Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Dit onderzoek is uitgevoerd met steun onder Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 en T32 GM008339 van de National Institutes of Health.

1. Bereid onderdelen voor op de perfusie van de putplaat
<ol><li>Buizen voorbereiden<ol>
<li>Snijd twee lengtes siliconen slang (1,6 mm binnendiameter) voor elke celcultuur die moet worden doordrenkt. Zorg ervoor dat het stuk dat als stroomopwaartse buis wordt gebruikt lang genoeg is om van de spuitpomp naar de celcultuur in de incubator te reiken en dat het stroomafwaartse stuk van de celcultuur naar de verste verlengde positie van de fractiecollector kan reiken.</li>
		<li>Geef elk stuk buis een unie...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Dit werk beschrijft de assemblage en werking van een perfusiecelkweeksysteem met meerdere mediumbronnen aangetoond met een specifiek voorbeeld waarin de dynamiek van NF-κB-gedreven genexpressie als reactie op een voorbijgaande puls van TNF-α werd gemeten. De RTD's van de componenten van het perfusiesysteem werden gemeten en gemodelleerd, en signaalconvolutie werd gebruikt om zowel de blootstelling van de cellen aan de TNF-α-puls als de TNF-α-verdeling in de verzamelde effluentmediumfracties te voorspellen. De cellen ...

Veel belangrijke biologische processen vinden plaats in cel- en weefselculturen op de tijdschaal van minuten tot uren 1,2,3. Hoewel sommige van deze verschijnselen op een geautomatiseerde manier kunnen worden waargenomen en vastgelegd met behulp van time-lapse microscopie4, bioluminescentie1 of andere methoden, worden experimenten met het verzamelen van cultuursupernatantmonsters voor chemische analyse vaak handmatig uitgevoerd in statische celculturen. Handmatige bemonstering beperkt de haalbaarheid van bepaalde onderzoeken vanwege het ongemak van frequente of na sluitingstijdstips. Verdere tekortkomingen van statische kweekmethoden omvatten experimenten met gecontroleerde, voorbijgaande blootstelling aan chemische stimuli. In statische culturen moeten stimuli handmatig worden toegevoegd en verwijderd, en stimulusprofielen zijn beperkt tot stapsgewijze veranderingen in de loop van de tijd, terwijl mediumveranderingen ook andere mediumcomponenten toevoegen en verwijderen, die cellen op een ongecontroleerde manier kunnen beïnvloeden5. Fluidic-systemen kunnen deze uitdagingen overwinnen, maar bestaande apparaten stellen andere uitdagingen. Microfluïdische apparaten komen met de onbetaalbare kosten van gespecialiseerde apparatuur en training om te produceren en te gebruiken, vereisen microanalytische methoden om monsters te verwerken en cellen zijn moeilijk te herstellen van de apparaten na perfusie6. Er zijn weinig macrofluïdische systemen gemaakt voor de soorten experimenten die hier worden beschreven 7,8,9,10, en ze zijn gebouwd van meerdere aangepaste onderdelen die in eigen huis zijn gemaakt en vereisen meerdere pompen of fractiecollectoren. Bovendien zijn de auteurs niet op de hoogte van commercieel verkrijgbare macrofluïdische perfusiecelkweeksystemen anders dan geroerde tankbioreactoren voor suspensiecultuur, die nuttig zijn voor biomanufacturing, maar niet zijn ontworpen voor het modelleren en bestuderen van fysiologie.
De auteurs rapporteerden eerder over het ontwerp van een goedkoop perfusiebioreactorsysteem dat bijna volledig bestaat uit in de handel verkrijgbare delen11. De basisversie van het systeem maakt het mogelijk om meerdere culturen in een putplaat in een CO2-incubator te bewaren en continu te doordrenken met medium van een spuitpomp, terwijl de effluentmediumstromen uit de culturen in de loop van de tijd automatisch in monsters worden gefractioneerd met behulp van een fractiecollector met een aangepaste modificatie. Dit systeem maakt dus geautomatiseerde bemonstering van kweekmedium supernatant en continue opgeloste input naar de culturen in de loop van de tijd mogelijk. Het systeem is macrofluïdisch en modulair en kan eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van nieuwe experimentontwerpen.
