 연구하는 모델로 사용 마우스의 Heterotopic 및 Orthotopic Tracheal 이식

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...