Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

تم إجراء هذا البحث بدعم بموجب رقم المنحة. R01EB012521 و R01EB028782 و T32 GM008339 من المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد أجزاء لتروية لوحة البئر
<ol><li>إعداد الأنابيب<ol>
<li>قطع طولين من أنابيب السيليكون (القطر الداخلي 1.6 مم) لكل مزرعة خلية ليتم اختراقها. تأكد من أن القطعة المستخدمة كأنبوب المنبع طويلة بما يكفي للوصول من مضخة المحاقن إلى مزرعة الخلايا داخل الحاضنة ، وأن القطعة النهائية يمكن أن ت...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

يصف هذا العمل تجميع وتشغيل نظام زراعة خلايا التروية مع مصادر متوسطة متعددة تم إثباتها مع مثال محدد تم فيه قياس ديناميكيات التعبير الجيني المدفوع ب NF-κB استجابة لنبضة عابرة من TNF-α. تم قياس ونمذجة RTDs لمكونات نظام التروية ، وتم استخدام التفاف الإشارة للتنبؤ بكل من تعرض الخلايا لنبضة TNF-α وتوزي...

تحدث العديد من العمليات البيولوجية الهامة في مزارع الخلايا والأنسجة على مقياس زمني من دقائق إلى ساعات 1,2,3. في حين أن بعض هذه الظواهر يمكن ملاحظتها وتسجيلها بطريقة آلية باستخدام المجهربفاصل زمني 4 أو التلألؤ الحيوي1 أو طرق أخرى ، فإن التجارب التي تنطوي على جمع عينات من المستنبتات الفائقة للتحليل الكيميائي غالبا ما يتم إجراؤها يدويا في مزارع الخلايا الثابتة. يحد أخذ العينات اليدوي من جدوى بعض الدراسات بسبب إزعاج النقاط الزمنية المتكررة أو بعد ساعات العمل. وتشمل أوجه القصور الأخرى في أساليب الزراعة الثابتة التجارب التي تنطوي على التعرض الخاضع للرقابة والعابرة للمحفزات الكيميائية. في الثقافات الثابتة ، يجب إضافة المحفزات وإزالتها يدويا ، وتقتصر ملفات تعريف التحفيز على تغييرات الخطوة بمرور الوقت ، بينما تضيف التغييرات المتوسطة أيضا مكونات متوسطة أخرى وتزيلها ، والتي يمكن أن تؤثر على الخلايا بطريقة غير منضبطة5. يمكن للأنظمة الموائعة التغلب على هذه التحديات ، لكن الأجهزة الحالية تشكل تحديات أخرى. تأتي أجهزة الموائع الدقيقة مع التكاليف الباهظة للمعدات المتخصصة والتدريب على الإنتاج والاستخدام ، وتتطلب أساليب التحليل الدقيق لمعالجة العينات ، ويصعب استرداد الخلايا من الأجهزة بعد التروية6. تم إنشاء عدد قليل من أنظمة الموائع الكبيرة لأنواع التجارب الموضحة هنا7،8،9،10 ، وهي مبنية من أجزاء مخصصة متعددة مصنوعة داخليا وتتطلب مضخات متعددة أو جامعي كسر. علاوة على ذلك ، فإن المؤلفين ليسوا على دراية بأي أنظمة متاحة تجاريا لزراعة خلايا التروية الموائع الكبيرة بخلاف المفاعلات الحيوية للخزانات المقلوبة لزراعة التعليق ، والتي تعد مفيدة للتصنيع الحيوي ، على الرغم من أنها ليست مصممة لنمذجة ودراسة علم وظائف الأعضاء.
وكان المؤلفون قد أبلغوا سابقا عن تصميم نظام مفاعل حيوي منخفض التكلفة للإرواء يتكون بالكامل تقريبا من الأجزاء11 المتاحة تجاريا. تمكن النسخة الأساسية من النظام من الاحتفاظ بثقافات متعددة في صفيحة بئر في حاضنة CO2 ودمجها باستمرار مع وسيط من مضخة حقنة ، في حين يتم تقسيم تيارات وسط النفايات السائلة من الثقافات تلقائيا إلى عينات بمرور الوقت باستخدام جامع أجزاء مع تعديل مخصص. وبالتالي ، يتيح هذا النظام أخذ عينات آلية من المدخلات المتوسطة للثقافة الفائقة والمذابة المستمرة للثقافات بمرور الوقت. النظام هو macrofluidic ووحدات ويمكن تعديله بسهولة لتلبية احتياجات تصاميم التجارب الجديدة.
الهدف العام للطريقة المعروضة هنا هو بناء وتوصيف واستخدام نظام زراعة خلايا التروية الذي يتيح إجراء تجارب يتم فيها قياس معدلات إفراز أو امتصاص المواد بواسطة الخلايا بمرور الوقت ، و / أو تعرض الخلايا لإشارات مذابة دقيقة وعابرة. تشرح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، القادر على اختراق ما يصل إلى ست مزارع خلايا في وقت واحد باستخدام مضخة حقنة واحدة وجامع أجزاء معدلة. كما يتم عرض متغيرين مفيدين على النظام الأساسي يستخدمان مضخات وأجزاء إضافية للسماح بإجراء تجارب تعرض الخلايا لإشارات تركيز ذائبة عابرة ، بما في ذلك النبضات القصيرة والملامح الشبيهة بالحركية الدوائية12 ، كما هو موضح في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> الشكل 1: ثلاثة اختلافات في تصميم نظام التروية. (أعلى) نظام التروية الأساسي. (الوسط) نظام التروية مع stopcock لمصادر متوسطة متعددة. (أسفل) نظام التروية مع خزان مقلب لتقليد حجم مختلط جيدا من التوزيع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بسبب التشتت والانتشار داخل التدفق ، تصبح الإشارات المذابة مشوهة أو "ملطخة" أثناء انتقالها عبر نظام التدفق. ويمكن تحديد هذا التشويه كميا من خلال استخدام توزيعات وقت الإقامة (RTDs)13. تشرح هذه المقالة كيفية إجراء تجارب التتبع على مكونات نظام التروية (الشكل 2)، وتوفر البرامج النصية MATLAB لإنشاء RTDs من البيانات المقاسة. ويمكن الاطلاع على شرح مفصل لهذا التحليل في الورقة السابقةللمؤلفين رقم 11. تناسب نصوص MATLAB الإضافية الوظائف المناسبة ل RTDs وتستخرج المعلمات الفيزيائية ، وتؤدي التفاف الإشارة باستخدام RTDs للتنبؤ بكيفية انتشار وتشويه إدخال الإشارة المذاب من قبل المستخدم من خلال نظام التروية14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> الشكل 2: توزيعات وقت الإقامة. يتم قياس RTDs لمكونات نظام التدفق ، مثل طول الأنابيب هذا ، عن طريق إدخال نبضة من المقتفي إلى النظام وقياس كيفية "تلطيخها" بحلول الوقت الذي تخرج فيه إلى الكسور التي تم جمعها. وقد عدل هذا الرقم من Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

