Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Este trabajo está respaldado por subvenciones de los NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/B6 de tipo salvaje, de 8 semanas de edad.
1. Preparación experimental
<ol><li>Prepare la solución de trabajo.<ol>
<li>Preparar 1 solución de sal equilibrada de Hank (HBSS, con Ca2+ y Mg2+, y pH equilibrado con 20 mM HEPES, ver Ta...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. 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J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

La preparación de PCLS implica varios pasos críticos. En primer lugar, es esencial inflar el lóbulo pulmonar de manera homogénea para evitar la variación de la rigidez del tejido por la distribución desigual de la agarosa. A medida que la agarosa líquida se gelifica rápidamente en catéteres delgados o vías respiratorias a una temperatura inferior a 37 ° C, el defecto de llenado resultante en el campo pulmonar distal podría aumentar la disparidad de rigidez del tejido pulmonar y causar desgarro del tejido dura...

La célula del músculo liso (SMC) es un tipo de célula estructural importante en el pulmón, que reside principalmente en la pared media de las vías respiratorias y los vasos pulmonares. Los SMC se contraen para alterar el calibre luminal, regulando así el aire y el flujo sanguíneo 1,2. Por lo tanto, la regulación contráctil de los SMC es esencial para mantener la homeostasis de la ventilación del aire y la circulación pulmonar. Por el contrario, la contractilidad aberrante de SMC provoca enfermedades vasculares pulmonares o obstructivas de las vías respiratorias como el asma y la hipertensión arterial pulmonar. Sin embargo, la evaluación funcional de los SMC pulmonares se ha visto desafiada por el acceso limitado al tejido pulmonar, especialmente aquellas vías respiratorias pequeñas y microvasos en la parte distal del pulmón 2,3. Las soluciones actuales recurren a ensayos indirectos, como la medición de la resistencia al flujo de aire por Flexivent para reflejar la constricción de las vías respiratorias, y la comprobación de la presión arterial pulmonar mediante cateterismo cardíaco derecho para evaluar la vasocontracción pulmonar 4,5. Sin embargo, estos ensayos indirectos tienen múltiples desventajas, como ser confundidos por factores estructurales, no capturar la diversidad espacial de las respuestas respiratorias o vasculares en toda la escala pulmonar 6,7, e inadecuados para el estudio mecanicista de la regulación contráctil a nivel celular. Por lo tanto, se han aplicado enfoques alternativos utilizando células primarias aisladas, tiras musculares de tráquea / bronquios 8,9 o grandes segmentos vasculares10 para el estudio SMC in vitro. Sin embargo, estos métodos también tienen limitaciones. Por ejemplo, una rápida adaptación fenotípica de los SMC primarios en la condición de cultivo11,12 hace que sea problemático extrapolar los hallazgos del cultivo celular a los entornos in vivo. Además, el fenotipo contráctil de las CME en los segmentos aislados de la vía aérea proximal o vascular puede no representar las CME en el pulmón distal 6,7. Además, la medición de la fuerza muscular a nivel tisular permanece disociada de los eventos moleculares y celulares que son esenciales para la comprensión mecanicista de la regulación contráctil.
La rebanada pulmonar cortada con precisión (PCLS), una sección de tejido pulmonar vivo, proporciona una herramienta ex vivo ideal para caracterizar las SMC pulmonares en un microambiente casi in vivo (es decir, arquitectura e interacción multicelular preservada)13. Desde que los doctores Placke y Fisher introdujeron por primera vez la preparación de rodajas pulmonares a partir de pulmones de rata y hámster inflados con agarosa en ladécada de 1980 14,15, esta técnica se ha avanzado continuamente para proporcionar a los PCLS una mayor calidad y una mayor versatilidad para la investigación biomédica. Una mejora significativa