Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH-bidrag, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

All djurvård var i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Vildtyp C57/B6 hanmöss, 8 veckors ålder, användes för den aktuella studien.
1. Experimentell förberedelse
<ol><li>Förbered arbetslösningen.<ol>
<li>Förbered 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS, med Ca2+ och Mg2+, och pH balanserad med 20 mM HEPES, se materialtabell). Använd HBSS-lösningen för ...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

Förberedelsen av PCLS innebär flera kritiska steg. För det första är det viktigt att blåsa upp lungloben homogent för att undvika variation av vävnadsstyvhet från ojämn agarosfördelning. Eftersom den flytande agarosen snabbt gelerar i tunna katetrar eller luftvägar vid en temperatur under 37 °C, kan den resulterande fyllningsdefekten i det distala lungfältet öka skillnaden i lungvävnadsstyvhet och orsaka vävnadsrivning under vibratomsektionen. Därför kan man öva på att hålla den lågsmältande agaro...

Glattmuskelcell (SMC) är en viktig strukturell celltyp i lungan, som främst bor i medieväggen i luftvägar och lungkärl. SMC kontrakterar för att ändra den luminala kalibern och därmed reglera luft- och blodflödet 1,2. Därför är kontraktil reglering av SMC viktigt för att upprätthålla homeostasen för luftventilation och lungcirkulation. Däremot framkallar avvikande SMC-kontraktilitet obstruktiv luftväg eller lungkärlssjukdomar som astma och pulmonell arteriell hypertension. Den funktionella bedömningen av lung-SMC har dock utmanats av begränsad tillgång till lungvävnaden, särskilt de små luftvägarna och mikrovågorna i den distala delen av lungan 2,3. Nuvarande lösningar använder indirekta analyser, såsom mätning av luftflödesmotstånd av Flexivent för att återspegla luftvägsförträngning och kontroll av lungartäriellt blodtryck genom höger hjärtkateterisering för att bedöma lungvasokontraktion 4,5. Dessa indirekta analyser har emellertid flera nackdelar, såsom att de är förvirrade av strukturella faktorer, misslyckas med att fånga den rumsliga mångfalden av luftvägs- eller vaskulära svar i hela lungskalan 6,7 och olämpliga för den mekanistiska studien av kontraktil reglering på cellulär nivå. Därför har alternativa metoder med isolerade primära celler, luftstrupen/bronkimuskelremsor 8,9 eller stora vaskulära segment10 tillämpats för SMC-studien in vitro. Ändå har dessa metoder också begränsningar. Till exempel gör en snabb fenotypisk anpassning av primära SMC i odlingstillståndet11,12 det problematiskt att extrapolera fynd från cellodling till in vivo-inställningar. Dessutom kan kontraktilfenotypen av SMC i de isolerade proximala luftvägarna eller vaskulära segmenten inte representera SMC i den distala lungan 6,7. Dessutom förblir muskelkraftmätningen på vävnadsnivå dissocierad från molekylära och cellulära händelser som är väsentliga för mekanistisk insikt i kontraktil reglering.
Precisionsskuren lungskiva (PCLS), en levande lungvävnadssektion, ger ett idealiskt ex vivo-verktyg för att karakterisera pulmonella SMC i en nära in vivo mikromiljö (dvs. bevarad flercellig arkitektur och interaktion)13. Sedan Drs. Placke och Fisher först introducerade beredningen av lungskivor från agarosuppblåsta rått- och hamsterlungor på 1980-talet 14,15, har denna teknik utvecklats kontinuerligt för att ge PCLS med högre kvalitet och större mångsidighet för biomedicinsk forskning. En signifikant förbättring är förbättringen av lungartärbevarandet genom gelatininfusion utöver lunginflation med agaros via