Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Denne forskning blev udført med støtte under tilskudsnr. R01EB012521, R01EB028782 og T32 GM008339 fra National Institutes of Health.

1. Forbered dele til brøndpladeperfusion
<ol><li>Forbered slanger<ol>
<li>Skær to længder silikonerør (1,6 mm indvendig diameter) for hver cellekultur, der skal perfunderes. Sørg for, at det stykke, der bruges som opstrømsrør, er langt nok til at nå fra sprøjtepumpen til cellekulturen inde i inkubatoren, og at nedstrømsstykket kan nå fra cellekulturen til den fjerneste udvidede position af fraktionsopsamleren.</li>
		<li>Giv hvert stykke slange en unik etiket på begge ender med mærket tape...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Dette arbejde beskriver samlingen og driften af et perfusionscellekultursystem med flere mediumkilder demonstreret med et specifikt eksempel, hvor dynamikken i NF-κB-drevet genekspression som reaktion på en forbigående puls af TNF-α blev målt. RTD'erne for perfusionssystemkomponenterne blev målt og modelleret, og signalkonvolution blev brugt til at forudsige både cellernes eksponering for TNF-α pulsen og TNF-α fordelingen i de opsamlede spildevandsmediumfraktioner. Cellerne blev udsat for pulsen, og fraktioner b...