es la mejora de la preservación arterial pulmonar mediante infusión de gelatina, además de la inflación pulmonar con agarosa a través de la tráquea. Como resultado, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se mantienen intactas en el PCLS para la evaluación ex vivo 16. Además, el PCLS es viable durante un tiempo prolongado en cultivo. Por ejemplo, los PCLS de ratón no tuvieron cambios significativos en la viabilidad celular y el metabolismo durante un mínimo de 12 días en cultivo, así como, retuvieron la contractilidad de las vías respiratorias durante un máximo de 7 días17. Además, PCLS mantiene vías respiratorias o vasos de diferentes tamaños para ensayos de contracción y relajación. Además, la señalización intracelular de Ca2+ de las SMC, el factor determinante de la contractilidad celular, se puede ensayar con colorantes reporteros de Ca2+ fotografiados por un microscopio confocal o de 2 fotones13.
Teniendo en cuenta la amplia aplicación del modelo de ratón en la investigación pulmonar, aquí se describe un protocolo detallado para preparar PCLS de ratón con vías respiratorias y arterias intrapulmonares intactas para la investigación pulmonar ex vivo . Utilizando los PCLS preparados, posteriormente demostramos cómo evaluar las respuestas arteriales respiratorias y pulmonares a estímulos constrictivos o relajantes. Además, también se describe el método de carga del PCLS con colorante reportero Ca2+ y luego la obtención de imágenes de la señalización ca2+ de los SMC asociados con respuestas contráctiles o relajantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Las células del músculo liso (SMC) median la contracción de las vías respiratorias y la arteria intrapulmonar para modificar la resistencia al flujo de aire y la circulación pulmonar, respectivamente, desempeñando así un papel crítico en la homeostasis del sistema pulmonar. La desregulación de la contractilidad de SMC contribuye a varias enfermedades pulmonares, incluyendo el asma y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, debido al acceso limitado a los tejidos y la falta de sistemas de cultivo para mantener fenotipos de SMC in vivo , los mecanismos moleculares subyacentes a la contractilidad desregulada de SMC en estas enfermedades permanecen completamente identificados. La rodaja pulmonar cortada con precisión (PCLS) ofrece un modelo ex vivo que evita estas dificultades técnicas. Como una sección de tejido pulmonar delgado y vivo, el PCLS retiene SMC en un entorno natural y permite el seguimiento in situ de la contracción de SMC y la señalización intracelular de Ca2 + que regula la contractilidad de SMC. Aquí, se proporciona un protocolo detallado de preparación de PCLS de ratón, que preserva las vías respiratorias intactas y las arterias intrapulmonares. Este protocolo implica dos pasos esenciales antes de someter el lóbulo pulmonar a corte: inflar la vía aérea con agarosa de bajo punto de fusión a través de la tráquea y rellenar los vasos pulmonares con gelatina a través del ventrículo derecho. El PCLS preparado utilizando este protocolo se puede utilizar para bioensayos para evaluar la regulación contráctil mediada por Ca2+ de SMC tanto en la vía aérea como en los compartimentos arteriales intrapulmonares. Cuando se aplica a modelos de ratón de enfermedades respiratorias, este protocolo permite la investigación funcional de SMC, proporcionando así información sobre el mecanismo subyacente de desregulación de la contractilidad de SMC en enfermedades.

Preparación de PCLS de ratón que preserva intactas las vías respiratorias y arterias intrapulmonares Se observó un PCLS de 150 μm de espesor bajo el microscopio de contraste de fase invertido. En los pulmones de ratón, las vías respiratorias conductoras se acompañan de arterias intrapulmonares, que van desde el hilio hasta el pulmón periférico. En la Figura 2B se muestra un haz representativo de las vías respiratorias pulmonares-arteria en un PCLS de ratón. La...

