Name: utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibeleri, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan bakımı, Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundu. Bu çalışmada 8 haftalık vahşi tip C57/B6 erkek fareler kullanılmıştır.
1. Deneysel hazırlık
<ol><li>Çalışma çözümünü hazırlayın.<ol>
<li>1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (HBSS, Ca 2+ ve Mg 2+ ile ve pH20 mM HEPES ile dengelenmiştir, Malzeme Tablosuna bakınız). PCLS'yi h...

<ol>
	<li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function:+implications+for+health+and+disease.">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li><li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension:+implications+for+therapy.">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li><li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma.">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li><li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique.">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).</li><li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia/SU5416+model.">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).</li><li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension.">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li><li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+and+Ca2++signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways.">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li><li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species.">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca(2+)+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma.">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li><li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries:+an+in+vitro+study.">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li><li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture:+induction+of+functionally+contractile+myocytes.">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li><li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology.">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li><li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+lung+toxicity.">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2++oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl.">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+confocal+microscopy.">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li><li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability.">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).</li><li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells.">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li><li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2++oscillations.">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease.">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li><li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma.">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li><li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NT4/TrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity.">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+tissue+slice+culture.">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility.">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li><li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices.">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li><li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices.">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists.">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li><li>Mondo&#241;edo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure.">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).</li><li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices.">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li><li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices.">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li></ol>

PCLS'nin hazırlanması birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, doku sertliğinin düzensiz agaroz dağılımından değişmesini önlemek için akciğer lobunu homojen olarak şişirmek esastır. Sıvı agaroz, 37 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta ince kateterlerde veya hava yollarında hızla jelleştikçe, distal akciğer alanında ortaya çıkan dolgu defekti, akciğer dokusu sertliğinin eşitsizliğini artırabilir ve vibratom kesiti sırasında doku yırtılmasına neden olabilir. Bu nedenle, düşük erim...