Mange vigtige biologiske processer forekommer i celle- og vævskulturer på tidsskalaen minutter til timer 1,2,3. Mens nogle af disse fænomener kan observeres og registreres på en automatiseret måde ved hjælp af time-lapse mikroskopi4, bioluminescens1 eller andre metoder, udføres eksperimenter, der involverer indsamling af kultursupernatantprøver til kemisk analyse, ofte manuelt i statiske cellekulturer. Manuel prøveudtagning begrænser gennemførligheden af visse undersøgelser på grund af ulemperne ved hyppige eller efter-timers prøveudtagningstidspunkter. Yderligere mangler ved statiske dyrkningsmetoder omfatter eksperimenter, der involverer kontrollerede, forbigående eksponeringer for kemiske stimuli. I statiske kulturer skal stimuli tilføjes og fjernes manuelt, og stimulusprofiler er begrænset til trinændringer over tid, mens mellemstore ændringer også tilføjer og fjerner andre mediumkomponenter, som kan påvirke celler på en ukontrolleret måde5. Fluidiske systemer kan overvinde disse udfordringer, men eksisterende enheder udgør andre udfordringer. Mikrofluidiske enheder leveres med de uoverkommelige omkostninger ved specialudstyr og træning til at producere og bruge, kræver mikroanalytiske metoder til at behandle prøver, og celler er vanskelige at genvinde fra enhederne efter perfusion6. Få makrofluidiske systemer er blevet oprettet til de typer eksperimenter, der er beskrevet her 7,8,9,10, og de er bygget af flere brugerdefinerede dele fremstillet internt og kræver flere pumper eller fraktionsopsamlere. Desuden er forfatterne ikke bekendt med andre kommercielt tilgængelige makrofluidiske perfusionscellekultursystemer end omrørte tankbioreaktorer til suspensionskultur, som er nyttige til biofremstilling, men ikke er designet til modellering og undersøgelse af fysiologi.
Forfatterne har tidligere rapporteret om designet af et billigt perfusionsbioreaktorsystem, der næsten udelukkende består af kommercielt tilgængelige dele11. Basisversionen af systemet gør det muligt at opbevare flere kulturer i en brøndplade i en CO2 -inkubator og kontinuerligt perfunderes med medium fra en sprøjtepumpe, mens spildevandsmediet strømme fra kulturerne automatisk fraktioneres i prøver over tid ved hjælp af en fraktionsopsamler med en brugerdefineret modifikation. Dette system muliggør således automatiseret prøveudtagning af kulturmedium supernatant og kontinuerlig opløst stof input til kulturerne over tid. Systemet er makrofluidisk og modulært og kan let ændres for at imødekomme behovene i nye eksperimentdesign.
Det overordnede mål med den metode, der præsenteres her, er at konstruere, karakterisere og anvende et perfusionscellekultursystem, der muliggør eksperimenter, hvor cellernes sekretion eller absorptionshastigheder af stoffer over tid måles, og / eller celler udsættes for præcise, forbigående opløste signaler. Denne videoartikel forklarer, hvordan man samler basisopsætningen, som er i stand til at gennemsyre op til seks cellekulturer samtidigt ved hjælp af en enkelt sprøjtepumpe og modificeret fraktionsopsamler. To nyttige varianter af basissystemet, der gør brug af yderligere pumper og dele for at muliggøre forsøg, der udsætter celler for forbigående koncentrationssignaler fra opløst stof, herunder korte impulser og farmakokinetiske profiler12, præsenteres også, vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figur 1: Tre variationer af perfusionssystemets design. (Øverst) Det grundlæggende perfusionssystem. (I midten) Perfusionssystemet med en stophane til flere mellemstore kilder. (Nederst) Perfusionssystemet med en omrørt tank for at efterligne et godt blandet fordelingsvolumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
På grund af spredning og diffusion i strømmen bliver de opløste signaler forvrænget eller "smurt", når de bevæger sig gennem strømningssystemet. Denne fordrejning kan kvantificeres ved hjælp af opholdstidsfordelinger (FTU)13. Denne artikel forklarer, hvordan man udfører sporingseksperimenter på komponenter i perfusionssystemet (figur 2), og indeholder MATLAB-scripts til at generere RTD'er fra målte data. En detaljeret forklaring på denne analyse findes i forfatternes tidligere artikel11. Yderligere MATLAB-scripts passer passende funktioner til RTD'erne og udtrækker fysiske parametre og udfører signalkonvolution ved hjælp af RTD'er for at forudsige, hvordan brugerens input af opløst stofsignal vil formere sig og forvrænge gennem perfusionssystemet14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figur 2: Fordeling af opholdstid. RTD'erne for flowsystemkomponenter, såsom denne slangelængde, måles ved at indtaste en puls af sporstof til systemet og måle, hvordan det "udtværes", når det kommer ud i de opsamlede fraktioner. Dette tal er blevet ændret fra Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Visse celle- og vævsfunktioner fungerer inden for den dynamiske tidsskala på minutter til timer, der er dårligt løst af konventionelle kultursystemer. Dette arbejde har udviklet et billigt perfusionsbioreaktorsystem, der gør det muligt for kulturmedium kontinuerligt at blive perfunderet i et cellekulturmodul og fraktioneret i et downstream-modul for at måle dynamik på denne skala. Systemet er konstrueret næsten udelukkende fra kommercielt tilgængelige dele og kan paralleliseres til at udføre uafhængige eksperimenter i konventionelle multi-well cellekulturplader samtidigt. Denne videoartikel demonstrerer, hvordan man monterer basisopsætningen, som kun kræver en enkelt multikanals sprøjtepumpe og en modificeret fraktionsopsamler for at gennemskue op til seks kulturer parallelt. Nyttige varianter på det modulære design præsenteres også, der giver mulighed for kontrolleret stimuleringsdynamik, såsom opløste impulser eller farmakokinetiske profiler. Det er vigtigt, at når opløste signaler bevæger sig gennem systemet, forvrænges de på grund af opløst dispersion. Desuden beskrives en metode til måling af opholdstidsfordelingerne (RTD'er) for komponenterne i perfusionsopsætningen med et sporstof ved hjælp af MATLAB. RTD'er er nyttige til at beregne, hvordan opløste signaler forvrænges af strømmen i multirumssystemet. Dette system er meget robust og reproducerbart, så grundlæggende forskere nemt kan vedtage det uden behov for specialiserede fabrikationsfaciliteter.

Perfusionssystemet med flere mediumkilder fra afsnit 5 i protokollen blev brugt til at måle ekspressionsdynamikken i et reportergen drevet af den nukleare faktor kappa-lyskædeforstærker af aktiverede B-celler (NF-κB) transkriptionsfaktor i human embryonale nyre 293 (HEK293) celler som reaktion på en 1,5 timers puls af tumornekrosefaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler blev stabilt transduceret ved hjælp af lentivirale vektorer med en genkonstruktion indeholdende Gaussia luciferase (GLuc), drevet af en promotor kaldet ...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Dette papir præsenterer en metode til at konstruere og drive et billigt, multikanals perfusionscellekultursystem til måling af dynamikken i sekretion og absorptionshastigheder for opløste stoffer i cellulære processer. Systemet kan også udsætte celler for dynamiske stimulusprofiler.

