Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
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Cette recherche a été menée avec le soutien de Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 et T32 GM008339 des National Institutes of Health.

1. Préparer les pièces pour la perfusion de la plaque de puits
<ol><li>Préparer les tubes<ol>
<li>Couper deux longueurs de tube en silicone (1,6 mm de diamètre intérieur) pour chaque culture cellulaire à perfuser. Assurez-vous que la pièce utilisée comme tube en amont est suffisamment longue pour atteindre la pompe à seringue à la culture cellulaire à l’intérieur de l’incubateur, et que la pièce en aval peut atteindre de la culture cellulaire à la position la plus étendue du collecte...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Ce travail décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système de culture cellulaire par perfusion avec de multiples sources de milieu démontré avec un exemple spécifique dans lequel la dynamique de l’expression génique induite par NF-κB en réponse à une impulsion transitoire de TNF-α a été mesurée. Les RTD des composants du système de perfusion ont été mesurées et modélisées, et la convolution du signal a été utilisée pour prédire à la fois l’exposition des cellules à l’impulsion α ...

De nombreux processus biologiques importants se produisent dans les cultures cellulaires et tissulaires sur une échelle de minutes àquelques heures 1,2,3. Bien que certains de ces phénomènes puissent être observés et enregistrés de manière automatisée à l’aide de la microscopie time-lapse4, de la bioluminescence1 ou d’autres méthodes, les expériences impliquant la collecte d’échantillons de surnageants de culture pour analyse chimique sont souvent effectuées manuellement dans des cultures cellulaires statiques. L’échantillonnage manuel limite la faisabilité de certaines études en raison des inconvénients des points de temps d’échantillonnage fréquents ou après les heures d’ouverture. D’autres lacunes des méthodes de culture statique comprennent des expériences impliquant des expositions contrôlées et transitoires à des stimuli chimiques. Dans les cultures statiques, les stimuli doivent être ajoutés et supprimés manuellement, et les profils de stimulus sont limités aux changements d’étape au fil du temps, tandis que les changements de milieu ajoutent et suppriment également d’autres composants du milieu, ce qui peut affecter les cellules de manière incontrôlée5. Les systèmes fluidiques peuvent surmonter ces défis, mais les dispositifs existants posent d’autres défis. Les dispositifs microfluidiques s’accompagnent des coûts prohibitifs de l’équipement spécialisé et de la formation à la production et à l’utilisation, nécessitent des méthodes microanalytiques pour traiter les échantillons et les cellules sont difficiles à récupérer des dispositifs après perfusion6. Peu de systèmes macrofluidiques ont été créés pour les types d’expériences décrits ici 7,8,9,10, et ils sont construits à partir de plusieurs pièces personnalisées fabriquées en interne et nécessitent plusieurs pompes ou collecteurs de fractions. En outre, les auteurs n’ont connaissance d’aucun système de culture cellulaire de perfusion macrofluidique disponible dans le commerce autre que les bioréacteurs à réservoir agité pour la culture en suspension, qui sont utiles pour la biofabrication, bien qu’ils ne soient pas conçus pour la modélisation et l’étude de la physiologie.
Les auteurs ont déjà fait état de la conception d’un système de bioréacteur de perfusion à faible coût composé presque entièrement de pièces11 disponibles dans le commerce. La version de base du système permet de conserver plusieurs cultures dans une plaque de puits dans un incubateur à CO2 et de les perfuser en continu avec du milieu provenant d’une pompe à seringue, tandis que les flux de milieu d’effluent des cultures sont automatiquement fractionnés en échantillons au fil du temps à l’aide d’un collecteur de fractions avec une modification personnalisée. Ainsi, ce système permet l’échantillonnage automatisé du milieu de culture surnageant et l’entrée continue de soluté dans les cultures au fil du temps. Le système est macrofluidique et modulaire et peut être facilement modifié pour répondre aux besoins de nouvelles conceptions d’expériences.
