Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Este trabalho é apoiado por subvenções do NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts. Foram utilizados camundongos machos do tipo selvagem C57/B6, com 8 semanas de idade, para o presente estudo.
1. Preparação experimental
<ol><li>Prepare a solução de trabalho.<ol>
<li>Prepare a solução de sal balanceado 1x Hank 's Balanced (HBSS, com Ca2+ e Mg2+, e pH balanceado com HEPES de 20 ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. 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J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

A preparação do PCLS envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, é essencial inflar o lobo pulmonar de forma homogênea para evitar a variação da rigidez tecidual da distribuição desigual da ágarose. Como o líquido agarose rapidamente géis em cateteres finos ou vias aéreas a uma temperatura abaixo de 37 °C, o defeito de enchimento resultante no campo pulmonar distal poderia aumentar a disparidade de rigidez do tecido pulmonar e causar ruptura de tecido durante a seção vibratome. Portanto, manter a ...

A célula muscular lisa (SMC) é um tipo de célula estrutural importante no pulmão, residindo principalmente na parede de mídia das vias aéreas e vasos pulmonares. As SMCs contraem para alterar o calibre luminal, regulando assim o fluxo de ar e sangue 1,2. Portanto, a regulação conjuntura de SMCs é essencial para manter a homeostase da ventilação de ar e circulação pulmonar. Em contraste, a contratilidade aberrante do SMC provoca vias aéreas obstrutivas ou doenças vasculares pulmonares como asma e hipertensão arterial pulmonar. No entanto, a avaliação funcional das SMCs pulmonares tem sido desafiada pelo acesso limitado ao tecido pulmonar, especialmente aquelas pequenas vias aéreas e microvexes na parte distal do pulmão 2,3. As soluções atuais recorrem a ensaios indiretos, como medir a resistência ao fluxo de ar pela Flexivent para refletir a constrição das vias aéreas e verificar a pressão arterial pulmonar pelo cateterismo cardíaco direito para avaliar a vasocontração pulmonar 4,5. No entanto, esses ensaios indiretos têm múltiplas desvantagens, como ser confundido por fatores estruturais, não captar a diversidade espacial das vias aéreas ou respostas vasculares em toda a escala pulmonar 6,7, e a inaptidão para o estudo mecanicista da regulação contratil no nível celular. Portanto, abordagens alternativas utilizando células primárias isoladas, tiras musculares de traqueia/brônquico 8,9, ou grandes segmentos vasculares10 foram aplicadas para o estudo SMC in vitro. No entanto, esses métodos também têm limitações. Por exemplo, uma rápida adaptação fenotípica dos SMCs primários na condiçãode cultura 11,12 torna problemático extrapolar achados da cultura celular para configurações in vivo. Além disso, o fenótipo contracttil de SMCs nas vias aéreas proximais isoladas ou segmentos vasculares pode não representar as SMCs no pulmão distal 6,7. Além disso, a medição da força muscular no nível do tecido permanece dissociada de eventos moleculares e celulares que são essenciais para uma visão mecanicista sobre a regulação contratil.
A fatia pulmonar cortada com precisão (PCLS), uma seção de tecido pulmonar vivo, fornece uma ferramenta ex vivo ideal para caracterizar SMCs pulmonares em um microambiente quase in vivo (ou seja, arquitetura multicelular preservada e interação)13. Desde que os Drs. Placke e Fisher introduziram pela primeira vez a preparação de fatias pulmonares de pulmões de ratos e hamsters inflados pela agarose nosanos 14,15, essa técnica tem avançado continuamente para fornecer aos PCLSs maior qualidade e maior versatilidade para pesquisas biomédicas. Uma melhora significativa é o aprimoramento da preservação arterial pulmonar por infusão de gelatina, além da inflação pulmonar com agarose através da traqueia. Como resultado, tanto as vias aéreas quanto as artérias pulmonares são mantidas intactas no PCLS para avaliação ex vivo 16. Além disso, o PCLS é viável por um tempo prolongado na cultura. Por exemplo, os PCLSs do mouse não tiveram nenhuma mudança significativa na viabilidade celular e metabolismo por um mínimo de 12 dias na cultura, bem como, eles mantiveram a contração das vias aéreas por até 7 dias17. Além disso, o PCLS mantém vias aéreas ou embarcações de tamanho diferente para ensaios de contração e relaxamento. Além disso, a sinalização intracelular Ca2+ de SMCs, fator determinante da contratilação celular, pode ser avaliada com corantes de repórter Ca2+ retratados por um microscópio confocal ou de 2 fótons13.
Considerando a ampla aplicação do modelo de camundongos em pesquisa pulmonar, um protocolo detalhado é descrito aqui para a preparação do PCLS do rato com vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares para pesquisa pulmonar ex vivo . Utilizando os PCLSs preparados, demonstramos posteriormente como avaliar as vias aéreas e as respostas arteriais pulmonares a estímulos constritivos ou relaxantes. Além disso, também são descritos o método de carregamento do PCLS com corante de repórter Ca2+ e, em seguida, a sinalização ca2+ de SMCs associadas a respostas contratuais ou relaxantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