luftstrupen. Som ett resultat hålls både luftvägarna och lungartärerna intakta i PCLS för ex vivo-bedömning 16. Dessutom, PCLS är livskraftig under en längre tid i kulturen. Till exempel hade MUS-PCLS ingen signifikant förändring i cellviabilitet och metabolism under minst 12 dagar i odling, liksom de behöll luftvägskontraktilitet i upp till 7 dagar17. Dessutom håller PCLS luftvägar eller fartyg i olika storlekar för sammandragnings- och avslappningsanalyser. Dessutom kan intracellulär Ca2+ signalering av SMC, den avgörande faktorn för cellkontraktilitet, analyseras med Ca2+ reporterfärger avbildade av ett konfokalt eller 2-fotonmikroskop13.
Med tanke på den omfattande tillämpningen av musmodellen i lungforskning beskrivs här ett detaljerat protokoll för att förbereda mus-PCLS med intakta luftvägar och intrapulmonala artärer för ex vivo lungforskning. Med hjälp av de beredda PCLS:erna demonstrerade vi därefter hur man utvärderar luftvägs- och lungartärsvaren på sammandragande eller avslappnande stimuli. Dessutom beskrivs metoden för att ladda PCLS med Ca2+ reporterfärgämne och sedan avbilda Ca2+ signalering av SMC associerade med kontraktila eller avslappnande svar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Glattmuskelceller (SMC) förmedlar sammandragningen av luftvägarna och den intrapulmonella artären för att modifiera luftflödesmotståndet respektive lungcirkulationen och spelar därmed en kritisk roll i lungsystemets homeostas. Avreglering av SMC-kontraktilitet bidrar till flera lungsjukdomar, inklusive astma och pulmonell hypertension. På grund av begränsad vävnadstillgång och brist på odlingssystem för att upprätthålla in vivo SMC-fenotyper förblir molekylära mekanismer som ligger till grund för den avreglerade SMC-kontraktiliteten vid dessa sjukdomar fortfarande fullständigt identifierade. Den precisionsskurna lungskivan (PCLS) erbjuder en ex vivo-modell som kringgår dessa tekniska svårigheter. Som en levande, tunn lungvävnadssektion behåller PCLS SMC i naturliga omgivningar och möjliggör in situ-spårning av SMC-sammandragning och intracellulär Ca2+ -signalering som reglerar SMC-kontraktilitet. Här tillhandahålls ett detaljerat PCLS-beredningsprotokoll för mus som bevarar intakta luftvägar och intrapulmonala artärer. Detta protokoll innefattar två viktiga steg innan lungloben utsätts för skivning: blåsa upp luftvägarna med lågsmältpunktsagaros genom luftstrupen och fylla lungkärlen med gelatin genom höger kammare. PCLS framställd med hjälp av detta protokoll kan användas för bioassays för att utvärdera Ca2+-medierad kontraktil reglering av SMC i både luftvägarna och de intrapulmonella artärfacken. När det tillämpas på musmodeller av luftvägssjukdomar möjliggör detta protokoll funktionell undersökning av SMC, vilket ger insikt i den underliggande mekanismen för SMC-kontraktilitetsavreglering vid sjukdomar.

Mus PCLS-preparat som bevarar intakta intrapulmonala luftvägar och artärer En 150 μm tjock PCLS observerades under det inverterade faskontrastmikroskopet. I muslungor åtföljs ledande luftvägar av intrapulmonala artärer, som löper från hilus till perifer lunga. En representativ lungluftvägsartärbunt i en MUS-PCLS visas i figur 2B. Luftvägarna kan lätt identifieras av kuboidala epitelceller med aktiv cilial slående som foder den inre ytan av lumen. Däremot pr...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Det nuvarande protokollet beskriver beredning och användning av musprecisionsskurna lungskivor för att bedöma luftvägarna och intrapulmonell arteriell glattmuskelkontraktilitet i en nästan in vivo-miljö .