Het algemene doel van de hier gepresenteerde methode is om een perfusiecelkweeksysteem te construeren, karakteriseren en gebruiken dat experimenten mogelijk maakt waarbij de secretie- of absorptiesnelheden van stoffen door cellen in de loop van de tijd worden gemeten en / of cellen worden blootgesteld aan nauwkeurige, voorbijgaande opgeloste signalen. In dit videoartikel wordt uitgelegd hoe u de basisopstelling samenstelt, die in staat is om tot zes celculturen tegelijkertijd te perfuseren met behulp van een enkele spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector. Twee nuttige varianten op het basissysteem die gebruik maken van extra pompen en onderdelen om experimenten mogelijk te maken die cellen blootstellen aan voorbijgaande opgeloste concentratiesignalen, waaronder korte pulsen en farmacokinetisch-achtige profielen12, worden ook gepresenteerd, weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figuur 1: Drie variaties op het ontwerp van het perfusiesysteem. (Boven) Het basisperfusiesysteem. (Midden) Het perfusiesysteem met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen. (Onder) Het perfusiesysteem met een geroerde tank om een goed gemengd distributievolume na te bootsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Door dispersie en diffusie binnen de stroming worden de opgeloste signalen vervormd of "besmeurd" terwijl ze door het stromingssysteem reizen. Deze vervorming kan worden gekwantificeerd door het gebruik van verblijftijdverdelingen (OTO's)13. In dit artikel wordt uitgelegd hoe tracerexperimenten kunnen worden uitgevoerd op onderdelen van het perfusiesysteem (afbeelding 2) en worden MATLAB-scripts gebruikt om RTD's te genereren op basis van gemeten gegevens. Een gedetailleerde uitleg van deze analyse is te vinden in het vorige artikel11 van de auteurs. Aanvullende MATLAB-scripts passen geschikte functies toe aan de RTD's en extraheren fysieke parameters, en voeren signaalconvolutie uit met behulp van RTD's om te voorspellen hoe opgeloste signaalinvoer door de gebruiker zich zal verspreiden en vervormen door het perfusiesysteem14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figuur 2: Verblijftijdverdelingen. De RTD's van componenten van het stromingssysteem, zoals deze lengte van de buizen, worden gemeten door een puls tracer in het systeem in te voeren en te meten hoe het "uitstrijkt" tegen de tijd dat het de verzamelde fracties verlaat. Dit cijfer is aangepast van Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Bepaalde cel- en weefselfuncties werken binnen de dynamische tijdschaal van minuten tot uren die slecht worden opgelost door conventionele kweeksystemen. Dit werk heeft een goedkoop perfusiebioreactorsysteem ontwikkeld waarmee kweekmedium continu kan worden doordrenkt in een celkweekmodule en gefractioneerd in een downstream-module om de dynamiek op deze schaal te meten. Het systeem is bijna volledig opgebouwd uit in de handel verkrijgbare onderdelen en kan worden geparallelliseerd om tegelijkertijd onafhankelijke experimenten uit te voeren in conventionele multi-well celkweekplaten. Dit videoartikel demonstreert hoe de basisopstelling moet worden samengesteld, waarvoor slechts een enkele meerkanaals spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector nodig zijn om tot zes culturen parallel te laten doordringen. Er worden ook nuttige varianten op het modulaire ontwerp gepresenteerd die een gecontroleerde stimulatiedynamiek mogelijk maken, zoals opgeloste pulsen of farmacokinetisch-achtige profielen. Belangrijk is dat als opgeloste signalen door het systeem reizen, ze worden vervormd als gevolg van opgeloste dispersie. Verder wordt een methode beschreven voor het meten van de verblijftijdverdelingen (RTD's) van de componenten van de perfusieopstelling met behulp van MATLAB. RTD's zijn nuttig om te berekenen hoe opgeloste signalen worden vervormd door de stroom in het systeem met meerdere compartimenten. Dit systeem is zeer robuust en reproduceerbaar, zodat basisonderzoekers het gemakkelijk kunnen gebruiken zonder dat er gespecialiseerde fabricagefaciliteiten nodig zijn.