As células musculares lisas (SMC) mediam a contração das vias aéreas e da artéria intrapulmonar para modificar a resistência ao fluxo de ar e a circulação pulmonar, respectivamente, desempenhando um papel crítico na homeostase do sistema pulmonar. A desregulamentação da contralução da SMC contribui para várias doenças pulmonares, incluindo asma e hipertensão pulmonar. No entanto, devido ao acesso limitado aos tecidos e à falta de sistemas culturais para manter os fenótipos in vivo SMC, os mecanismos moleculares subjacentes à contratlidade SMC desregulamentada nessas doenças permanecem totalmente identificados. A fatia pulmonar de corte de precisão (PCLS) oferece um modelo ex vivo que contorna essas dificuldades técnicas. Como uma seção de tecido pulmonar vivo e fino, o PCLS retém O SMC em ambientes naturais e permite o rastreamento in situ da contração do SMC e sinalização intracelular ca2+ que regula a contração do SMC. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação pcls detalhado do mouse, que preserva vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares. Este protocolo envolve dois passos essenciais antes de submeter o lobo pulmonar ao corte: inflar as vias aéreas com ponto de fusão baixo agarose através da traqueia e enchimento de vasos pulmonares com gelatina através do ventrículo direito. O PCLS preparado usando este protocolo pode ser usado para bioensaio para avaliar a regulação contraítária de CA2+mediada da SMC tanto nas vias aéreas quanto nos compartimentos arteriais intrapulmonares. Quando aplicado a modelos de camundongos de doenças respiratórias, este protocolo permite a investigação funcional do SMC, fornecendo assim uma visão do mecanismo subjacente da desregulamentação da contração da SMC em doenças.

Preparação do MOUSE PCLS preservando vias aéreas e artérias intrapulmonares intactas Um PCLS de 150 μm de espessura foi observado sob o microscópio de contraste de fase invertido. Nos pulmões do rato, as vias aéreas condutoras são acompanhadas por artérias intrapulmonares, indo do hilus ao pulmão periférico. Um pacote representativo de artérias aéreas pulmonares em um PCLS de rato é mostrado na Figura 2B. As vias aéreas podem ser facilmente identificadas p...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