Använda den precisionsskurna lungskivan för att studera kontraktil reglering av luftvägar och intrapulmonell arteriell glattmuskel

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS stöder bedömningen av luftvägs- och vaskulär glattmuskelcellaktivitet i en nästan intakt vävnadsmiljö, vilket ger en ovärderlig ex vivo-modell för lungforskning. När det gäller glattmuskelforskning bevarar de precisionsskurna lungskivorna in vivo fenotypen av glattmuskelceller och deras interaktion med omgivande strukturer samtidigt som de ger tillgång till glattmuskelceller, vilket är viktigt för en mekanistisk studie på cellnivå. För att börja, placera muskroppen på ett dissektionskort i ryggläge.Pinna ner svansen, framtassarna och huvudet med 25G sprutnålar och sanera kroppen med 70% etanol. Öppna bröstkaviteten försiktigt längs bröstbenet och bilateral underlägsen ribbbur ovanför membranet. Rikta sedan den vassa saxspetsen bort från lungvävnaden och ta bort en del av de bilaterala ventrala bröstkorgarna för att exponera hjärtat.Observera att lungloberna kollapsar när bröstkaviteten öppnas. Använd sax för att ta bort mjukvävnad i mushalsen för att exponera luftstrupen. I den övre änden av luftstrupen gör du ett litet hål med diameter 1,2 millimeter som ska möjliggöra passage av en 20G Y-formad IV-kateterspets.Anslut en adapterport på den Y-formade katetern med en 3 ml spruta förfylld med 0,5 ml luft och den andra porten med en 3 ml spruta förfylld med 2 ml 1,5% agaroslösning uppvärmd till 42 grader Celsius. Injicera agaroslösning för att fylla katetern och tryck sedan katetern genom öppningen in i luftstrupen till 5 till 8 millimeter. Injicera långsamt agaroslösningen med en hastighet av 1 milliliter per 5 sekunder.Observera att lungan expanderar längs den proximala till distala axeln. Avbryt injektionen när kanten på varje lunglob är uppblåst. Injicera sedan 0,2 till 0,3 ml luft från den andra sprutan för att trycka in den kvarvarande agarosen i ledande luftvägar till det distala alveolen.Clip stängde luftstrupen med ett par böjda hemostatiska pincett. För att fylla lungkärlen, fyll en 1 ml spruta med varm 6% gelatin och anslut den till en nålskallpvenkateter. Fyll katetern med gelatinlösning och punktera sedan höger kammare nära den underlägsna väggen med nålen.Tryck nålen i 2 till 3 millimeter in i höger kammare och rikta nålspetsen mot lungartären. Injicera cirka 0,2 ml gelatinlösning långsamt i höger kammare och lungartärkärl. Håll nålen på plats i fem minuter efter injektionen och kyl lungloberna genom att hälla iskall HBSS-lösning på hjärtat och lungan och placera kroppen i kylskåp.Efter detta steg, ta bort muslungan och hjärtat från omgivande bindväv med sax. Separera sedan varje lunglob och förvara dem i HBSS-lösning på is. Trimma lungloben och orientera den så att skärriktningen är vinkelrät mot de flesta luftvägar från hila till lungytan.Fäst den ovanpå provkolonnen med superlim. Använd ett vibratom med ett nytt tunt rakblad för att skära lungloben i 150 mikrometer skivor. Samla skivorna i sterila petriskålar förfyllda med kall HBSS-lösning.Överför skivorna till petriskålar fyllda med DMEM / F-12 odlingsmedium. Placera diskarna i en 37 grader Celsius inkubator över natten före experimenten. Placera en enda precisionsskuren lungskiva i varje brunn på en 24-brunns odlingsplatta fylld med HBSS.Leta reda på skivan i mitten av brunnen och ta sedan bort HBSS-lösningen med en pipett. Under ett mikroskop, hitta målluftvägen och kärlet i skivan och täck det sedan med ett nylonnät med ett förklippt centralt hål för att exponera det riktade luftvägskärlsområdet. Lägg en ihålig metallbricka ovanpå nätet för att hålla skivorna på plats.Tillsätt sedan 600 mikroliter HBSS-lösning för