تعمل بعض وظائف الخلايا والأنسجة ضمن النطاق الزمني الديناميكي من دقائق إلى ساعات يتم حلها بشكل سيئ بواسطة أنظمة الزراعة التقليدية. وقد طور هذا العمل نظاما منخفض التكلفة للمفاعل الحيوي للتروية يسمح بدمج وسط الاستزراع باستمرار في وحدة زراعة الخلايا وتقسيمه في وحدة المصب لقياس الديناميكيات على هذا النطاق. تم بناء النظام بالكامل تقريبا من الأجزاء المتاحة تجاريا ويمكن موازاته لإجراء تجارب مستقلة في لوحات زراعة الخلايا التقليدية متعددة الآبار في وقت واحد. توضح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، والذي لا يتطلب سوى مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات وجامع أجزاء معدل لدمج ما يصل إلى ست ثقافات بالتوازي. كما يتم تقديم متغيرات مفيدة على التصميم المعياري تسمح بديناميكيات التحفيز التي يتم التحكم فيها ، مثل النبضات المذابة أو الملامح الشبيهة بالحرائك الدوائية. الأهم من ذلك ، عندما تنتقل الإشارات المذابة عبر النظام ، فإنها مشوهة بسبب تشتت المذاب. علاوة على ذلك ، يتم وصف طريقة لقياس توزيعات وقت الإقامة (RTDs) لمكونات إعداد التروية باستخدام جهاز تتبع باستخدام MATLAB. RTDs مفيدة لحساب كيفية تشويه الإشارات المذابة بسبب التدفق في نظام المقصورات المتعددة. هذا النظام قوي للغاية وقابل للتكرار ، لذلك يمكن للباحثين الأساسيين اعتماده بسهولة دون الحاجة إلى مرافق تصنيع متخصصة.

تم استخدام نظام التروية مع مصادر متوسطة متعددة من القسم 5 من البروتوكول لقياس ديناميكيات التعبير لجين مراسل مدفوع بالعامل النووي كابا - محسن سلسلة الضوء - لعامل النسخ للخلايا البائية المنشطة (NF-κB) في خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) استجابة لنبضة 1.5 ساعة من عامل نخر الورم ألفا (TNF-α). تم ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

تقدم هذه الورقة طريقة لبناء وتشغيل نظام منخفض التكلفة متعدد القنوات لزراعة خلايا التروية لقياس ديناميكيات إفراز ومعدلات امتصاص المذابات في العمليات الخلوية. يمكن للنظام أيضا تعريض الخلايا لملفات تعريف التحفيز الديناميكية.

