Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Diese Forschung wurde mit Unterstützung unter Grant Nos durchgeführt. R01EB012521, R01EB028782 und T32 GM008339 von den National Institutes of Health.

1. Bereiten Sie Teile für die Durchblutung der Bohrlochplatte vor
<ol><li>Schläuche vorbereiten<ol>
<li>Schneiden Sie zwei Längen Silikonschläuche (1,6 mm Innendurchmesser) für jede zu durchblutende Zellkultur. Stellen Sie sicher, dass das Stück, das als vorgeschalteter Schlauch verwendet wird, lang genug ist, um von der Spritzenpumpe bis zur Zellkultur im Inkubator zu reichen, und dass das nachgeschaltete Stück von der Zellkultur bis zur am weitesten ausgedehnten Position des Fraktionssammlers ...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. 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A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Diese Arbeit beschreibt den Aufbau und Betrieb eines Perfusionszellkultursystems mit mehreren Medienquellen, demonstriert mit einem spezifischen Beispiel, in dem die Dynamik der NF-κB-gesteuerten Genexpression als Reaktion auf einen transienten Puls von TNF-α gemessen wurde. Die RTDs der Komponenten des Perfusionssystems wurden gemessen und modelliert, und die Signalfaltung wurde verwendet, um sowohl die Exposition der Zellen gegenüber dem TNF-α-Puls als auch die TNF-α-Verteilung in den gesammelten Abwassermediumfra...

Viele wichtige biologische Prozesse laufen in Zell- und Gewebekulturen auf der Zeitskala von Minuten bis Stundenab 1,2,3. Während einige dieser Phänomene automatisiert mit Zeitraffermikroskopie4, Biolumineszenz1 oder anderen Methoden beobachtet und aufgezeichnet werden können, werden Experimente mit der Sammlung von Kulturüberstandsproben für die chemische Analyse häufig manuell in statischen Zellkulturen durchgeführt. Die manuelle Probenahme schränkt die Durchführbarkeit bestimmter Studien ein, da häufige oder außerbörsliche Probenahmezeitpunkte unbequem sind. Zu den weiteren Mängeln statischer Kulturmethoden gehören Experimente mit kontrollierten, vorübergehenden Expositionen gegenüber chemischen Reizen. In statischen Kulturen müssen Reize manuell hinzugefügt und entfernt werden, und Reizprofile sind auf Schrittänderungen im Laufe der Zeit beschränkt, während mittlere Änderungen auch andere Mediumskomponenten hinzufügen und entfernen, die Zellen auf unkontrollierte Weise beeinflussen können5. Fluidische Systeme können diese Herausforderungen meistern, aber bestehende Geräte stellen andere Herausforderungen dar. Mikrofluidische Geräte sind mit den unerschwinglichen Kosten für spezielle Ausrüstung und Schulungen zur Herstellung und Verwendung verbunden, erfordern mikroanalytische Methoden zur Verarbeitung von Proben und Zellen sind nach der Perfusion schwer aus den Geräten zu gewinnen6. Nur wenige makrofluidische Systeme wurden für die hier beschriebenen Arten von Experimenten entwickelt 7,8,9,10, und sie bestehen aus mehreren kundenspezifischen Teilen, die im eigenen Haus hergestellt werden und mehrere Pumpen oder Fraktionskollektoren erfordern. Darüber hinaus sind den Autoren keine kommerziell erhältlichen makrofluidischen Perfusionszellkultursysteme außer Rührkesselbioreaktoren für die Suspensionskultur bekannt, die für die Bioproduktion nützlich sind, jedoch nicht für die Modellierung und das Studium der Physiologie ausgelegt sind.
