Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av NIH tilskudd, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Villtype C57/B6 hannmus, 8 ukers alder, ble brukt i denne studien.
1. Eksperimentell forberedelse
<ol><li>Forbered arbeidsløsningen.<ol>
<li>Forbered 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS, med Ca2+ og Mg2+, og pH balansert med 20 mM HEPES, se materialtabell). Bruk HBSS-løsningen til å klargjøre og behan...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

Utarbeidelsen av PCLS innebærer flere kritiske trinn. For det første er det viktig å blåse opp lungelappen homogent for å unngå variasjon av vevsstivhet fra ujevn agarosefordeling. Siden væsken agarose raskt gelerer i tynne katetre eller luftveier ved en temperatur under 37 °C, kan den resulterende fyllingsdefekten i det distale lungefeltet øke forskjellen i stivhet i lungevevet og forårsake vevsrivning under vibratomsnittet. Derfor kan det praktiseres å holde den lavsmeltende agaroseoppløsningen ved 42 °C i...

Glatt muskelcelle (SMC) er en viktig strukturell celletype i lungen, primært bosatt i medieveggen i luftveiene og lungekarene. SMC-er trekker seg sammen for å endre luminalkaliberet, og dermed regulere luft og blodstrøm 1,2. Derfor er kontraktil regulering av SMC avgjørende for å opprettholde homeostase av luftventilasjon og lungesirkulasjon. I motsetning til dette fremkaller avvikende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvei eller lunge vaskulære sykdommer som astma og pulmonal arteriell hypertensjon. Den funksjonelle vurderingen av lunge-SMCer har imidlertid blitt utfordret av begrenset tilgang til lungevevvet, spesielt de små luftveiene og mikroveslene i den distale delen av lungen 2,3. Nåværende løsninger benytter seg av indirekte analyser, for eksempel måling av luftstrømmotstand av Flexivent for å reflektere luftveisinnsnevring, og kontroll av pulmonalt arterielt blodtrykk ved høyre hjertekateterisering for å vurdere pulmonal vasokokontraksjon 4,5. Imidlertid har disse indirekte analysene flere ulemper, for eksempel å bli forvirret av strukturelle faktorer, ikke fange det romlige mangfoldet av luftveier eller vaskulære responser i helelungeskalaen 6,7, og uegnet for den mekanistiske studien av kontraktil regulering på mobilnivå. Derfor har alternative tilnærminger ved bruk av isolerte primære celler, luftrør / bronkie muskelstrimler 8,9 eller store vaskulære segmenter10 blitt brukt for SMC-studien in vitro. Likevel har disse metodene også begrensninger. For eksempel gjør en rask fenotypisk tilpasning av primære SMCer i kulturtilstanden 11,12 det problematisk å ekstrapolere funn fra cellekultur til in vivo-innstillinger. I tillegg kan den kontraktile fenotypen av SMC i de isolerte proksimale luftveis- eller vaskulære segmentene ikke representere SMC-ene i den distale lungen 6,7. Videre forblir muskelkraftmålingen på vevsnivå dissosiert fra molekylære og cellulære hendelser som er avgjørende for mekanistisk innsikt i kontraktil regulering.
Presisjonskuttet lungeskive (PCLS), en seksjon for levende lungevev, gir et ideelt ex vivo-verktøy for å karakterisere lunge-SMCer i et nær in vivo mikromiljø (dvs. bevart multicellulær arkitektur og interaksjon)13. Siden Dr. Placke og Fisher først introduserte tilberedningen av lungeskiver fra agaroseoppblåste rotte- og hamsterlunger på 1980-tallet14,15, har denne teknikken blitt avansert kontinuerlig for å gi PCLSer høyere kvalitet og større allsidighet for biomedisinsk forskning. En signifikant forbedring er forbedring av pulmonal arteriell bevaring ved gelatininfusjon i tillegg til lungeinflasjon med agarose via luftrøret. Som et resultat holdes både luftveier og lungearterier intakte i PCLS for ex vivo-vurdering 16. Videre er PCLS levedyktig i lengre tid i kulturen. For eksempel hadde mus PCLSer ingen signifikant endring i cellens levedyktighet og metabolisme i minst 12 dager i kultur, så vel som de beholdt luftveiskontraktiliteten i opptil 7 dager17. I tillegg holder PCLS forskjellige størrelser luftveier eller fartøy for sammentrekning og avslapningsanalyser. Videre kan intracellulær Ca2+ signalering av SMC, den determinantfaktoren for cellekontraktilitet, analyseres med Ca2+ reporterfarger avbildet av et konfokalt eller 2-foton mikroskop13.