L’objectif global de la méthode présentée ici est de construire, de caractériser et d’utiliser un système de culture cellulaire par perfusion qui permet des expériences dans lesquelles les taux de sécrétion ou d’absorption de substances par les cellules au fil du temps sont mesurés et / ou les cellules sont exposées à des signaux de soluté précis et transitoires. Cet article vidéo explique comment assembler la configuration de base, qui est capable de perfuser jusqu’à six cultures cellulaires simultanément à l’aide d’une seule pompe à seringue et d’un collecteur de fraction modifié. Deux variantes utiles du système de base qui utilisent des pompes et des pièces supplémentaires pour permettre des expériences qui exposent les cellules à des signaux de concentration transitoires de soluté, y compris de brèves impulsions et des profils pharmacocinétiques12, sont également présentées, illustrées à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figure 1: Trois variantes de la conception du système de perfusion. (En haut) Le système de perfusion de base. (Au milieu) Le système de perfusion avec un robinet d’arrêt pour plusieurs sources de milieu. (En bas) Le système de perfusion avec un réservoir agité pour imiter un volume de distribution bien mélangé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
En raison de la dispersion et de la diffusion dans le flux, les signaux de soluté se déforment ou « s’enduire » lorsqu’ils se déplacent dans le système d’écoulement. Cette distorsion peut être quantifiée par l’utilisation de distributions de temps de séjour (RDT)13. Cet article explique comment effectuer des expériences de traçage sur des composants du système de perfusion (Figure 2) et fournit des scripts MATLAB pour générer des RTD à partir de données mesurées. Une explication détaillée de cette analyse peut être trouvée dans l’article précédent des auteurs11. Des scripts MATLAB supplémentaires adaptent les fonctions appropriées aux RTD et extraient les paramètres physiques, et effectuent la convolution du signal à l’aide de RTD pour prédire comment l’entrée du signal de soluté par l’utilisateur se propagera et se déformera à travers le système de perfusion14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figure 2 : Distributions du temps de résidence. Les RTD des composants du système d’écoulement, tels que cette longueur de tuyau, sont mesurés en entrant une impulsion de traceur dans le système et en mesurant comment il « frottis » au moment où il sort dans les fractions collectées. Ce chiffre a été modifié à partir d’Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Certaines fonctions cellulaires et tissulaires fonctionnent dans un délai dynamique de quelques minutes à quelques heures qui sont mal résolues par les systèmes de culture conventionnels. Ce travail a permis de développer un système de bioréacteur de perfusion à faible coût qui permet de perfuser continuellement le milieu de culture dans un module de culture cellulaire et de fractionner dans un module en aval pour mesurer la dynamique à cette échelle. Le système est construit presque entièrement à partir de pièces disponibles dans le commerce et peut être parallélisé pour mener simultanément des expériences indépendantes dans des plaques de culture cellulaire conventionnelles multi-puits. Cet article vidéo montre comment assembler la configuration de base, qui ne nécessite qu’une seule pompe à seringue multicanal et un collecteur de fraction modifié pour perfuser jusqu’à six cultures en parallèle. Des variantes utiles de la conception modulaire sont également présentées qui permettent une dynamique de stimulation contrôlée, telle que des impulsions de soluté ou des profils de type pharmacocinétique. Il est important de noter que lorsque les signaux de soluté traversent le système, ils sont déformés en raison de la dispersion des solutés. En outre, une méthode de mesure des distributions de temps de séjour (RTD) des composants de la configuration de perfusion avec un traceur utilisant MATLAB est décrite. Les RTD sont utiles pour calculer comment les signaux de soluté sont déformés par le flux dans le système à compartiments multiples. Ce système est très robuste et reproductible, de sorte que les chercheurs de base peuvent facilement l’adopter sans avoir besoin d’installations de fabrication spécialisées.

Le système de perfusion avec plusieurs sources de milieu de la section 5 du protocole a été utilisé pour mesurer la dynamique d’expression d’un gène rapporteur piloté par le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) transcription factor in human embryonic kidney 293 (HEK293) cells en réponse à une impulsion de 1,5 h de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Les cellules HEK293 ont été transduites de manière stable à l’aide de vecteurs lentiviraux avec une construc...

