Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Эта работа поддерживается грантами NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Весь уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Массачусетской больницы общего профиля. Для настоящего исследования использовались самцы мышей дикого типа C57/B6 в возрасте 8 недель.
<p ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

Подготовка PCLS включает в себя несколько критических этапов. Во-первых, важно равномерно надувать долю легкого, чтобы избежать изменения жесткости тканей от неравномерного распределения агарозы. Поскольку жидкая агароза быстро гелится в тонких катетерах или дыхательных путях при темп...

Гладкомышечные клетки (SMC) являются основным типом структурных клеток в легких, в основном находящихся в медиа-стенке дыхательных путей и легочных сосудов. SMC сокращаются, чтобы изменить просветный калибр, тем самым регулируя воздух и кровоток 1,2. Поэтому сократительная регуляция SMC имеет важное значение для поддержания гомеостаза вентиляции воздуха и легочного кровообращения. Напротив, аберрантная сократимость SMC провоцирует обструктивные заболевания дыхательных путей или легочных сосудов, такие как астма и легочная артериальная гипертензия. Однако функциональная оценка легких SMC была затруднена ограниченным доступом к легочной ткани, особенно к тем небольшим дыхательным путям и микрососудам в дистальной части легкого 2,3. Современные решения прибегают к косвенным анализам, таким как измерение сопротивления воздушного потока Flexivent для отражения сужения дыхательных путей и проверка легочного артериального артериального давления путем катетеризации правого сердца для оценки легочной вазоконтракции 4,5. Тем не менее, эти косвенные анализы имеют множество недостатков, таких как смешение структурных факторов, неспособность охватить пространственное разнообразие дыхательных путей или сосудистых реакций во всей шкале легких 6,7 и непригодность для механистического изучения сократительной регуляции на клеточном уровне. Поэтому для исследования SMC in vitro были применены альтернативные подходы с использованием изолированных первичных клеток, полосок мышц трахеи/бронхов 8,9 или крупных сосудистых сегментов10. Тем не менее, эти методы также имеют ограничения. Например, быстрая фенотипическая адаптация первичных SMC в условиях культуры 11,12 делает проблематичным экстраполяцию результатов из клеточной культуры в условия in vivo. Кроме того, сократительный фенотип SMC в изолированных проксимальных дыхательных путях или сосудистых сегментах может не представлять собой SMC в дистальном легком 6,7. Более того, измерение мышечной силы на тканевом уровне остается диссоциированным от молекулярных и клеточных событий, которые необходимы для механистического понимания сократительной регуляции.
Прецизионно разрезанный срез легкого (PCLS), живой участок легочной ткани, обеспечивает идеальный инструмент ex vivo для характеристики легочных SMC в микросреде, близкой к in vivo (т.е. сохраненной многоклеточной архитектуре и взаимодействии)13. С тех пор, как доктора Плаке и Фишер впервые представили приготовление легких срезов из надутых агарозой легких крыс и хомяков в 1980-х годах 14,15, этот метод постоянно развивался, чтобы обеспечить PSS более высоким качеством и большей универсальностью для биомедицинских исследований. Одним из значительных улучшений является усиление сохранения легочных артерий путем инфузии желатина в дополнение к надуванию легких агарозой через трахею. В результате как дыхательные пути, так и легочные артерии остаются нетронутыми в PCLS для оценки ex vivo 16. Кроме того, PCLS жизнеспособна в течение длительного времени в культуре. Например, у мышиных PSS не было значительных изменений жизнеспособности клеток и метаболизма в течение как минимум 12 дней в культуре, а также они сохраняли сократимость дыхательных путей до 7 дней17. Кроме того, PCLS сохраняет дыхательные пути или сосуды разного размера для анализа сокращения и релаксации. Кроме того, внутриклеточные сигналы Ca2+ SMC, детерминантный фактор сократимости клеток, могут быть проанализированы с помощью репортерных красителей Ca2+, визуализированных конфокальным или 2-фотонным микроскопом13.
Учитывая широкое применение мышиной модели в исследованиях легких, здесь описан подробный протокол подготовки ПКЛС мыши с интактными дыхательными путями и внутрилегочными артериями для исследования легких ex vivo . Используя подготовленные PSCL, мы впоследствии продемонстрировали, как оценивать реакции дыхательных путей и легочных артерий на констриктивные или релаксантные стимулы. Кроме того, описан способ загрузки PCLS репортерным красителем Ca2+ и последующей визуализации сигналов Ca2+ SMC, связанных со сократительными или релаксантными реакциями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Гладкомышечные клетки (SMC) опосредуют сокращение дыхательных путей и внутрилегочной артерии для изменения сопротивления воздушного потока и легочного кровообращения соответственно, играя, следовательно, играя решающую роль в гомеостазе легочной системы. Дерегуляции сократимости СМЦ способствует развитию ряда легочных заболеваний, включая астму и легочную гипертензию. Однако из-за ограниченного доступа к тканям и отсутствия систем культивирования для поддержания фенотипов SMC in vivo молекулярные механизмы, лежащие в основе дерегулированной сократимости SMC при этих заболеваниях, остаются полностью идентифицированными. Прецизионный срез легких (PCLS) предлагает модель ex vivo , которая обходит эти технические трудности. Как живой, тонкий участок легочной ткани, PCLS сохраняет SMC в естественной среде и позволяет in situ отслеживать сокращение SMC и внутриклеточную передачу сигналов Ca2 + , которая регулирует сократимость SMC. Здесь представлен подробный протокол подготовки PCLS для мыши, который сохраняет интактные дыхательные пути и внутрилегочные артерии. Этот протокол включает в себя два основных шага перед тем, как подвергнуть долю легкого нарезке: надувание дыхательных путей агарозой с низкой температурой плавления через трахею и заполнение легочных сосудов желатином через правый желудочек. PCLS, приготовленный с использованием этого протокола, может быть использован для биоанализов для оценки Ca2+ -опосредованной сократительной регуляции SMC как в дыхательных путях, так и во внутрилегочных артериальных компартментах. При применении к мышиным моделям респираторных заболеваний этот протокол позволяет проводить функциональное исследование SMC, тем самым давая представление о базовом механизме дерегуляции сократимости SMC при заболеваниях.