Med tanke på den omfattende anvendelsen av musemodellen i lungeforskning, er en detaljert protokoll beskrevet her for å forberede mus PCLS med intakte luftveier og intrapulmonale arterier for ex vivo lungeforskning. Ved hjelp av de forberedte PCLSene demonstrerte vi deretter hvordan man evaluerer luftveis- og lungearterieresponsene på konstriktive eller relakserende stimuli. I tillegg beskrives også metoden for å laste PCLS med Ca2+ reporterfargestoff og deretter avbilde Ca2+- signalering av SMC-er assosiert med kontraktile eller relakserende responser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrekningen av luftveien og den intrapulmonale arterien for å modifisere henholdsvis luftstrømmotstand og lungesirkulasjon, og spiller dermed en kritisk rolle i homeostase av lungesystemet. Deregulering av SMC-kontraktilitet bidrar til flere lungesykdommer, inkludert astma og pulmonal hypertensjon. På grunn av begrenset vevstilgang og mangel på dyrkningssystemer for å opprettholde in vivo SMC-fenotyper, forblir imidlertid molekylære mekanismer som ligger til grunn for den deregulerte SMC-kontraktiliteten i disse sykdommene fullstendig identifisert. Den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) tilbyr en ex vivo-modell som omgår disse tekniske vanskelighetene. Som en levende, tynn lungevevsseksjon beholder PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillater in situ-sporing av SMC-sammentrekning og intracellulær Ca2+- signalering som regulerer SMC-kontraktilitet. Her er en detaljert mus PCLS forberedelsesprotokoll gitt, som bevarer intakte luftveier og intrapulmonale arterier. Denne protokollen innebærer to viktige trinn før du utsetter lungelappen for kutting: oppblåsing av luftveiene med lavsmeltepunktsagarose gjennom luftrøret og innfylling av lungekar med gelatin gjennom høyre ventrikel. PCLS fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan brukes til bioassays for å evaluere Ca2 + -mediert kontraktil regulering av SMC i både luftveier og intrapulmonale arterielle rom. Når den brukes på musemodeller av respiratoriske sykdommer, muliggjør denne protokollen funksjonell undersøkelse av SMC, og gir dermed innsikt i den underliggende mekanismen for SMC-kontraktilitetsderegulering i sykdommer.

Pcls-preparat fra mus som bevarer intakte intrapulmonale luftveier og arterier En 150 μm tykk PCLS ble observert under det inverterte fasekontrastmikroskopet. I muselunger er ledende luftveier ledsaget av intrapulmonale arterier, som går fra hilus til perifer lunge. En representativ pulmonal luftveisarteriebunt i muse-PCLS er vist i figur 2B. Luftveien kan lett identifiseres av kuboidale epitelceller med aktiv cilial juling som fôrer den indre overflaten av lumen. I mo...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Den nåværende protokollen beskriver å forberede og bruke musepresisjonskuttede lungeskiver for å vurdere luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskelkontraktilitet i et nesten in vivo miljø.