Die Autoren berichteten zuvor über das Design eines kostengünstigen Perfusionsbioreaktorsystems, das fast ausschließlich aus kommerziell erhältlichen Teilen11 besteht. Die Basisversion des Systems ermöglicht es, mehrere Kulturen in einer Bohrlochplatte in einem CO 2-Inkubator zu halten und kontinuierlich mit Medium aus einer Spritzenpumpe zu perfundieren, während die Abwassermittelströme aus den Kulturen im Laufe der Zeit automatisch zu Proben fraktioniert werden, wobei ein Fraktionskollektor mit einer kundenspezifischen Modifikation verwendet wird. Somit ermöglicht dieses System eine automatisierte Probenahme von Kulturmediumüberständen und kontinuierlichen gelösten Stoffen in die Kulturen im Laufe der Zeit. Das System ist makrofluidisch und modular aufgebaut und kann leicht modifiziert werden, um die Anforderungen neuartiger Versuchsdesigns zu erfüllen.
Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methode ist es, ein Perfusionszellkultursystem zu konstruieren, zu charakterisieren und zu verwenden, das Experimente ermöglicht, bei denen die Sekretions- oder Absorptionsraten von Substanzen durch Zellen im Laufe der Zeit gemessen werden und/oder Zellen präzisen, transienten gelösten Signalen ausgesetzt werden. Dieser Videoartikel erklärt, wie Sie das Basis-Setup zusammenbauen, das in der Lage ist, bis zu sechs Zellkulturen gleichzeitig mit einer einzigen Spritzenpumpe und einem modifizierten Fraktionssammler zu durchbluten. Zwei nützliche Varianten des Basissystems, die zusätzliche Pumpen und Teile verwenden, um Experimente zu ermöglichen, die Zellen transienten Konzentrationssignalen für gelöste Stoffe aussetzen, einschließlich kurzer Pulse und pharmakokinetischer ähnlicher Profile12, werden ebenfalls vorgestellt, wie in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Abbildung 1: Drei Variationen des Perfusionssystemdesigns. (Top) Das grundlegende Perfusionssystem. (Mitte) Das Perfusionssystem mit einem Absperrhahn für mehrere mittlere Quellen. (Unten) Das Perfusionssystem mit einem gerührten Tank, um ein gut gemischtes Verteilungsvolumen nachzuahmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Aufgrund der Dispersion und Diffusion innerhalb der Strömung werden die gelösten Signale verzerrt oder "verschmiert", wenn sie durch das Strömungssystem wandern. Diese Verzerrung kann durch die Verwendung von Verweilzeitverteilungen (RTDs)13 quantifiziert werden. In diesem Artikel wird erläutert, wie Tracer-Experimente an Komponenten des Perfusionssystems durchgeführt werden (Abbildung 2), und es werden MATLAB-Skripte zum Generieren von RTDs aus Messdaten bereitgestellt. Eine detaillierte Erläuterung dieser Analyse findet sich im vorherigen Paper11 der Autoren. Zusätzliche MATLAB-Skripte passen die entsprechenden Funktionen an die RTDs an, extrahieren physikalische Parameter und führen eine Signalfaltung mithilfe von RTDs durch, um vorherzusagen, wie sich der Benutzer durch das Perfusionssystem ausbreitet und verzerrt14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Abbildung 2: Verweilzeitverteilungen. Die RTDs von Strömungssystemkomponenten, wie diese Länge der Röhren, werden gemessen, indem ein Impuls des Tracers in das System eingegeben wird und gemessen wird, wie er "schmiert", wenn er in die gesammelten Fraktionen austritt. Diese Figur wurde von Erickson et al.11 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Bestimmte Zell- und Gewebefunktionen arbeiten innerhalb der dynamischen Zeitskala von Minuten bis Stunden, die von herkömmlichen Kultursystemen schlecht aufgelöst werden. Diese Arbeit hat ein kostengünstiges Perfusionsbioreaktorsystem