مفاعل حيوي متعدد التيار للتروية مدمج مع تجزئة المخرج لزراعة الخلايا الديناميكية

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

تساعد هذه الطريقة على فهم كيفية تغير معدلات الإفراز مع مرور الوقت وكيف تستجيب الخلايا للإشارات الصلبة المتغيرة زمنيا. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن تكلفتها المنخفضة ، تتطلب القليل من التدريب ويمكن تكييف إعداد نظام الوفرة للتجارب الجديدة. ابدأ بملء حقنة واحدة بمحلول خلفية وقم بتحميلها في مضخة المحقنة الأولى.املأ حقنة أخرى بمحلول التتبع وقم بتحميلها في مضخة المحقنة الثانية. قم بتوصيل كلا المحاقن باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات باستخدام موصلات luer. أغلق الموقوف إلى محلول الخلفية وضخ محلول التتبع في المتوقف حتى يقطر المنفذ المفتوح.أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر. تأكد من دفع قضيب تحريك مضخات المحقنة لأعلى ضد غاطسات المحقنة بحيث يبدأ التدفق على الفور عند بدء تشغيل المضخة. أغلق الموقوف على محلول التتبع وقم بضخ محلول الخلفية في المتوقف حتى يتم طرد جميع حلول التتبع المتبقية من المنفذ المفتوح.أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر. قم بإعداد مكون نظام التدفق المطلوب لتحليل RTD. أدخل الطرف في موزع طرف ماصة ومحلول خلفية المضخة من خلال المكون حتى يتم ملؤه بالكامل.اضبط مضخة محلول التتبع على معدل التدفق المطلوب. أغلق الموقوف إلى حل الخلفية وابدأ تدفق حل التتبع. في الوقت نفسه ، ابدأ جامع الكسور.استمر في تدفق محلول التتبع لفترة قصيرة من الزمن لتقريب إدخال الدافع للمقتفي. يوصى باستخدام مدة نبض تبلغ 10 دقائق ل RTDs بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الساعة. أوقف مضخة محلول التتبع في نهاية فترة نبض محلول التتبع.أغلق السدادة بسرعة إلى حل التتبع وابدأ تدفق محلول الخلفية بنفس معدل التدفق. اسمح لمحلول الخلفية بالتدفق وجمع الكسور حتى يمر كل المقتفي عبر النظام وإلى الكسور التي تم جمعها. في ظل ظروف معقمة ، أدخل السدادات بالإبر في مزارع لوحة البئر مع سحب الإبر.بعد وضع السدادة في مكانها ، اخفض الإبر إلى الارتفاع المطلوب للتروية لأن ارتفاع إبرة المخرج يحدد مستوى السائل المستقر. قم بتغطية الإبر بأغطية لوير ذكورية واحتفظ بلوحة البئر بأكملها في حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. قم بإعداد الوسائطين لاستخدامهما في التروية ، مع وضع علامة على الوسيط الذي سيتم توزيعه أولا على أنه واحد والوسيط الآخر على أنه اثنان.لكي يتم تشغيل كل ثقافة ، املأ حقنة واحدة بحقنة متوسطة لتدوم طوال مدة انتعاشها بالإضافة إلى حجم كاف لملء نظام التروية في البداية. املأ حقنة ثانية بحقنة متوسطة لمدة عامين لتدوم طوال مدة تقاعدها. قم بتوصيل كلا الحقنتين باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات.قد تكون هناك حاجة إلى طول الأنابيب لتوصيل المحاقن ب stopcocks. قم بإعداد السدادات عن طريق إغلاق السدادة لمتوسط واحد وتوزيع اثنين متوسطين في السدادة حتى تبدأ للتو في التنقيط من المنفذ المفتوح. ثم أغلق المودكوك للمتوسط اثنين وقم بتوزيع المتوسط واحد في الموقوف حتى يتم طرد كل الوسط المتبقي من المنفذ المفتوح.قم بتوصيل أنبوب المنبع بمنفذ التوقف المفتوح باستخدام موصل أنثى إلى موصل لواء. أدخل موصل لواء من الذكور إلى القضيب على الطرف الآخر من الأنبوب. قم بتوزيع واحد متوسط من المحقنة حتى يتم ملء أنبوب المنبع بالوسط والمضي قدما في إعداد الأنابيب النهائية كما هو موضح سابقا.