Bruk av presisjonskuttet lungeskive for å studere kontraktil regulering av luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskulatur

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS støtter vurderingen av luftveier og vaskulær glatt muskelcelleaktivitet i et nesten intakt vevsmiljø, og gir dermed en uvurderlig ex vivo-modell for lungeforskning. Når det gjelder glatt muskelforskning, bevarer de presisjonskuttede lungeskivene in vivo fenotypen av glatte muskelceller og deres interaksjon med omkringliggende strukturer, samtidig som de gir tilgang til glatte muskelceller, noe som er viktig for en mekanistisk studie på mobilnivå. For å begynne, plasser musekroppen på et disseksjonsbrett i den bakre posisjonen.Stikk ned halen, forpotene og hodet med 25G sprøytenåler og desinfiser kroppen med 70% etanol. Åpne brysthulen forsiktig langs brystbenet og bilateralt nedre ribbe bur over membranen. Pek deretter den skarpe saksespissen bort fra lungevevvet og fjern en del av de bilaterale ventrale ribbe burene for å eksponere hjertet.Vær oppmerksom på at lungelappene kollapser når brysthulen åpnes. Bruk saks for å fjerne bløtvev i musehalsen for å eksponere luftrøret. I den øvre enden av luftrøret lage et lite hull med diameter 1,2 millimeter som skal tillate passering av en 20G Y-formet IV kateterspiss.Koble en adapterport på det Y-formede kateteret med en 3 milliliter sprøyte ferdigfylt med 0,5 milliliter luft og den andre porten med en 3 milliliter sprøyte ferdigfylt med 2 milliliter 1,5% agaroseoppløsning oppvarmet til 42 grader Celsius. Injiser agaroseoppløsning for å fylle kateteret og skyv deretter kateteret gjennom åpningen inn i luftrøret til 5 til 8 millimeter. Injiser langsomt agaroseoppløsningen med en hastighet på 1 milliliter per 5 sekunder.Vær oppmerksom på at lungen ekspanderer langs den proksimale til distale aksen. Stopp injeksjonen når kanten av hver lungelapp er oppblåst. Injiser deretter 0,2 til 0,3 ml luft fra den andre sprøyten for å presse den gjenværende agarose inn i ledende luftveier til det distale alveolrommet.Klipp lukket luftrøret med et par buede hemostatiske tang. For å fylle lungevaskulaturen, fyll en 1 milliliter sprøyte med varm 6% gelatin og koble den til et nålhåret venekateter. Fyll kateteret med gelatinoppløsning og punkter deretter høyre ventrikel nær den nedre veggen med nålen.Skyv nålen i 2 til 3 millimeter inn i høyre ventrikel og pek nålespissen mot hovedpulsåren. Injiser ca. 0,2 ml gelatinoppløsning sakte inn i høyre ventrikel og pulmonale arterielle kar. Hold nålen på plass i fem minutter etter injeksjon og avkjøl lungelappene ved å helle iskald HBSS-løsning på hjertet og lungen og legg kroppen i kjøleskap.Etter dette trinnet, fjern muselungen og hjertet fra omkringliggende bindevev med saks. Deretter skiller du hver lungelapp og holder dem i HBSS-løsning på is. Trim lungelappen og orienter den slik at skjæreretningen er vinkelrett på de fleste luftveier fra hila til lungeoverflaten.Fest den på toppen av prøvekolonnen med superlim. Bruk en vibratom med et friskt tynt barberblad for å kutte lungelappen i 150 mikrometer skiver. Samle skivene i sterile petriskåler ferdigfylt med kald HBSS-løsning.Overfør skivene til petriskåler fylt med DMEM/F-12 kulturmedium. Plasser oppvasken i en 37 grader Celsius inkubator over natten før forsøkene. Legg en enkelt presisjonskuttet lungeskive i hver brønn på en 24 brønns kulturplate fylt med HBSS.Finn skiven midt i brønnen, og fjern deretter HBSS-oppløsningen med en pipette. Under et mikroskop, finn målluftveien og fartøyet i skiven og dekk det deretter ved hjelp av et nylonnett med et forhåndskuttet sentralt hull for å eksponere det målrettede luftveisbeholderområdet. Legg en