entwickelt, mit dem Kulturmedium kontinuierlich in ein Zellkulturmodul perfundiert und in einem nachgeschalteten Modul fraktioniert werden kann, um die Dynamik auf dieser Skala zu messen. Das System besteht fast ausschließlich aus kommerziell erhältlichen Teilen und kann parallelisiert werden, um unabhängige Experimente in herkömmlichen Multi-Well-Zellkulturplatten gleichzeitig durchzuführen. Dieser Videoartikel zeigt, wie Sie das Basis-Setup zusammenbauen, das nur eine einzige Mehrkanal-Spritzenpumpe und einen modifizierten Fraktionskollektor benötigt, um bis zu sechs Kulturen parallel zu perfusionieren. Es werden auch nützliche Varianten des modularen Aufbaus vorgestellt, die eine kontrollierte Stimulationsdynamik ermöglichen, wie z.B. gelöste Impulse oder pharmakokinetische Profile. Wichtig ist, dass die Signale des gelösten Stoffes, wenn sie durch das System wandern, aufgrund der Dispersion des gelösten Stoffes verzerrt sind. Weiterhin wird ein Verfahren zur Messung der Verweilzeitverteilungen (RTDs) der Komponenten des Perfusionsaufbaus mit einem Tracer unter Verwendung von MATLAB beschrieben. RTDs sind nützlich, um zu berechnen, wie gelöste Signale durch den Durchfluss im Multikompartimentsystem verzerrt werden. Dieses System ist sehr robust und reproduzierbar, so dass Grundlagenforscher es leicht übernehmen können, ohne dass spezielle Fertigungsanlagen erforderlich sind.

Das Perfusionssystem mit mehreren Mediumquellen aus Abschnitt 5 des Protokolls wurde verwendet, um die Expressionsdynamik eines Reportergens zu messen, das durch den Kernfaktor kappa-light-chain-enhancer von aktivierten B-Zellen (NF-κB) Transkriptionsfaktor in menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) als Reaktion auf einen 1,5 h Puls des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α) angetrieben wird. HEK293-Zellen wurden stabil unter Verwendung von lentiviralen Vektoren mit einem Genkonstrukt transduziert, das Gaussia lu...

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Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Dieses Papier stellt eine Methode zum Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen, mehrkanaligen Perfusionszellkultursystems zur Messung der Dynamik der Sekretions- und Absorptionsraten von gelösten Stoffen in zellulären Prozessen vor. Das System kann Zellen auch dynamischen Reizprofilen aussetzen.

Multi-Stream-Perfusionsbioreaktor integriert mit Auslassfraktionierung für dynamische Zellkultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Diese Methode hilft zu verstehen, wie sich die Sekretionsraten mit der Zeit ändern und wie Zellen auf zeitlich variierende feste Signale reagieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass ihre niedrigen Kosten wenig Training erfordern und der Aufbau des Füllsystems für neuartige Experimente angepasst werden kann. Füllen Sie zunächst eine Spritze mit einer Hintergrundlösung und laden Sie sie in die erste Spritzenpumpe.Füllen Sie eine andere Spritze mit Tracerlösung und laden Sie sie in die zweite Spritzenpumpe. Verbinden Sie beide Spritzen über Luer-Steckverbinder mit zwei der drei Anschlüsse eines Vier-Wege-Absperrhahns. Schließen Sie den Absperrhahn an die Hintergrundlösung und pumpen Sie die Tracerlösung in den Absperrhahn, bis sie aus dem offenen Anschluss tropft.Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie die Spritze nicht weiter ein. Stellen Sie sicher, dass die bewegliche Stange der Spritzenpumpen gegen die Spritzenkolben gedrückt wird, so dass der Durchfluss sofort beginnt, wenn die Pumpe gestartet wird. Schließen Sie den Absperrhahn mit der Tracerlösung und pumpen Sie die Hintergrundlösung in den Absperrhahn, bis alle verbleibenden Tracerlösungen aus dem offenen Port gespült wurden.Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie die Spritze nicht weiter ein. Richten Sie die für die FTE-Analyse gewünschte Strömungssystemkomponente ein. Setzen Sie das Ende in einen Pipettenspitzenspender ein und pumpen Sie die Hintergrundlösung durch das Bauteil, bis es vollständig gefüllt ist.Stellen Sie die Pumpe für die Tracerlösung auf den gewünschten Durchfluss ein. Schließen Sie den Absperrhahn zur Hintergrundlösung und starten Sie den Fluss der Tracerlösung. Starten Sie gleichzeitig den Fraktionssammler.Setzen Sie den Fluss der Tracerlösung für kurze Zeit fort, um sich einem Impulseintrag des Tracers anzunähern. Eine Pulsdauer von 10 Minuten wird für RTDs mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Stunde empfohlen. Stoppen Sie die Tracerlösungspumpe am Ende der Impulsperiode der Tracerlösung.Schließen Sie den Absperrhahn schnell mit der Tracerlösung und starten Sie den Fluss der Hintergrundlösung mit der gleichen Durchflussrate. Lassen Sie die Hintergrundlösung fließen und Bruchteile sammeln, bis der gesamte Tracer das System und die gesammelten Fraktionen passiert hat. Unter sterilen Bedingungen die Stopfen mit Nadeln in die Well-Plate-Kulturen einführen, wobei die Nadeln hochgezogen werden.Nachdem der Stopfen an Ort und Stelle ist, senken Sie die Nadeln für die Perfusion auf die gewünschte Höhe ab, da die Höhe der Auslassnadel den stabilen Flüssigkeitsstand bestimmt. Verschließen Sie die Nadeln mit männlichen Luer-Kappen und halten Sie die gesamte Wellplate in einem Inkubator-Set bei 37 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Bereiten Sie die beiden Medien für die Perfusion vor und kennzeichnen Sie das Medium, das zuerst abgegeben wird, als eines und das andere Medium als zwei.Damit jede Kultur durchblutet werden soll, füllen Sie eine Spritze mit mittlerer einer, um die gesamte Dauer ihrer Entsaftung plus genug Volumen zu halten, um das Perfusionssystem zunächst zu füllen. Füllen Sie eine zweite Spritze mit mittleren zwei, um die gesamte Dauer ihrer Entleerung zu dauern. Schließen Sie beide Spritzen an zwei der drei Anschlüsse eines Vier-Wege-Absperrhahns an.Eine Länge des Schlauches, um die Spritzen mit den Absperrhähnen zu verbinden, kann erforderlich sein. Bereiten Sie die Absperrhähne vor, indem Sie den Absperrhahn für Medium eins schließen und Medium Two in den Absperrhahn dosieren, bis er gerade beginnt, den offenen Port herauszutropfen. Schließen Sie dann den Absperrhahn für Medium zwei und geben Sie Medium eins in den Absperrhahn ab, bis alle verbleibenden mittleren zwei aus dem offenen Port gespült wurden.Befestigen Sie den vorgeschalteten Schlauch mit einem Buchsen-zu-Widerhaken-Luer-Anschluss am offenen Absperrhahn. Stecken Sie einen Stecker-zu-Widerhaken-Luer-Stecker am anderen Ende des Rohrs. Geben Sie das Medium eins aus der Spritze ab, bis das vorgeschaltete Rohr mit Medium gefüllt ist, und fahren Sie mit der Vorbereitung der nachgeschalteten Schläuche fort, wie zuvor gezeigt.Stecken Sie einen Stecker-zu-Widerhaken-Luer-Steckverbinder in ein Ende des nachgeschalteten Schlauchs und verschließen Sie ihn mit einer weiblichen Luer-Kappe. Bringen Sie vorsichtig alle vorbereiteten Schläuche, Spritzen und die Wellplatte zum Inkubator, der für die Perfusion verwendet wird. Stellen Sie die Spritzenpumpe und den Fraktionssammler an den gewünschten Stellen in der Nähe des Inkubators auf.Stellen Sie die Spritzenpumpe auf oder in der Nähe des Inkubators auf und