Мышиный препарат PCLS, сохраняющий интактные внутрилегочные дыхательные пути и артерии PCLS толщиной 150 мкм наблюдался под перевернутым фазоконтрастным микроскопом. В легких мышей проводящие дыхательные пути сопровождаются внутрилегочными артериями, идущими от хилуса к периф...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Настоящий протокол описывает подготовку и использование прецизионных срезов легких мышей для оценки сократимости дыхательных путей и внутрилегочных артерий гладкой мускулатуры в среде почти in vivo .

Использование прецизионно разрезанного среза легких для изучения сократительной регуляции дыхательных путей и внутрилегочных артериальных гладких мышц

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS поддерживает оценку активности гладкомышечных клеток дыхательных путей и сосудов в почти неповрежденной тканевой среде, тем самым обеспечивая бесценную модель ex vivo для легочных исследований. С точки зрения исследования гладкой мускулатуры, прецизионные срезы легких сохраняют фенотип гладкомышечных клеток in vivo и их взаимодействие с окружающими структурами, обеспечивая доступ к гладкомышечным клеткам, что важно для механистического исследования на клеточном уровне. Для начала поместите тело мыши на рассеченную доску в лежачем положении.Зажмите хвост, передние лапы и голову шприцевыми иглами 25G и продезинфицируйте тело 70% этанолом. Осторожно откройте грудную полость вдоль грудины и двусторонней нижней грудной клетки над диафрагмой. Затем направьте острый кончик ножниц в сторону от легочной ткани и удалите часть двусторонних вентральных грудных клеток, чтобы обнажить сердце.Обратите внимание, что доли легких разрушаются при открытии грудной полости. Используйте ножницы для удаления мягких тканей в шее мыши, чтобы обнажить трахею. На верхнем конце трахеи делают небольшое отверстие диаметром 1,2 миллиметра, которое должно позволить прохождение 20G Y-образного IV катетера наконечника.Соедините один порт адаптера Y-образного катетера с 3-миллилитровым шприцем, предварительно заполненным 0,5 миллилитрами воздуха, а другой порт 3-миллилитровым шприцем, предварительно заполненным 2 миллилитрами 1,5% раствора агарозы, нагретого до 42 градусов Цельсия. Введите раствор агарозы для заполнения катетера, а затем протолкните катетер через отверстие в трахею на 5-8 миллиметров. Медленно вводят раствор агарозы со скоростью 1 миллилитр в 5 секунд.Обратите внимание, что легкое расширяется вдоль проксимальной до дистальной оси. Прекратите инъекцию, когда край каждой доли легкого раздут. Затем введите от 0,2 до 0,3 миллилитра воздуха из другого шприца, чтобы протолкнуть остаточную агарозу в проводящие дыхательные пути в дистальное пространство альвеол.Клипс закрыл трахею парой изогнутых гемостатических щипцов. Чтобы заполнить легочную сосудистую систему, заполните шприц объемом 1 миллилитр теплым 6% желатином и подключите его к катетеру вен головы иглой. Наполните катетер раствором желатина, а затем проколите иглой правый желудочек близко к нижней стенке.Протолкните иглу на 2-3 миллиметра в правый желудочек и направьте кончик иглы на главную легочную артерию. Медленно вводят примерно 0,2 миллилитра раствора желатина в правый желудочек и легочные артериальные сосуды. Держите иглу на месте в течение пяти минут после инъекции и охладите доли легких, вылив ледяной холодный раствор HBSS на сердце и легкое и поместите тело в холодильник.После этого шага удалите ножницами легкое и сердце мыши из окружающих соединительных тканей. Затем отделите каждую долю легкого и держите их в растворе HBSS на льду. Обрежьте долю легкого и сориентируйте ее так, чтобы направление разреза было перпендикулярно большинству дыхательных путей от хилы до поверхности легкого.Прикрепите его поверх колонны образца суперклеем. Используйте вибратом со свежим тонким лезвием бритвы, чтобы разрезать долю легкого на 150-микрометровые срезы. Соберите ломтики в стерильные чашки Петри, предварительно заполненные холодным раствором HBSS.Переложите ломтики в чашки Петри, наполненные питательной средой DMEM/F-12. Поместите посуду в инкубатор с температурой 37 градусов цельсия на ночь перед экспериментами. Поместите один прецизионно разрезанный ломтик легкого в каждую лунку из 24-луночной культуральной пластины, заполненной HBSS.