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integreret med Udløbsfraktionering til dynamisk cellekultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Denne metode hjælper med at forstå, hvordan sekretionshastigheder ændrer sig med tiden, og hvordan celler reagerer på tidsvarierende faste signaler. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at dens lave omkostninger kræver lidt træning, og overflodssystemets opsætning kan tilpasses til nye eksperimenter. Begynd med at fylde en sprøjte med en baggrundsopløsning og læg den i den første sprøjtepumpe.Fyld en anden sprøjte med sporstofopløsning og læg den i den anden sprøjtepumpe. Tilslut begge sprøjter til to af de tre porte på en firevejs stophane ved hjælp af luer-stik. Luk stophanen til baggrundsopløsningen, og pump sporstofopløsningen ind i stophanen, indtil den drypper ud af den åbne port.Stop pumpen, og juster ikke sprøjten yderligere. Sørg for, at sprøjtepumpernes bevægelsesstang skubbes op mod sprøjtestemplerne, så strømmen begynder straks, når pumpen startes. Luk stophanen til sporstofopløsningen, og pump baggrundsopløsningen ind i stophanen, indtil al resterende sporstofopløsning er skyllet ud af den åbne port.Stop pumpen, og juster ikke sprøjten yderligere. Konfigurer den ønskede flowsystemkomponent til FTU-analyse. Indsæt enden i en pipettespidsdispenser og pump baggrundsopløsning gennem komponenten, indtil den er helt fyldt.Indstil pumpen til sporstofopløsningen til den ønskede strømningshastighed. Luk stophanen til baggrundsopløsningen, og start strømmen af sporstofopløsningen. På samme tid skal du starte fraktionsopsamleren.Fortsæt strømmen af sporstofopløsning i en kort periode for at tilnærme en impulsindgang af sporstoffet. En pulsvarighed på 10 minutter anbefales til RTD'er med en strømningshastighed på en milliliter i timen. Stop sporstofopløsningspumpen i slutningen af sporstofopløsningens pulsperiode.Luk hurtigt stophanen til sporstofopløsningen, og start strømmen af baggrundsopløsningen med samme strømningshastighed. Lad baggrundsopløsningen flyde og opsamle fraktioner, indtil hele sporstoffet har passeret gennem systemet og ind i de opsamlede fraktioner. Under sterile forhold indsættes propperne med nåle i brøndpladekulturerne med nålene trukket op.Når proppen er på plads, sænkes nålene til den ønskede højde for perfusion, da udløbsnålens højde bestemmer det stabile væskeniveau. Dæk nålene med mandlige luerhætter, og opbevar hele brøndpladen i en inkubator indstillet til 37 grader Celsius indtil brug. Forbered de to medier, der skal bruges til perfusion, og mærk det medium, der først udleveres som det ene og det andet medium to.For hver kultur, der skal perfunderes, skal du fylde en sprøjte med medium en for at vare hele varigheden af dens dispensering plus tilstrækkeligt volumen til oprindeligt at fylde perfusionssystemet. Fyld en anden sprøjte med medium to for at vare hele varigheden af dispenseringen. Tilslut begge sprøjter til to af de tre porte på en firevejs stophane.En slangelængde for at forbinde sprøjterne til stophanerne kan være påkrævet. Forbered stophanerne ved at lukke stophanen for medium en og dispensere medium to i stophanen, indtil den bare begynder at dryppe ud af den åbne port. Luk derefter stophanen for medium to og fordel medium en i stophanen, indtil alle resterende mellemstore to er skyllet ud af den åbne port.Fastgør opstrømsrøret til den åbne stophaneport ved hjælp af et hun til modhage luer-stik. Indsæt et han til barb luer-stik i den anden ende af røret. Dispenser medium et fra sprøjten, indtil opstrømsrøret er fyldt med medium, og fortsæt med fremstillingen af nedstrømsrør som vist tidligere.Indsæt et han til modhage luer-stik i den ene ende af nedstrømsrøret, og dæk det med en hunluerhætte. Bring forsigtigt alle forberedte slanger, sprøjter og brøndpladen til inkubatoren, der skal bruges til perfusion. Placer sprøjtepumpen og fraktionsopsamleren på de ønskede steder i nærheden af inkubatoren.Placer sprøjtepumpen oven på eller i nærheden af inkubatoren og placer fraktionsopsamleren ved siden af inkubatoren nær porten. Læg sprøjterne i pumpen. Bundt de afdækkede