أدخل موصل لوير من الذكور إلى اللوح في أحد طرفي الأنابيب النهائية وقم بتغطيته بغطاء لوير أنثوي. أحضر بعناية جميع الأنابيب والمحاقن ولوحة البئر إلى الحاضنة التي سيتم استخدامها للتروية. ضع مضخة المحقنة وجامع الكسر في المواقع المطلوبة بالقرب من الحاضنة.ضع مضخة المحقنة فوق الحاضنة أو بالقرب منها وضع جامع الكسور بجوار الحاضنة بالقرب من الميناء. قم بتحميل المحاقن في المضخة. قم بتجميع الأطراف المغطاة لجميع أنابيب المنبع والمصب معا وادفعها من خارج الحاضنة إلى الداخل من خلال المنفذ.أدخل الأطراف المفتوحة لأنابيب المصب في أطراف ماصة التوزيع الخاصة بموزع مجمع الكسور متعدد الرؤوس. داخل الحاضنة ، اسحب أكبر قدر ممكن من الركود في أنابيب المنبع إلى الحاضنة لزيادة طول الأنابيب التي يمكن من خلالها للوسط المتدفق تلقي الحرارة وثاني أكسيد الكربون. لكل بئر موصول ، قم بفك الغطاء بسرعة الإبر وأنابيب المنبع والمصب لهذا البئر ، ثم قم بتوصيلها مع موصلات luer الخاصة بها.بمجرد توصيل جميع الأجزاء ، قم بتشغيل مضخة المحقنة لفترة وجيزة بسرعة عالية نسبيا لضمان تدفق جميع التيارات بشكل صحيح. في هذه المرحلة ، إذا كان من المرغوب فيه بدء التجربة مع أنابيب المصب المليئة بالوسط ، فاستمر في تشغيل المضخة حتى يتم ملء كل شيء ، وإلا ، أوقف المضخة. اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على متوسط واحد وتواتر جمع الكسور وابدأ تشغيل كلا الجهازين في وقت واحد لبدء التجربة.عندما يحتاج المصدر المتوسط إلى التغيير ، أوقف مضخة المحقنة بسرعة للمصدر المتوسط. أدر السدادة مغلقة إلى متوسطة واحدة وابدأ تشغيل مضخة المحقنة لمتوسطتين. إذا رغبت في ذلك لاحقا ، فقم بتبديل المصدر مرة أخرى إلى مصدر متوسط بالمثل.جمع الكسور لمدة التجربة المطلوبة. تم قياس تركيزات التتبع في الكسور من تجربتين RTD وإدخالها في RTD من نص MATLAB للبيانات لإنتاج RTDs. الأنابيب المفردة وقطع متعددة من الأنابيب في سلسلة تتناسب بشكل جيد مع نموذج تشتت محوري واحد وإضافة لوحة بئر 48 في الخط تسببت في انحراف ضئيل يسمح لكل من RTD أنبوب متر واحد و RTD للنظام بأكمله بالتناسب مع وظائف التشتت المحوري.تم عرض مثال على ملاءمة نموذج ضعيف باستخدام نموذج التشتت المحوري المركب على بيانات RTD لأنبوب متر واحد وتم رسمه جنبا إلى جنب مع البيانات. تم تغيير تخمينات المعلمة الأولية لإنتاج نموذج جيد مناسب حيث كان تاو مساويا تقريبا لحجم نظام التروية مقسوما على معدل التدفق الحجمي. تم تعريف نبضة 90 دقيقة من TNF-alpha على أنها إشارة الإدخال إلى النظام وتم الالتفاف مع أنبوب RTD الذي يبلغ طوله مترا واحدا لتحديد إشارة TNF-alpha عند مدخل لوحة البئر.كما تم الخلط بين إشارة الإدخال وRTD للنظام بأكمله لتحديد إشارة TNF-alpha عند مخرج النظام في الكسور المجمعة. تم تصميم خلايا HEK 293 لإفراز GLuc مدفوعا بمروج يحتوي على عنصر استجابة NF-kappaB. كشفت التجربة عن زيادة كبيرة في التعبير وانخفاض بطيء في تعبير GLuc مدفوعا ب NF-kappaB بعد التعرض ل TNF-alpha.يتم وصف الاختلافات في النظام في الورقة المصاحبة ، بما في ذلك إعداد أبسط للتجارب التي لا تتطلب إدخال إشارات وتعريض الخلايا لملفات تعريف المذاب الضام فارما-هو.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

زرع أنسجة المبيض البشرية مع خلايا بطانية هندسيا المشارك: التعجيل الجمع بين استراتيجية تستند إلى خلية التروية مع التسليم المباشر باراكريني

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

مفاعل حيوي موجه بالتصوير لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

شراء ونزع الخلايا من اللوحات الوعائية الخنازير في مفاعل حيوي مخصص للتروية

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...