Найдите ломтик в середине лунки, а затем удалите раствор HBSS пипеткой. Под микроскопом найдите целевые дыхательные пути и сосуд в срезе, а затем накройте его с помощью нейлоновой сетки с предварительно вырезанным центральным отверстием, чтобы обнажить целевую область воздушного судна. Положите полую металлическую шайбу поверх сетки, чтобы удерживать ломтики на месте.Затем добавьте 600 микролитров раствора HBSS, чтобы погрузить ломтики. Через 10 минут запишите базовые изображения. Чтобы вызвать сокращение дыхательных путей или сосудов, осторожно удалите раствор HBSS пипеткой и добавьте 600 микролитров HBSS с агонистом.Чтобы подготовить буфер загрузки кальциевого красителя, сначала растворите 50 мкг красителя с 10 микролитрами DMSO и 0,2 граммами порошка Pluronic F-12 в 1 миллилитре DMSO. Смешайте 10 микролитров раствора Pluronic с 10 микролитрами раствора красителя кальция. Добавьте эту смесь к 2 миллилитрам раствора HBSS, содержащего 200 микромоляров сульфобромофталеина.Затем поместите 15 прецизионных срезов легких в 2 миллилитра буфера нагрузки кальция и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение одного часа, а затем инкубируйте в HBSS, содержащем 100 микромолярного сульфобромофталеина, в течение 30 минут. Затем поместите нагруженные кальциевым красителем ломтики на большой покровный стакан. Заполните высоковакуумную силиконовую смазку в шприц объемом 3 миллилитра, прикрепленный к тупой игле 18G или наконечнику пипетки объемом 200 микролитра, и проведите две параллельные линии по всему покровному стеклу, выше и ниже среза.Накройте срез нейлоновой сеткой между двумя линиями смазки. Поместите второе покровное стекло поверх сетки, чтобы создать камеру. Добавьте HBSS или раствор агониста в камеру с одного конца пипеткой.Удалите жидкость из камеры, всасывая с другого конца папиросную бумагу. Камера среза теперь готова к визуализации кальция с помощью высокоскоростного лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Пучки артерий легочных дыхательных путей наблюдались в прецизионно разрезанных срезах легких толщиной 150 микрометров под фазоконтрастным микроскопом.В состоянии покоя дыхательные пути были идентифицированы кубоидальными эпителиальными клетками с близлежащей легочной артерией. После воздействия метахолина просветная область была уменьшена, в то время как легочная артерия не показала никакой реакции на раздражители. Сократительные реакции дыхательных путей были количественно определены процентом уменьшения площади просвета и показали аналогичные дозозависимые ответы в однодневных и пятидневных культурах.Достигнув периферического поля легких, проводящие дыхательные пути разветвляются в дыхательные протоки и мешочки, окружающие небольшие внутриацинарные артериолы. При воздействии эндотелия оба дыхательных пути и легочные артерии сужаются, что сопровождается индуцированной расслаблением NOC-5. В состоянии покоя нагруженные кальциевым красителем срезы показали низкую флуоресценцию в гладкомышечных клетках дыхательных путей и сосудистой системы под конфокальным флуоресцентным микроскопом.При воздействии агонистов интенсивность флуоресценции кальция повышалась в клетках и распространялась на всю клетку, что коррелировало с колебательными сигналами. С точки зрения техники, важно раздувать легкое агарозой однородно и избегать быстрой или чрезмерной инъекции агарозы. Всегда проталкивайте воздух в конце, чтобы промыть агарозу из проводящих дыхательных путей в дистальное пространство альвеол.Таким образом, используя культуру прецизионных срезов легких, можно обеспечить особое разнообразие функций гладкой мускулатуры легких и смоделировать дерегуляцию гладкой мускулатуры in vitro. Он также обеспечивает идеальную платформу для скрининга ново вазодилататорных или бронходилататорных препаратов.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Фокусное Ca 2 + Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Гетеротопическая и Ортотопическая трахеи трансплантации в мышах используются в качестве моделей для изучения развития Облитерирующий заболевание дыхательных путей

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Изоляция по правам артерии пуповины гладкомышечных клеток (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Определение оксида азота и супероксид анион-радикал электронов парамагнитного резонанса от клеток с использованием спиновых ловушек

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...