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Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

El PCLS apoya la evaluación de la actividad de las células del músculo liso vascular y de las vías respiratorias en un entorno tisular casi intacto, proporcionando así un modelo ex vivo invaluable para la investigación pulmonar. En términos de investigación del músculo liso, las rodajas de pulmón cortadas con precisión preservan el fenotipo in vivo de las células del músculo liso y su interacción con las estructuras circundantes, al tiempo que permiten el acceso a la célula muscular lisa, lo cual es importante para un estudio mecanicista a nivel celular. Para comenzar, coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección en posición supina.Fije la cola, las patas delanteras y la cabeza con agujas de jeringa 25G y desinfecte el cuerpo con etanol al 70%. Abra la cavidad torácica con cuidado a lo largo del esternón y la caja torácica inferior bilateral por encima del diafragma. Luego, apunte la punta de la tijera afilada lejos del tejido pulmonar y retire parte de las cajas torácicas ventrales bilaterales para exponer el corazón.Observe que los lóbulos pulmonares colapsan cuando se abre la cavidad torácica. Use tijeras para eliminar el tejido blando en el cuello del ratón para exponer la tráquea. En el extremo superior de la tráquea se hace un pequeño orificio de diámetro de 1,2 milímetros que debe permitir el paso de una punta de catéter IV en forma de Y de 20G.Conecte un puerto adaptador del catéter en forma de Y con una jeringa de 3 mililitros precargada con 0,5 mililitros de aire y el otro puerto con una jeringa de 3 mililitros precargada con 2 mililitros de solución de agarosa al 1,5% calentada a 42 grados Celsius. Inyecte solución de agarosa para llenar el catéter y luego empuje el catéter a través de la abertura hacia la tráquea a 5 a 8 milímetros. Inyecte lentamente la solución de agarosa a una velocidad de 1 mililitro por 5 segundos.Observe que el pulmón se expande a lo largo del eje proximal a distal. Detenga la inyección cuando el borde de cada lóbulo pulmonar esté inflado. Luego, inyecte de 0.2 a 0.3 mililitros de aire de la otra jeringa para empujar la agarosa residual hacia las vías respiratorias conductoras hasta el espacio de los alvéolos distales.Clip cerró la tráquea con un par de pinzas hemostáticas curvas. Para rellenar la vasculatura pulmonar, llene una jeringa de 1 mililitro con gelatina tibia al 6% y conéctela a un catéter de vena del cuero cabelludo con aguja. Llene el catéter con solución de gelatina y luego perfore el ventrículo derecho cerca de la pared inferior con la aguja.Empuje la aguja durante 2 a 3 milímetros en el ventrículo derecho y apunte la punta de la aguja a la arteria pulmonar principal. Inyecte aproximadamente 0,2 mililitros de solución de gelatina lentamente en el ventrículo derecho y los vasos arteriales pulmonares. Mantenga la aguja en su lugar durante cinco minutos después de la inyección y enfríe los lóbulos pulmonares vertiendo solución de HBSS helada sobre el corazón y el pulmón y coloque el cuerpo en un refrigerador.Después de este paso, retire el pulmón y el corazón del ratón de los tejidos conectivos circundantes con tijeras. Luego, separe cada lóbulo pulmonar y manténgalos en solución HBSS en hielo. Recorte el lóbulo pulmonar y oriente de tal manera que la dirección de corte sea perpendicular a la mayoría de las vías respiratorias desde la hila hasta la superficie pulmonar.Colóquelo en la parte superior de la columna de muestra con súper pegamento. Use un vibratome con una cuchilla de afeitar fina y fresca para cortar el lóbulo pulmonar en rodajas de 150 micrómetros. Recoger las rodajas en placas de Petri estériles prellenadas con solución fría de HBSS.Transfiera las rodajas a placas de Petri rellenas con medio de cultivo DMEM/F-12. Coloque los platos en una incubadora de 37 grados centígrados durante la noche antes de los experimentos. Coloque una sola rebanada de pulmón cortada con precisión en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos llena de HBSS.Ubique la rebanada en el centro del pozo y luego retire la solución HBSS con una pipeta. Bajo un microscopio, encuentre la vía aérea objetivo y el vaso en la rebanada y luego cúbralo con una malla de nylon con