hul metallskive på toppen av nettet for å holde skivene på plass.Deretter legger du til 600 mikroliter HBSS-løsning for å senke skivene. Etter 10 minutter tar du opp bildene av grunnlinjen. For å indusere luftveien eller vaskulær sammentrekning, fjern FORSIKTIG HBSS-løsningen med en pipette og tilsett 600 mikroliter HBSS med en agonist.For å forberede kalsiumfargestoffbelastningsbufferen, oppløs først 50 mikrogram fargestoff med 10 mikroliter DMSO og 0,2 gram Pluronic F-12 pulver i 1 milliliter DMSO. Bland 10 mikroliter av Pluronic-løsningen med 10 mikroliter kalsiumfargestoffoppløsning. Tilsett denne blandingen til 2 ml HBSS-oppløsning inneholdende 200 mikromolar sulfobromophthalein.Plasser deretter 15 presisjonskuttede lungeskiver i 2 milliliter kalsiumbelastningsbuffer og inkuber ved 30 grader Celsius i en time, etterfulgt av inkubering i HBSS som inneholder 100 mikromolar sulfobromophthalein i 30 minutter. Legg deretter kalsiumfargestoffbelastede skiver på et stort dekselglass. Fyll høyvakuum silikonfett i en 3 milliliter sprøyte festet til 18G stump nål eller en 200 mikroliter pipettespiss og trekk to parallelle linjer over dekselglasset, over og under skiven.Dekk skiven med et nylonnett mellom to fettlinjer. Plasser det andre dekselglasset på toppen av nettet for å generere et kammer. Tilsett HBSS eller en agonistløsning i kammeret fra den ene enden med en pipette.Fjern væsken fra kammeret ved å suge fra den andre enden med silkepapir. Skivens kammer er nå klart for kalsiumavbildning med et høyhastighets laserskanningskonfokalmikroskop. Pulmonale luftveisarteriebunter ble observert i presisjonskuttede lungeskiver med tykkelse 150 mikrometer under et fasekontrastmikroskop.Ved hviletilstand ble en luftvei identifisert av kuboidale epitelceller med en nærliggende lungearterie. Etter eksponering for metakolin ble lysområdet redusert, mens lungearterien ikke viste noen respons på stimuli. Luftveiskontraktile responser ble kvantifisert ved prosentandelen av reduksjon i luminalareal og viste lignende doseavhengige responser i en dag og fem dagers kulturer.Når de når det perifere lungefeltet, forgrener de ledende luftveiene seg til luftveier og sekker som omgir de små intra-acinære arteriolene. Når de utsettes for endotel, trekker både luftveiene og lungearteriene seg sammen, som etterfølges av NOC-5-indusert avslapning. Ved hviletilstand viste kalsiumfargestoffbelastede skiver lav fluorescens i glatte muskelceller i luftveiene og karsystemet under et konfokalt fluorescerende mikroskop.Ved eksponering for agonister økte kalsiumfluorescensintensiteten i cellene og forplantet seg til hele cellen, som korrelerte med oscillerende signaler. Teknikkmessig er det viktig å blåse opp lungen med agarose homogent og unngå rask eller overdreven agaroseinjeksjon. Skyv alltid luft på enden for å skylle agarose fra ledende luftveier til distale alveoler.Oppsummert, ved hjelp av den presisjonskuttede lungeskivekulturen, kan man gi et spesielt utvalg av lungeglatte muskelfunksjoner og modellere dereguleringen av glatt muskulatur in vitro. Det gir også en ideell plattform for å skjerme novo vasodilatoriske eller bronkodilaterende medisiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Påvisning av nitrogenoksid og Superoxide Radical anion med Electron paramagnetisk resonans spektroskopi fra celler ved hjelp av Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploring Arteriell glatt muskulatur KV7 Kalium Channel funksjon ved hjelp Patch Clamp Elektrofysiologi og trykk Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling av Smooth muskelfunksjon i de Isolert Tissue Bath-applikasjoner til Farmakologi Forskning

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...