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Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Cet article présente une méthode pour construire et exploiter un système de culture cellulaire de perfusion multicanal à faible coût pour mesurer la dynamique des taux de sécrétion et d’absorption des solutés dans les processus cellulaires. Le système peut également exposer les cellules à des profils de stimulus dynamiques.

Bioréacteur de perfusion multi-flux intégré au fractionnement de sortie pour la culture cellulaire dynamique

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Cette méthode permet de comprendre comment les taux de sécrétion changent avec le temps et comment les cellules réagissent aux signaux solides variant dans le temps. Les principaux avantages de cette technique sont que son faible coût nécessite peu de formation et que la configuration du système de profusion peut être adaptée à de nouvelles expériences. Commencez par remplir une seringue avec une solution de fond et chargez-la dans la première pompe à seringue.Remplissez une autre seringue avec une solution traceuse et chargez-la dans la deuxième pompe à seringue. Connectez les deux seringues à deux des trois ports d’un robinet d’arrêt à quatre voies à l’aide de connecteurs luer. Fermez le robinet d’arrêt à la solution d’arrière-plan et pompez la solution de traçage dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il s’écoule de l’orifice ouvert.Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage. Assurez-vous que la barre mobile des pompes à seringue est poussée contre les pistons de la seringue afin que le débit commence immédiatement au démarrage de la pompe. Fermez le robinet d’arrêt à la solution de traceur et pompez la solution d’arrière-plan dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que toute la solution résiduelle de traceur ait été évacuée du port ouvert.Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage. Configurez le composant du système de flux souhaité pour l’analyse RTD. Insérez l’extrémité dans un distributeur d’embout de pipette et pompez la solution de fond à travers le composant jusqu’à ce qu’il soit entièrement rempli.Réglez la pompe de la solution de traçage sur le débit souhaité. Fermez le robinet d’arrêt sur la solution d’arrière-plan et démarrez le flux de la solution de traçage. Dans le même temps, démarrez le collecteur de fractions.Continuez l’écoulement de la solution traceuse pendant une courte période de temps pour approximer une entrée d’impulsion du traceur. Une durée d’impulsion de 10 minutes est recommandée pour les RTD à un débit d’un millilitre par heure. Arrêtez la pompe de solution de traceur à la fin de la période d’impulsion de la solution de traceur.Fermez rapidement le robinet d’arrêt à la solution de traçage et démarrez le flux de la solution d’arrière-plan au même débit. Laissez la solution d’arrière-plan circuler et collecter des fractions jusqu’à ce que tout le traceur ait traversé le système et dans les fractions collectées. Dans des conditions stériles, insérez les bouchons avec des aiguilles dans les cultures de plaques de puits avec les aiguilles tirées vers le haut.Une fois le bouchon en place, abaissez les aiguilles à la hauteur souhaitée pour la perfusion, car la hauteur de l’aiguille de sortie détermine le niveau de liquide stable. Boucher les aiguilles avec des capuchons mâles et garder toute la plaque de puits dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Préparez les deux milieux à utiliser pour la perfusion, en étiquetant le milieu qui sera distribué en premier comme un et l’autre milieu deux.Pour chaque culture à perfuser, remplissez une seringue avec un milieu pour durer toute la durée de sa dispension plus suffisamment de volume pour remplir initialement le système de perfusion. Remplissez une deuxième seringue avec un milieu deux pour durer toute la durée de sa distribution. Connectez les deux seringues à deux des trois orifices d’un robinet d’arrêt à quatre voies.Une longueur de tube pour connecter les seringues aux robinets d’arrêt peut être nécessaire. Préparez les robinets d’arrêt en fermant le robinet d’arrêt pour le moyen un et en distribuant le milieu deux dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il commence à couler le port ouvert. Fermez ensuite le robinet d’arrêt pour le milieu deux et distribuez le milieu un dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que tout le milieu