un orificio central precortado para exponer el área del vaso de las vías respiratorias objetivo. Coloque una arandela de metal hueca en la parte superior de la malla para mantener las rodajas en su lugar.Luego, agregue 600 microlitros de solución HBSS para sumergir las rodajas. Después de 10 minutos, grabe las imágenes de línea base. Para inducir la contracción de las vías respiratorias o vascular, retire con precaución la solución de HBSS con una pipeta y agregue 600 microlitros de HBSS con un agonista.Para preparar el tampón de carga de colorante de calcio, primero disuelva 50 microgramos de tinte con 10 microlitros de DMSO y 0,2 gramos de polvo Pluronic F-12 en 1 mililitro de DMSO. Mezclar 10 microlitros de la solución Plurónica con 10 microlitros de solución de colorante de calcio. Agregue esta mezcla a 2 mililitros de solución de HBSS que contenga 200 micromolares de sulfobromoftaleína.Luego, coloque 15 rodajas de pulmón cortadas con precisión en 2 mililitros de tampón de carga de calcio e incube a 30 grados Celsius durante una hora, seguido de incubar en HBSS que contenga 100 sulfobromoftaleína micromolar durante 30 minutos. Luego, coloque las rodajas cargadas de colorante de calcio en un vaso de cubierta grande. Llene la grasa de silicona de alto vacío en una jeringa de 3 mililitros conectada a una aguja roma de 18G o a una punta de pipeta de 200 microlitros y dibuje dos líneas paralelas a través del vidrio de la cubierta, por encima y por debajo de la rebanada.Cubra la rodaja con una malla de nylon entre dos líneas de grasa. Coloque el vidrio de la segunda cubierta en la parte superior de la malla para generar una cámara. Agregue HBSS o una solución agonista en la cámara desde un extremo con una pipeta.Retire el líquido de la cámara succionando desde el otro extremo con papel de seda. La cámara de la rebanada ahora está lista para las imágenes de calcio con un microscopio confocal de barrido láser de alta velocidad. Se observaron haces de arterias de las vías respiratorias pulmonares en rodajas pulmonares cortadas con precisión de espesor 150 micrómetros bajo un microscopio de contraste de fase.En estado de reposo, se identificó una vía aérea por células epiteliales cuboidales con una arteria pulmonar cercana. Después de la exposición a la metacolina, el área luminal se redujo mientras que la arteria pulmonar no mostró respuesta a los estímulos. Las respuestas contráctiles de las vías respiratorias se cuantificaron por el porcentaje de reducción del área luminal y mostraron respuestas dependientes de la dosis similares en cultivos de un día y cinco días.Al llegar al campo pulmonar periférico, las vías respiratorias conductoras se ramifican en conductos respiratorios y sacos que rodean las pequeñas arteriolas intraacinares. Cuando se expone a endothelii, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se contraen, lo que es seguido por la relajación inducida por NOC-5. En el estado de reposo, las rodajas cargadas de colorante de calcio mostraron baja fluorescencia en las células del músculo liso de las vías respiratorias y el sistema vascular bajo un microscopio fluorescente confocal.Tras la exposición a los agonistas, la intensidad de la fluorescencia de calcio se elevó en las células y se propagó a toda la célula, lo que se correlacionó con las señales oscilatorias. En cuanto a la técnica, es esencial inflar el pulmón con agarosa de manera homogénea y evitar la inyección rápida o excesiva de agarosa. Siempre empuje el aire al final para enjuagar la agarosa desde la vía aérea conductora hasta el espacio de los alvéolos distales.En resumen, utilizando el cultivo de cortes de pulmón cortados con precisión, se puede proporcionar una variedad especial de funciones del músculo liso pulmonar y modelar la desregulación del músculo liso in vitro. También proporciona una plataforma ideal para detectar medicamentos vasodilatadores o broncodilatadores novo.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Los estímulos generados por ordenador Modelo animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

El trasplante heterotópico traqueal y ortotópico en ratones utilizados como modelos para estudiar el desarrollo de la enfermedad de las vías respiratorias obliterante

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...