Düz kas hücresi (SMC), öncelikle hava yollarının ve pulmoner damarların medya duvarında bulunan, akciğerde önemli bir yapısal hücre tipidir. SMC'ler luminal kalibreyi değiştirmek için büzülür, böylece hava ve kan akışını düzenler 1,2. Bu nedenle, SMC'lerin kontraktil regülasyonu, hava ventilasyonu ve pulmoner dolaşımın homeostazını korumak için esastır. Buna karşılık, anormal SMC kontraktilitesi obstrüktif hava yolunu veya astım ve pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkları tetikler. Bununla birlikte, akciğer SMC'lerinin fonksiyonel değerlendirmesi, akciğer dokusuna, özellikle de akciğerin distal kısmındaki küçük hava yollarına ve mikrodamarlara sınırlı erişim nedeniyle zorlanmıştır 2,3. Mevcut çözümler, hava yolu daralmasını yansıtmak için Flexivent ile hava akımı direncini ölçmek ve pulmoner vazokontraksiyonu değerlendirmek için sağ kalp kateterizasyonu ile pulmoner arteriyel kan basıncını kontrol etmek gibi dolaylı testlere başvurmaktadır 4,5. Bununla birlikte, bu dolaylı tahlillerin, yapısal faktörler tarafından karıştırılması, tüm akciğer skalası 6,7'deki hava yolunun veya vasküler yanıtların mekansal çeşitliliğini yakalayamaması ve hücresel düzeyde kontraktil regülasyonun mekanik çalışması için uygun olmaması gibi birçok dezavantajı vardır. Bu nedenle, SMC çalışması için in vitro olarak izole primer hücreler, trakea/bronş kas şeritleri 8,9 veya büyük vaskülersegmentler 10 kullanılarak alternatif yaklaşımlar uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır. Örneğin,11,12 kültür koşulundaki primer SMC'lerin hızlı bir fenotipik adaptasyonu, bulguları hücre kültüründen in vivo ortamlara tahmin etmeyi sorunlu hale getirmektedir. Ek olarak, izole proksimal hava yolu veya vasküler segmentlerdeki SMC'lerin kontraktil fenotipi, distal akciğer 6,7'deki SMC'leri temsil etmeyebilir. Dahası, doku seviyesindeki kas kuvveti ölçümü, kasılma regülasyonuna mekanik bakış açısı için gerekli olan moleküler ve hücresel olaylardan ayrışmış olarak kalır.
Canlı bir akciğer dokusu kesiti olan hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), pulmoner SMC'leri yakın in vivo mikro ortamda (yani, korunmuş çok hücreli mimari ve etkileşim) karakterize etmek için ideal bir ex vivo araç sağlar13. Dr. Placke ve Fisher, 1980'lerde agarozla şişirilmiş sıçan ve hamster akciğerlerinden akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ilk kez14,15'te tanıttığından beri, bu teknik, PCLS'lere biyomedikal araştırmalar için daha yüksek kalite ve çok yönlülük sağlamak için sürekli olarak geliştirilmiştir. Önemli bir gelişme, trakea yoluyla agarozlu akciğer enflasyonuna ek olarak, jelatin infüzyonu ile pulmoner arteriyel korumanın arttırılmasıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirme16 için PCLS'de hem hava yolu hem de pulmoner arterler sağlam tutulur. Ayrıca, PCLS kültürde uzun süre uygulanabilir. Örneğin, fare PCLS'lerinin kültürde en az 12 gün boyunca hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli bir değişiklik olmadı ve ayrıca 7 güne kadar hava yolu kontraktilitesini korudular17. Ek olarak, PCLS kasılma ve gevşeme tahlilleri için farklı boyutlarda hava yolları veya damarlar tutar. Ayrıca, hücre kontraktilitesinin belirleyici faktörü olan SMC'lerin hücre içi Ca2+ sinyalizasyonu, bir konfokal veya 2-foton mikroskobu13 tarafından görüntülenen Ca 2+ muhabir boyaları ile test edilebilir.
Fare modelinin akciğer araştırmalarında kapsamlı bir şekilde uygulanması göz önüne alındığında, burada ex vivo akciğer araştırması için sağlam hava yolları ve intrapulmoner arterlere sahip fare PCL'lerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Hazırlanan PCLS'leri kullanarak, konstrüktif veya gevşetici uyaranlara karşı hava yolu ve pulmoner arteriyel yanıtların nasıl değerlendirileceğini gösterdik. Ek olarak, PCLS'yi Ca 2+ muhabir boyası ile yükleme ve daha sonra kasılma veya gevşetici yanıtlarla ilişkili SMC'lerin Ca2+ sinyallemesini görüntüleme yöntemi de tanımlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-beta-methacholine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>62-51-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-anitmycotic</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ds-Ri2 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glassess</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-built laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Details in Reference 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-10-092-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin 1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissecting scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9702861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forcep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vaccum silicone grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal washers</td>
			<td>Home Depot Product Authority</td>
			<td>800442</td>
			<td>Everbilt Flat Washers #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forcep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle scalp vein set (25 G)</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-5</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>o-6807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P-6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfobromophthalein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td></td>
			<td>Krazy Glue, All purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome chilling block</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU-VM-CB12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome specimen tube</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y shaped IV catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>383336</td>
			<td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle

Düz kas hücreleri (SMC), sırasıyla hava akımı direncini ve pulmoner dolaşımı değiştirmek için hava yolunun ve intrapulmoner arterin kasılmasına aracılık eder, bu nedenle pulmoner sistemin homeostazında kritik bir rol oynar. SMC kontraktilitesinin deregülasyonu, astım ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sınırlı doku erişimi ve in vivo SMC fenotiplerini korumak için kültür sistemlerinin eksikliği nedeniyle, bu hastalıklarda deregüle SMC kontraktilitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak tanımlanmaya devam etmektedir. Hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), bu teknik zorlukları ortadan kaldıran bir ex vivo model sunar. Canlı, ince bir akciğer dokusu kesiti olarak PCLS, SMC'yi doğal ortamda tutar ve SMC kontraktilitesini düzenleyen SMC kontraksiyonunun ve hücre içi Ca2+ sinyallemesinin yerinde izlenmesini sağlar. Burada, sağlam hava yollarını ve intrapulmoner arterleri koruyan ayrıntılı bir fare PCLS hazırlama protokolü sağlanmaktadır. Bu protokol, akciğer lobunu dilimlemeye maruz bırakmadan önce iki temel adımı içerir: trakeadan düşük erime noktalı agaroz ile hava yolunu şişirmek ve pulmoner damarları sağ ventrikülden jelatin ile doldurmak. Bu protokol kullanılarak hazırlanan PCLS, hem hava yolu hem de intrapulmoner arteriyel kompartmanlarda SMC'nin Ca2 + aracılı kontraktil regülasyonunu değerlendirmek için biyotahliller için kullanılabilir. Solunum yolu hastalıklarının fare modellerine uygulandığında, bu protokol SMC'nin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlar, böylece hastalıklarda SMC kontraktilitesi deregülasyonunun altında yatan mekanizma hakkında fikir verir.