ender af alle opstrøms og nedstrøms rør sammen, og skub dem fra ydersiden af inkubatoren til indersiden gennem porten.Indsæt de åbne ender af nedstrømsrørene i dispenseringspipettespidserne på fraktionsopsamlerens flerhoveddispenser. Inde i inkubatoren skal du trække så meget slap af opstrømsrørene som muligt ind i inkubatoren for at maksimere længden af rør, hvorigennem det flydende medium kan modtage varme og kuldioxid. For hver tilsluttet brønd skal du hurtigt fjerne nålene og opstrøms og nedstrøms rørene for den brønd og derefter fastgøre dem sammen med deres luer-stik.Når alle dele er tilsluttet, skal du kortvarigt køre sprøjtepumpen med en relativt høj hastighed for at sikre, at alle strømme flyder korrekt. På dette tidspunkt, hvis det ønskes at starte eksperimentet med nedstrømsrørene fulde af mediet, skal du fortsætte med at køre pumpen, indtil alle er fyldt, ellers stop pumpen. Indstil sprøjtepumpens strømningshastighed for medium et og frekvensen af fraktionsopsamling, og start begge maskiner samtidigt for at starte eksperimentet.Når mediumkilden skal udskiftes, skal du hurtigt stoppe sprøjtepumpen for medium en. Drej stophanen lukket til medium en, og start sprøjtepumpen til medium to. Hvis det ønskes senere, skal du skifte kilden tilbage til medium en på samme måde.Saml fraktioner i den ønskede eksperimentvarighed. Sporstofkoncentrationerne i fraktionerne fra to RTD-eksperimenter blev målt og input til RTD fra data MATLAB-script for at producere de to RTD'er. Enkeltrør og flere stykker rør i serie passer godt ved en enkelt aksial dispersionsmodel, og tilføjelse af en perfunderet 48 brøndplade i linjen forårsagede ubetydelig afvigelse, der gjorde det muligt for både et meter rør RTD og hele systemets RTD at passe ved aksiale dispersionsfunktioner.Et eksempel på en dårlig modeltilpasning blev demonstreret ved hjælp af den aksiale dispersionsmodel, der var monteret på RTD-data for et meter rør, og blev plottet sammen med dataene. De oprindelige parametergæt blev ændret for at producere en god modeltilpasning, hvor tau var omtrent lig med perfusionssystemets volumen divideret med dets volumetriske strømningshastighed. En 90 minutters puls af TNF-alfa blev defineret som indgangssignalet til systemet og blev sammenblandet med en meter slange RTD for at bestemme TNF-alfa-signalet ved brøndpladeindløbet.Indgangssignalet blev også konvolveret med RTD for hele systemet for at bestemme TNF-alfa-signalet ved systemets udløb i de opsamlede fraktioner. HEK 293-celler blev konstrueret til at udskille GLuc drevet af en promotor indeholdende NF-kappaB-responselementet. Eksperimentet afslørede en signifikant ekspressionsforøgelse og et langsomt fald i GLuc-ekspression drevet af NF-kappaB efter TNF-alfa-eksponering.Variationer af systemet er beskrevet i ledsagende papir, herunder en enklere opsætning til eksperimenter, der ikke kræver indtastning af signaler og eksponering af celler for pharma-hu bindevævsprofiler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregering og bioreaktor Modning til Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Co transplantation af menneskelige æggestokkene væv med manipuleret endotelceller: en celle-baseret strategi kombinere accelereret Perfusion med direkte Paracrine levering

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Opførelse af et flerlaget mesenkymale stamceller ark med en 3D dynamisk kultur System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

En Microfluidic platform til stimulering af chondrocytter med dynamisk kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Trækkraft mikroskopi integreret med Microfluidics til kemo-aktisk kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Billeddirigeret bioreaktor til generering af biomanirigeret luftvejsvæv

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Indkøb og perfusion-decellularisering af svin vaskulariserede klapper i en tilpasset perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Indkøb og decellularisering af rottebagben ved hjælp af en ex vivo perfusionsbaseret bioreaktor til vaskulariseret sammensat allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...