résiduel deux ait été évacué de l’orifice ouvert.Fixez le tuyau en amont à l’orifice ouvert du robinet d’arrêt à l’aide d’un connecteur femelle à barbe. Insérez un connecteur mâle à barbe à l’autre extrémité du tube. Distribuer le milieu un de la seringue jusqu’à ce que le tube en amont soit rempli de milieu et procéder à la préparation du tube en aval comme démontré précédemment.Insérez un connecteur mâle à barbe dans une extrémité du tube en aval et recouvrez-le d’un capuchon femelle. Apportez soigneusement tous les tubes préparés, les seringues et la plaque de puits à l’incubateur qui sera utilisé pour la perfusion. Placez la pompe à seringue et le collecteur de fractions aux endroits souhaités près de l’incubateur.Placez la pompe à seringue sur ou près de l’incubateur et placez le collecteur de fraction à côté de l’incubateur près du port. Chargez les seringues dans la pompe. Regroupez les extrémités coiffées de tous les tubes en amont et en aval et poussez-les de l’extérieur de l’incubateur vers l’intérieur à travers le port.Insérez les extrémités ouvertes des tubes en aval dans les extrémités de la pipette de distribution du distributeur à plusieurs têtes du collecteur de fractions. À l’intérieur de l’incubateur, tirez autant de mou que possible des tubes en amont dans l’incubateur pour maximiser la longueur des tubes à travers lesquels le fluide qui s’écoule peut recevoir de la chaleur et du dioxyde de carbone. Pour chaque puits bouché, décapsulez rapidement les aiguilles et les tubes en amont et en aval de ce puits, puis fixez-les ensemble avec leurs connecteurs luer.Une fois que toutes les pièces sont connectées, faites fonctionner brièvement la pompe à seringue à une vitesse relativement élevée pour vous assurer que tous les flux s’écoulent correctement. À ce stade, si vous souhaitez commencer l’expérience avec les tubes en aval remplis du milieu, continuez à faire fonctionner la pompe jusqu’à ce que tous soient remplis, sinon, arrêtez la pompe. Réglez le débit de la pompe à seringue pour le milieu un et la fréquence de collecte des fractions et démarrez les deux machines simultanément pour commencer l’expérience.Lorsque la source de milieu doit être changée, arrêtez rapidement la pompe à seringue pour la source moyenne. Tournez le robinet d’arrêt fermé à moyen un et démarrez la pompe à seringue pour le milieu deux. Si vous le souhaitez plus tard, remettez la source à la source moyenne de la même manière.Collectez des fractions pour la durée d’expérience souhaitée. Les concentrations de traceurs dans les fractions de deux expériences de RTD ont été mesurées et entrées dans le RTD à partir des données du script MATLAB pour produire les deux RTD. Des tubes simples et plusieurs morceaux de tubes en série s’adaptent bien par un seul modèle de dispersion axiale et l’ajout d’une plaque perfusée de 48 puits en ligne a provoqué un écart négligeable permettant à la fois au RTD à tube d’un mètre et au RTD de l’ensemble du système de s’adapter aux fonctions de dispersion axiale.Un exemple de mauvais ajustement du modèle a été démontré à l’aide du modèle de dispersion axiale adapté aux données RTD du tube d’un mètre et a été tracé à côté des données. Les suppositions initiales des paramètres ont été modifiées pour produire un bon ajustement du modèle où tau était approximativement égal au volume du système de perfusion divisé par son débit volumétrique. Une impulsion de 90 minutes de TNF-alpha a été définie comme le signal d’entrée du système et a été convoluée au RTD de tube d’un mètre pour déterminer le signal TNF-alpha à l’entrée de la plaque de puits.Le signal d’entrée a également été convolué avec le RTD de l’ensemble du système pour déterminer le signal TNF-alpha à la sortie du système dans les fractions collectées. Les cellules HEK 293 ont été conçues pour sécréter GLuc entraîné par un promoteur contenant l’élément de réponse NF-kappaB. L’expérience a révélé une augmentation significative de l’expression et une diminution lente de l’expression de GLuc entraînée par NF-kappaB après une exposition au TNF-alpha.Les variantes du système sont décrites dans le document d’accompagnement, y compris une configuration plus simple pour les expériences qui ne nécessitent pas de signaux d’entrée et d’exposition des cellules à des profils de soluté conjonctif pharma-hu.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

Bio-ingénierie

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