Bozulmamış intrapulmoner hava yollarını ve arterleri koruyan fare PCLS preparatı Ters faz kontrast mikroskobu altında 150 μm kalınlığında bir PCLS gözlendi. Fare akciğerlerinde, iletken hava yollarına, hilustan periferik akciğere uzanan intrapulmoner arterler eşlik eder. Bir fare PCLS'sinde temsili bir pulmoner hava yolu-arter demeti Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu, lümenin iç yüzeyini kaplayan aktif siliyal atımlı küboidal epitel hücreleri...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle at JoVE.com

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS, neredeyse bozulmamış bir doku ortamında hava yolu ve vasküler düz kas hücresi aktivitesinin değerlendirilmesini destekler, böylece pulmoner araştırmalar için paha biçilmez bir ex vivo model sağlar. Düz kas araştırması açısından, hassas kesilmiş akciğer dilimleri, düz kas hücrelerinin in vivo fenotipini ve çevre yapılarla etkileşimlerini korurken, hücresel düzeyde mekanik bir çalışma için önemli olan düz kas hücresine erişime izin verir. Başlamak için, fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin.Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25G şırınga iğneleriyle sabitleyin ve% 70 etanol ile vücudu sterilize edin. Göğüs boşluğunu, diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın. Ardından, keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa doğrultun ve kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın.Göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki yumuşak dokuyu çıkarmak için makas kullanın. Trakeanın üst ucunda, 20G Y şeklinde bir IV kateter ucunun geçmesine izin vermesi gereken 1.2 milimetre çapında küçük bir delik açın.Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mililitre hava ile önceden doldurulmuş 3 mililitrelik bir şırıngaya ve diğer portu 42 santigrat dereceye ısıtılmış 2 mililitre% 1,5 agaroz çözeltisi ile önceden doldurulmuş 3 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri açıklıktan trakeaya 5 ila 8 milimetreye kadar itin. Agaroz çözeltisini 5 saniyede 1 mililitre oranında yavaşça enjekte edin.Akciğerin proksimal ila distal eksen boyunca genişlediğini gözlemleyin. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun. Daha sonra, artık agarozu distal alveol boşluğuna iletken hava yollarına itmek için diğer şırıngadan 0.2 ila 0.3 mililitre hava enjekte edin.Klips trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapattı. Pulmoner vaskülatürü doldurmak için, 1 mililitrelik bir şırıngayı sıcak% 6 jelatin ile doldurun ve bir iğne derisi damar kateterine bağlayın. Kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın bir yerde delin.İğneyi 2 ila 3 milimetre boyunca sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun. Yaklaşık 0.2 mililitre jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin. İğneyi enjeksiyondan sonra beş dakika yerinde tutun ve kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun ve vücudu bir buzdolabına koyun.Bu adımdan sonra, fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın. Akciğer lobunu kesin ve kesme yönü hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olacak şekilde yönlendirin.Numune sütununun üstüne süper yapıştırıcı ile takın. Akciğer lobunu 150 mikrometrelik dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş steril Petri kaplarında toplayın.Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın. Bulaşıkları deneylerden önce gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. HBSS ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna tek bir hassas kesimli akciğer dilimi yerleştirin.Dilimi kuyucuğun ortasına yerleştirin ve ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın. Bir mikroskop altında, hedef hava yolunu ve damarı dilimde bulun ve daha sonra hedeflenen hava yolu gemi alanını ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe sahip naylon bir ağ kullanarak örtün. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üstüne içi boş bir metal yıkayıcı koyun.Ardından, dilimleri batırmak için 600 mikrolitre HBSS çözeltisi ekleyin. 10 dakika sonra temel görüntüleri kaydedin. Hava yolunu veya vasküler kasılmayı indüklemek için, HBSS çözeltisini bir pipetle dikkatlice çıkarın ve bir agonist ile 600 mikrolitre HBSS ekleyin.Kalsiyum boya yükleme tamponunu hazırlamak için, önce 10 mililitre DMSO içinde 10 mikrolitre DMSO ve 0.2 gram Pluronik F-12 tozu ile 50 mikrogram boya çözün. Pluronik çözeltinin 10 mikrolitresini 10 mikrolitre kalsiyum boya çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımı 200 mikromolar sülfobromoftalin içeren 2 mililitre HBSS çözeltisine ekleyin.Daha sonra, 2 mililitre kalsiyum yükleme tamponuna 15 hassas kesilmiş akciğer dilimi yerleştirin ve bir saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin, ardından 30 dakika boyunca 100 mikromolar sülfobromoftalin içeren HBSS'de inkübe edin. Ardından, kalsiyum boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin. Yüksek vakumlu silikon gresi, 18G künt iğneye bağlı 3 mililitrelik bir şırıngaya veya 200 mikrolitrelik pipet ucuna doldurun ve kapak camı boyunca, dilimin üstünde ve altında iki paralel çizgi çizin.İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin. HBSS veya agonist solüsyonu hazneye bir ucundan pipetle ekleyin.Diğer ucundan kağıt mendil ile emerek sıvıyı odadan çıkarın. Dilimin haznesi artık yüksek hızlı lazer taramalı konfokal mikroskopla kalsiyum görüntüleme için hazırdır. Pulmoner hava yolu arter demetleri, faz kontrast mikroskobu altında 150 mikrometre kalınlığında hassas kesilmiş akciğer dilimlerinde gözlendi.İstirahat halindeyken, yakındaki bir pulmoner artere sahip küboidal epitel hücreleri tarafından bir hava yolu tanımlandı. Metakoline maruz kaldıktan sonra, pulmoner arter uyaranlara yanıt göstermezken, luminal alan azaldı. Hava yolu kontraktil yanıtları, luminal alan azalmasının yüzdesi ile ölçüldü ve bir günlük ve beş günlük kültürlerde benzer doza bağımlı yanıtlar gösterdi.Periferik akciğer alanına ulaştıktan sonra, iletken hava yolları solunum kanallarına ve küçük intraasinar arteriolleri çevreleyen keselere dallanır. Endotele maruz kaldığında hem hava yolları hem de pulmoner arterler daralır, bunu NOC-5 kaynaklı gevşeme izler. İstirahat halinde, kalsiyum boya yüklü dilimler, konfokal floresan mikroskop altında hava yolu ve vasküler sistemin düz kas hücrelerinde düşük floresan gösterdi.Agonistlere maruz kaldıktan sonra, kalsiyum floresan yoğunluğu hücrelerde yükseldi ve salınım sinyalleri ile ilişkili olan tüm hücreye yayıldı. Teknik olarak, akciğeri agaroz ile homojen bir şekilde şişirmek ve hızlı veya aşırı agaroz enjeksiyonundan kaçınmak esastır. Agarozu iletken hava yolundan distal alveol boşluğuna temizlemek için daima havayı sonuna doğru itin.Özetle, hassas kesilmiş akciğer dilimleri kültürünü kullanarak, özel bir pulmoner düz kas fonksiyonu çeşitliliği sağlanabilir ve düz kas deregülasyonunu in vitro olarak modelleyebilir. Ayrıca novo vazodilatatör veya bronkodilatör ilaçları taramak için ideal bir platform sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliteratif Havayolu Hastalığı Geliştirme Eğitim Modeli olarak kullanılan Farelerde Heterotopik ve Ortotopik Trakeal Nakli

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...