att sänka skivorna. Efter 10 minuter registrerar du baslinjebilderna. För att inducera luftvägs- eller kärlkontraktionen, ta försiktigt bort HBSS-lösningen med en pipett och tillsätt 600 mikroliter HBSS med en agonist.För att förbereda kalciumfärgbelastningsbufferten, lös först 50 mikrogram färgämne med 10 mikroliter DMSO och 0,2 gram Pluronic F-12-pulver i 1 milliliter DMSO. Blanda 10 mikroliter av Pluronic-lösningen med 10 mikroliter kalciumfärglösning. Tillsätt denna blandning till 2 ml HBSS-lösning innehållande 200 mikromolar sulfobromfalein.Placera sedan 15 precisionsskurna lungskivor i 2 ml kalciumbelastningsbuffert och inkubera vid 30 grader Celsius i en timme, följt av inkubering i HBSS innehållande 100 mikromolärt sulfobromftalein i 30 minuter. Placera sedan kalciumfärgsbelastade skivor på ett stort täckglas. Fyll silikonfett med högt vakuum i en 3 ml spruta fäst vid 18G trubbig nål eller en 200 mikroliterpipettspets och dra två parallella linjer över täckglaset, ovanför och under skivan.Täck skivan med ett nylonnät mellan två fettlinjer. Placera det andra täckglaset ovanpå nätet för att generera en kammare. Tillsätt HBSS eller en agonistlösning i kammaren från ena änden med en pipett.Ta bort vätskan från kammaren genom att suga från den andra änden med silkespapper. Skivans kammare är nu redo för kalciumavbildning med ett höghastighetslaserscanningskonfokalmikroskop. Pulmonella luftvägsartärbuntar observerades i precisionsskurna lungskivor med tjocklek 150 mikrometer under ett faskontrastmikroskop.Vid vilotillstånd identifierades en luftväg av kuboidala epitelceller med en närliggande lungartär. Efter exponering för metakolin minskade ljusområdet medan lungartären inte visade något svar på stimuli. Luftvägskontraktila svar kvantifierades med procentandelen luminal areareduktion och visade liknande dosberoende svar i en dag och fem dagars kulturer.När de når det perifera lungfältet förgrenar sig de ledande luftvägarna i luftvägarna och säckarna som omger de små intra-acinära arteriolerna. När de utsätts för endotel både luftvägar och lungartärer förträngs, vilket följs av NOC-5 inducerad avslappning. Vid vilotillståndet visade de kalciumfärgsbelastade skivorna låg fluorescens i glattmuskelcellerna i luftvägarna och kärlsystemet under ett konfokalt fluorescerande mikroskop.Vid exponering för agonister förhöjdes kalciumfluorescensintensiteten i cellerna och förökades till hela cellen, vilket korrelerade med de oscillerande signalerna. Tekniskt sett är det viktigt att blåsa upp lungan med agaros homogent och undvika snabb eller överdriven agarosinjektion. Tryck alltid på luft i slutet för att spola agarosen från den ledande luftvägen till det distala alveolen.Sammanfattningsvis kan man med hjälp av den precisionsskurna lungskivakulturen tillhandahålla en speciell variation av lungmuskelfunktioner och modellera glattmuskelavregleringen in vitro. Det ger också en idealisk plattform för att screena novo vasodilaterande eller bronkdilaterande läkemedel.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotopisk och Orthotopic Trakealtuber transplantation på möss används som modeller för att studera utvecklingen av Obliterativ luftvägssjukdom

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detektering av kväveoxid och superoxidradikalanjonen genom elektronparamagnetisk resonans-spektroskopi från celler med användning av spin traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploring arteriella glatta muskel KV7 Funktion kaliumkanal med Elektrofysiologi Patch Clamp och tryck Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mätning av Smooth muskelfunktion i isolerad vävnad Bath-ansökningar till farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...