O PCLS apoia a avaliação da atividade celular lisa das vias aéreas e vasculares em um ambiente tecidual quase intacto, fornecendo assim um modelo ex vivo inestimável para pesquisa pulmonar. Em termos de pesquisa muscular suave, as fatias pulmonares cortadas com precisão preservam o fenótipo in vivo de células musculares lisas e sua interação com estruturas circundantes, permitindo o acesso a células musculares lisas, o que é importante para um estudo mecanicista no nível celular. Para começar, coloque o corpo do rato em uma placa de dissecção na posição supina.Fixar a cauda, as patas dianteiras e a cabeça com agulhas de seringa 25G e higienizar o corpo com 70% de etanol. Abra cuidadosamente a cavidade torácica ao longo do esterno e da caixa torácica inferior bilateral acima do diafragma. Em seguida, aponte a ponta afiada da tesoura para longe do tecido pulmonar e remova parte das caixas torácicas ventrais bilaterais para expor o coração.Observe que os lobos pulmonares entram em colapso quando a cavidade torácica se abre. Use uma tesoura para remover tecido mole no pescoço do rato para expor a traqueia. Na extremidade superior da traqueia faça um pequeno orifício de diâmetro de 1,2 milímetros que deve permitir a passagem de uma ponta de cateter IV em forma de Y de 20G.Conecte uma porta adaptadora do cateter em forma de Y com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 0,5 mililitros de ar e a outra porta com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 2 mililitros de solução de 1,5% agarose aquecida a 42 graus Celsius. Injete a solução agarose para encher o cateter e, em seguida, empurre o cateter através da abertura para a traqueia para 5 a 8 milímetros. Injete lentamente a solução agarose a uma taxa de 1 mililitro por 5 segundos.Observe que o pulmão se expande ao longo do eixo proximal para distal. Pare a injeção quando a borda de cada lobo pulmonar estiver inflada. Em seguida, injete 0,2 a 0,3 mililitros de ar da outra seringa para empurrar a agarose residual em vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.O clipe fechou a traqueia com um par de fórceps hemostáticos curvos. Para enchir a vasculatura pulmonar, encha uma seringa de 1 mililitro com gelatina quente de 6% e conecte-a a um cateter de veia do couro cabeludo. Enchimento do cateter com solução de gelatina e, em seguida, puna o ventrículo direito perto da parede inferior com a agulha.Empurre a agulha por 2 a 3 milímetros no ventrículo direito e aponte a ponta da agulha para a artéria pulmonar principal. Injete aproximadamente 0,2 mililitros de solução de gelatina lentamente no ventrículo direito e vasos arteriais pulmonares. Mantenha a agulha no lugar por cinco minutos após a injeção e esfrie os lóbulos pulmonares derramando solução hbss gelada no coração e pulmão e coloque o corpo em uma geladeira.Após esta etapa, remova o pulmão e o coração do camundongo dos tecidos conjuntivos circundantes com uma tesoura. Em seguida, separe cada lobo pulmonar e mantenha-os na solução HBSS no gelo. Apare o lobo pulmonar e oriente-o de modo que a direção de corte seja perpendicular à maioria das vias aéreas da hila até a superfície pulmonar.Coloque-o em cima da coluna do espécime com super cola. Use um vibratome com uma lâmina de barbear fina fresca para cortar o lobo pulmonar em fatias de 150 micrômetros. Colete as fatias em pratos Petri estéreis pré-preenchidos com solução HBSS fria.Transfira as fatias para pratos Petri recheados com meio de cultura DMEM/F-12. Coloque os pratos em uma incubadora Celsius de 37 graus durante a noite antes dos experimentos. Coloque uma única fatia pulmonar cortada com precisão em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços cheia de HBSS.Localize a fatia no meio do poço e, em seguida, remova a solução HBSS com uma pipeta. Sob um microscópio, encontre as vias aéreas e o vaso alvo na fatia e cubra-a usando uma malha de nylon com um buraco central pré-cortado para expor a área do vaso das vias aéreas alvo. Coloque uma arruela de metal oca em cima da malha para segurar as fatias no lugar.Em seguida, adicione 600 microliters de solução HBSS para submergir as fatias. Após 10 minutos, grave as imagens da linha de base. Para induzir as vias aéreas ou contração vascular, remova cautelosamente a solução HBSS com uma pipeta e adicione 600 microliters de HBSS com um agonista.Para preparar o tampão de carregamento de corante de cálcio, primeiro dissolva 50 microgramas de corante com 10 microliters de DMSO e 0,2 gramas de pó Plurônico F-12 em 1 mililitro de DMSO. Misture 10 microlitadores da solução Plurônica com 10 microliters de solução de corante de cálcio. Adicione esta mistura a 2 mililitros de solução HBSS contendo 200 micromolar de sulfobromophthalein.Em seguida, coloque 15 fatias pulmonares cortadas com precisão em 2 mililitros de tampão de carregamento de cálcio e incubar a 30 graus Celsius por uma hora, seguido de incubação em HBSS contendo 100 micromolar sulfobromophthalein por 30 minutos. Em seguida, coloque fatias carregadas de corante de cálcio em um copo de tampa grande. Encha a graxa de silicone de alto vácuo em uma seringa de 3 mililitros presa à agulha cega 18G ou uma ponta de pipeta de 200 microliter e desenhe duas linhas paralelas através do vidro de cobertura, acima e abaixo da fatia.Cubra a fatia usando uma malha de nylon entre duas linhas de graxa. Coloque o segundo vidro de cobertura em cima da malha para gerar uma câmara. Adicione HBSS ou uma solução agonista na câmara de uma extremidade com uma pipeta.Remova o fluido da câmara aspirando da outra extremidade com papel de tecido. A câmara da fatia está pronta para a imagem de cálcio com um microscópio confocal de varredura a laser de alta velocidade. Os feixes de artérias das vias aéreas pulmonares foram observados em fatias pulmonares cortadas com precisão de espessura de 150 micrômetros sob um microscópio de contraste de fase.Em estado de repouso, uma via aérea foi identificada por células epiteliais cuboidal com artéria pulmonar próxima. Após a exposição à methacholina, a área luminal foi reduzida, enquanto a artéria pulmonar não apresentou resposta aos estímulos. As respostas contraídas das vias aéreas foram quantificadas pelo percentual de redução da área luminal e apresentaram respostas dependentes de dose semelhante em culturas de um dia e cinco dias.Ao atingir o campo pulmonar periférico, as vias aéreas condutoras se ramificam em dutos respiratórios e sacos ao redor das pequenas artérias intra-acinar. Quando expostos a endothelii, tanto as vias aéreas quanto artérias pulmonares constrito, que é seguido pelo relaxamento induzido pelo NOC-5. No estado de repouso, as fatias carregadas de corante de cálcio apresentaram baixa fluorescência nas células musculares lisas das vias aéreas e do sistema vascular sob um microscópio fluorescente confocal.Após a exposição aos agonistas, a intensidade da fluorescência de cálcio elevou-se nas células e se propagou para toda a célula, que se correlacionava com os sinais oscilatórios. Técnica sábia, é essencial inflar o pulmão com agarose de forma homogênea e evitar injeção rápida ou excessiva de agarose. Empurre sempre o ar no final para lavar a agarose das vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.Em resumo, usando a cultura de fatias pulmonares cortadas com precisão, pode-se fornecer uma variedade especial de funções musculares lisas pulmonares e modelar a desregulamentação muscular lisa in vitro. Também fornece uma plataforma ideal para triagem de novos medicamentos vasodilatários ou broncodilatadores.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotópico e Transplante ortotópico traqueal em ratos usados ​​como modelos para estudar o desenvolvimento de doenças das vias aéreas obliterante

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolamento da Human Umbilical células musculares arteriais (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...