platzieren Sie den Fraktionssammler neben dem Inkubator in der Nähe des Anschlusses. Laden Sie die Spritzen in die Pumpe. Bündeln Sie die verkappten Enden aller vor- und nachgeschalteten Rohre und schieben Sie sie von der Außenseite des Inkubators nach innen durch den Anschluss.Setzen Sie die offenen Enden der nachgeschalteten Rohre in die Dosierpipettenspitzen des Mehrkopfspenders des Fraktionssammlers ein. Ziehen Sie im Inkubator so viel Durchhang wie möglich der vorgeschalteten Rohre in den Inkubator, um die Länge der Schläuche zu maximieren, durch die das strömende Medium Wärme und Kohlendioxid aufnehmen kann. Lösen Sie für jeden verstopften Brunnen schnell die Nadeln und die vor- und nachgeschalteten Rohre für diesen Brunnen und befestigen Sie sie dann zusammen mit ihren Luer-Steckverbindern.Sobald alle Teile angeschlossen sind, lassen Sie die Spritzenpumpe kurz mit einer relativ hohen Geschwindigkeit laufen, um sicherzustellen, dass alle Ströme ordnungsgemäß fließen. An diesem Punkt, wenn es gewünscht ist, das Experiment mit den nachgeschalteten Rohren voller Medium zu beginnen, fahren Sie mit der Pumpe fort, bis alle gefüllt sind, andernfalls stoppen Sie die Pumpe. Stellen Sie den Durchfluss der Spritzenpumpe für Medium eins und die Häufigkeit der Fraktionssammlung ein und starten Sie beide Maschinen gleichzeitig, um das Experiment zu beginnen.Wenn die mittlere Quelle gewechselt werden muss, stoppen Sie schnell die Spritzenpumpe für eine mittlere Quelle. Drehen Sie den geschlossenen Absperrhahn auf mittel eins und starten Sie die Spritzenpumpe für mittlere zwei. Falls gewünscht, schalten Sie die Quelle später ähnlich wieder auf mittlere um.Sammeln Sie Brüche für die gewünschte Testdauer. Die Tracerkonzentrationen in den Fraktionen aus zwei RTD-Experimenten wurden gemessen und aus dem MATLAB-Skript der Daten in die RTD eingegeben, um die beiden RTDs zu erzeugen. Einzelne Rohre und mehrere Rohrstücke in Reihe passen gut zu einem einzigen axialen Dispersionsmodell, und das Hinzufügen einer perfundierten 48-Well-Platte in der Linie verursachte eine vernachlässigbare Abweichung, so dass sowohl der Ein-Meter-Rohr-RTD als auch der RTD des gesamten Systems durch axiale Dispersionsfunktionen passen konnten.Ein Beispiel für eine schlechte Modellanpassung wurde anhand des axialen Dispersionsmodells demonstriert, das an die RTD-Daten des Ein-Meter-Rohrs angepasst war, und wurde zusammen mit den Daten dargestellt. Die anfänglichen Parametervermutungen wurden geändert, um eine gute Modellanpassung zu erhalten, bei der Tau ungefähr gleich dem Volumen des Perfusionssystems dividiert durch seinen Volumenstrom war. Ein 90-Minuten-Impuls von TNF-alpha wurde als Eingangssignal an das System definiert und mit dem Ein-Meter-Rohr RTD verwickelt, um das TNF-alpha-Signal am Einlass der Bohrlochplatte zu bestimmen.Das Eingangssignal wurde auch mit dem RTD des gesamten Systems konvolviert, um das TNF-alpha-Signal am Ausgang des Systems in den gesammelten Fraktionen zu bestimmen. HEK 293-Zellen wurden entwickelt, um GLuc zu sezernieren, das von einem Promotor angetrieben wird, der das NF-kappaB-Antwortelement enthält. Das Experiment zeigte eine signifikante Expressionssteigerung und eine langsame Abnahme der GLuc-Expression, die durch NF-kappaB nach TNF-alpha-Exposition angetrieben wurde.Variationen des Systems werden in Begleitpapieren beschrieben, einschließlich eines einfacheren Aufbaus für Experimente, die keine Signaleingaben erfordern, und die Exposition von Zellen gegenüber pharma-hu-verbindenden gelösten Stoffprofilen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...