Het perfusiesysteem met meerdere mediumbronnen uit sectie 5 van het protocol werd gebruikt om de expressiedynamiek te meten van een reportergen aangedreven door de nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) transcriptiefactor in menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen in reactie op een 1,5 h puls van tumornecrosefactor alfa (TNF-α). HEK293-cellen werden stabiel getransduceerd met behulp van lentivirale vectoren met een genconstruct dat Gaussia luciferase (GLuc) bevat, aangedrev...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Dit artikel presenteert een methode om een goedkoop, meerkanaals perfusiecelkweeksysteem te construeren en te gebruiken voor het meten van de dynamiek van secretie en absorptiesnelheden van opgeloste stoffen in cellulaire processen. Het systeem kan cellen ook blootstellen aan dynamische stimulusprofielen.

Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Deze methode helpt te begrijpen hoe secretiesnelheden met de tijd veranderen en hoe cellen reageren op tijd variërende vaste signalen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de lage kosten weinig training vereisen en de opstelling van het profusiesysteem kan worden aangepast voor nieuwe experimenten. Begin met het vullen van een spuit met een achtergrondoplossing en laad deze in de eerste spuitpomp.Vul een andere spuit met traceroplossing en laad deze in de tweede spuitpomp. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan met behulp van luerconnectoren. Sluit de stopkraan op de achtergrondoplossing en pomp de traceroplossing in de stopkraan totdat deze uit de open poort druppelt.Stop de pomp en stel de spuit niet verder af. Zorg ervoor dat de bewegende staaf van de spuitpompen tegen de zuigers van de spuit wordt geduwd, zodat de stroom onmiddellijk begint wanneer de pomp wordt gestart. Sluit de stopkraan bij de traceroplossing en pomp de achtergrondoplossing in de stopkraan totdat alle resterende traceroplossing uit de open poort is gespoeld.Stop de pomp en stel de spuit niet verder af. Stel de gewenste stroomsysteemcomponent in voor RTD-analyse. Steek het uiteinde in een pipetpuntdispenser en pomp de achtergrondoplossing door het onderdeel totdat het volledig is gevuld.Stel de pomp voor de traceroplossing in op het gewenste debiet. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en start de stroom van de traceroplossing. Start tegelijkertijd de breukcollector.Ga gedurende een korte periode door met de stroom van de traceroplossing om een impulsinvoer van de tracer te benaderen. Een pulsduur van 10 minuten wordt aanbevolen voor RTD's met een stroomsnelheid van één milliliter per uur. Stop de traceroplossingspomp aan het einde van de traceroplossingspulsperiode.Sluit de stopkraan snel bij de traceroplossing en start de stroom van de achtergrondoplossing met hetzelfde debiet. Laat de achtergrondoplossing stromen en verzamel fracties totdat alle tracer door het systeem en in de verzamelde fracties is gegaan. Onder steriele omstandigheden steekt u de stoppen met naalden in de putplaatculturen met de naalden omhoog getrokken.Nadat de stop op zijn plaats is, verlaagt u de naalden tot de gewenste hoogte voor perfusie, omdat de hoogte van de uitlaatnaald het stabiele vloeistofniveau bepaalt. Sluit de naalden af met mannelijke luierdoppen en bewaar de hele putplaat in een couveuse op 37 graden Celsius tot gebruik. Bereid de twee media voor die voor perfusie moeten worden gebruikt en label het medium dat als eerste zal worden verstrekt als één en het andere medium twee.Voor elke cultuur die moet worden toegediend, vult u één spuit met medium één om de hele duur van het dispensatie plus voldoende volume te duren om in eerste instantie het perfusiesysteem te vullen. Vul een tweede spuit met medium twee om de hele duur van de dispensie te duren. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan.Een lengte van de slang om de spuiten op de stopkranen aan te sluiten, kan nodig zijn. Bereid de stopkranen voor door de stopkraan te sluiten voor medium één en medium twee in de stopkraan te doseren totdat deze net uit de open poort begint te druppelen. Sluit vervolgens de stopkraan voor medium twee en doseer medium één in de stopkraan totdat alle resterende medium twee uit de open poort is gespoeld.Bevestig de stroomopwaartse buis aan de open stopkraanpoort met behulp van een female to barb luer connector. Plaats een mannetje om de luerconnector aan het andere uiteinde van de buis te weerhakken. Doseer medium één uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis is gevuld met medium en ga verder met de bereiding van stroomafwaartse slangen zoals eerder gedemonstreerd.Steek een mannetje om luer connector te weerhakken in het ene uiteinde van de stroomafwaartse buis en sluit het af met een vrouwelijke luer cap. Breng zorgvuldig alle voorbereide slangen, spuiten en de putplaat naar de incubator die zal worden gebruikt voor perfusie. Plaats de spuitpomp en fractiecollector op de gewenste plaatsen in de buurt van de incubator.Plaats de spuitpomp bovenop of in de buurt van de incubator en plaats de fractiecollector naast de incubator in de buurt van de poort. Plaats de spuiten in de pomp. Bundel de afgedekte uiteinden van alle stroomopwaartse en stroomafwaartse buizen en duw ze van de buitenkant van de incubator naar binnen door de poort.Steek de open uiteinden van de stroomafwaartse buizen in de pipetpunten van de multikopdispenser van de fractiecollector. Trek in de incubator zoveel mogelijk speling van de stroomopwaartse buizen in de incubator om de lengte van de buizen te maximaliseren waardoor het stromende medium warmte en koolstofdioxide kan ontvangen. Voor elke aangesloten put, maak snel de naalden en de upstream- en downstream-buizen voor die put los en bevestig ze vervolgens aan elkaar met hun luerconnectoren.Zodra alle onderdelen zijn aangesloten, laat u de spuitpomp kort op een relatief hoge snelheid draaien om ervoor te zorgen dat alle stromen goed stromen. Op dit punt, als het gewenst is om het experiment te beginnen met de stroomafwaartse buizen vol met het medium, blijf de pomp draaien totdat ze allemaal zijn gevuld, anders stop je de pomp. Stel het pompdebiet van de spuit in voor medium één en de frequentie van het verzamelen van breuken en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten.Wanneer de mediumbron moet worden vervangen, stopt u snel de spuitpomp voor medium één. Draai de stopkraan dicht op medium één en start de spuitpomp voor medium twee. Schakel later desgewenst de bron op dezelfde manier terug naar medium één.Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur. De tracerconcentraties in de fracties van twee OTO-experimenten werden gemeten en ingevoerd in de RTD op basis van het MATLAB-gegevensscript om de twee RTD's te produceren. Enkele buizen en meerdere stukken buizen in serie passen goed bij een enkel axiale dispersiemodel en het toevoegen van een doordrenkte 48 putplaat in lijn veroorzaakte een verwaarloosbare afwijking waardoor zowel de rtd van één meter buis als de RTD van het hele systeem passen door axiale dispersiefuncties.Een voorbeeld van een slechte modelfitting werd aangetoond met behulp van het axiale dispersiemodel dat was gemonteerd op de RTD-gegevens van de één meter buis en werd naast de gegevens uitgezet. De initiële parameterschattingen werden gewijzigd om een goede modelfit te produceren waarbij tau ongeveer gelijk was aan het volume van het perfusiesysteem gedeeld door het volumetrische debiet. Een puls van 90 minuten van TNF-alfa werd gedefinieerd als het ingangssignaal naar het systeem en werd samengevoegd met de één meter buis RTD om het TNF-alfasignaal bij de inlaat van de putplaat te bepalen.Het ingangssignaal werd ook samengevoegd met de RTD van het hele systeem om het TNF-alfasignaal aan de uitgang van het systeem in de verzamelde fracties te bepalen. HEK 293-cellen werden ontworpen om GLuc af te scheiden, aangedreven door een promotor die het NF-kappaB-responselement bevat. Het experiment onthulde een significante toename van expressie en langzame afname van GLuc-expressie aangedreven door NF-kappaB na blootstelling aan TNF-alfa.Variaties van het systeem worden beschreven in het begeleidende artikel, inclusief een eenvoudigere opstelling voor experimenten waarvoor geen invoersignalen nodig zijn en cellen worden blootgesteld aan farmaceutische verbindingsprofielen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen: een combinatie van cel-gebaseerde strategie versneld perfusie met directe Paracrine levering

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...