Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
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Questa ricerca è stata condotta con il supporto di Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 e T32 GM008339 del National Institutes of Health.

1. Preparare le parti per la perfusione della piastra del pozzo
<ol><li>Preparare i tubi<ol>
<li>Tagliare due lunghezze di tubi in silicone (diametro interno 1,6 mm) per ogni coltura cellulare da perfusare. Assicurarsi che il pezzo utilizzato come tubo a monte sia abbastanza lungo da raggiungere dalla pompa della siringa alla coltura cellulare all'interno dell'incubatore e che il pezzo a valle possa raggiungere dalla coltura cellulare alla posizione più estesa del collettore di frazione.</li>
		<li>Da...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. 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A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Questo lavoro descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema di coltura cellulare a perfusione con più sorgenti medie dimostrate con un esempio specifico in cui sono state misurate le dinamiche dell'espressione genica guidata da NF-κB in risposta a un impulso transitorio di TNF-α. Gli RTD dei componenti del sistema di perfusione sono stati misurati e modellati e la convoluzione del segnale è stata utilizzata per prevedere sia l'esposizione delle cellule all'impulso TNF-α sia la distribuzione TNF-α nelle f...

Molti importanti processi biologici si verificano in colture cellulari e tissutali sulla scala temporale da minuti a ore 1,2,3. Mentre alcuni di questi fenomeni possono essere osservati e registrati in modo automatizzato utilizzando la microscopia time-lapse4, la bioluminescenza1 o altri metodi, gli esperimenti che coinvolgono la raccolta di campioni di surnatante di coltura per l'analisi chimica vengono spesso eseguiti manualmente in colture cellulari statiche. Il campionamento manuale limita la fattibilità di alcuni studi a causa dell'inconveniente di punti temporali di campionamento frequenti o fuori orario. Ulteriori carenze dei metodi di coltura statica includono esperimenti che coinvolgono esposizioni controllate e transitorie a stimoli chimici. Nelle colture statiche, gli stimoli devono essere aggiunti e rimossi manualmente, e i profili di stimolo sono limitati ai cambiamenti di passo nel tempo, mentre i cambiamenti medi aggiungono e rimuovono anche altri componenti del mezzo, che possono influenzare le cellule in modo incontrollato5. I sistemi fluidici possono superare queste sfide, ma i dispositivi esistenti pongono altre sfide. I dispositivi microfluidici comportano i costi proibitivi di attrezzature specializzate e formazione da produrre e utilizzare, richiedono metodi microanalitici per elaborare i campioni e le cellule sono difficili da recuperare dai dispositivi dopo la perfusione6. Pochi sistemi macrofluidici sono stati creati per i tipi di esperimenti qui descritti 7,8,9,10, e sono costruiti con più parti personalizzate realizzate internamente e richiedono più pompe o collettori di frazioni. Inoltre, gli autori non sono a conoscenza di alcun sistema di coltura cellulare a perfusione macrofluidica disponibile in commercio diverso dai bioreattori a serbatoi agitati per la coltura in sospensione, che sono utili per la bioproduzione, sebbene non siano progettati per modellare e studiare la fisiologia.
Gli autori hanno precedentemente riferito sulla progettazione di un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo composto quasi interamente da parti11 disponibili in commercio. La versione base del sistema consente di conservare più colture in una piastra di pozzo in un incubatore a CO2 e di fondere continuamente con il mezzo di una pompa a siringa, mentre i flussi del mezzo effluente provenienti dalle colture vengono automaticamente frazionati in campioni nel tempo utilizzando un collettore di frazioni con una modifica personalizzata. Pertanto, questo sistema consente il campionamento automatizzato del surnatante del terreno di coltura e l'input continuo del soluto alle colture nel tempo. Il sistema è macrofluidico e modulare e può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze di nuovi progetti di esperimenti.
L'obiettivo generale del metodo qui presentato è quello di costruire, caratterizzare e utilizzare un sistema di coltura cellulare a perfusione che consenta esperimenti in cui vengono misurati i tassi di secrezione o assorbimento di sostanze da parte delle cellule nel tempo e / o le cellule sono esposte a segnali di soluto precisi e transitori. Questo articolo video spiega come assemblare la configurazione di base, che è in grado di perfondere fino a sei colture cellulari contemporaneamente utilizzando una singola pompa a siringa e un collettore di frazioni modificate. Nella Figura 1 sono inoltre presentate due varianti utili sul sistema di base che utilizzano pompe e parti aggiuntive per consentire esperimenti che espongono le cellule a segnali transitori di concentrazione di soluto, inclusi brevi impulsi e profili farmacocinetici12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figura 1: Tre variazioni sul progetto del sistema di perfusione. (In alto) Il sistema di perfusione di base. (Al centro) Il sistema di perfusione con un rubinetto di arresto per più sorgenti medie. (In basso) Il sistema di perfusione con un serbatoio agitato per imitare un volume di distribuzione ben miscelato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A causa della dispersione e della diffusione all'interno del flusso, i segnali del soluto diventano distorti o "imbrattati" mentre viaggiano attraverso il sistema di flusso. Questa distorsione può essere quantificata mediante l'uso di distribuzioni temporali di residenza (RTD)13. Questo articolo spiega come eseguire esperimenti traccianti sui componenti del sistema di perfusione (Figura 2) e fornisce script MATLAB per generare RTD dai dati misurati. Una spiegazione dettagliata di questa analisi può essere trovata nel precedente articolo11 degli autori. Ulteriori script MATLAB adattano funzioni appropriate agli RTD ed estraggono parametri fisici ed eseguono la convoluzione del segnale utilizzando RTD per prevedere come l'input del segnale di soluto da parte dell'utente si propagherà e si distorcerà attraverso il sistema di perfusione14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figura 2: Distribuzioni del tempo di residenza. Gli RTD dei componenti del sistema di flusso, come questa lunghezza del tubo, vengono misurati immettendo un impulso di tracciante nel sistema e misurando come "spalma" nel momento in cui esce nelle frazioni raccolte. Questa cifra è stata modificata da Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Alcune funzioni cellulari e tissutali operano all'interno della scala temporale dinamica da minuti a ore che sono scarsamente risolte dai sistemi di coltura convenzionali. Questo lavoro ha sviluppato un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo che consente di perfondere continuamente il terreno di coltura in un modulo di coltura cellulare e frazionato in un modulo a valle per misurare la dinamica su questa scala. Il sistema è costruito quasi interamente da parti disponibili in commercio e può essere parallelizzato per condurre esperimenti indipendenti in piastre di coltura cellulare multi-pozzo convenzionali contemporaneamente. Questo articolo video illustra come assemblare la configurazione di base, che richiede solo una singola pompa a siringa multicanale e un collettore di frazioni modificato per perfondere fino a sei colture in parallelo. Vengono inoltre presentate varianti utili sul design modulare che consentono dinamiche di stimolazione controllate, come impulsi di soluto o profili simili a farmacocinetici. È importante sottolineare che, poiché i segnali dei soluti viaggiano attraverso il sistema, vengono distorti a causa della dispersione del soluto. Inoltre, viene descritto un metodo per misurare le distribuzioni del tempo di residenza (RTD) dei componenti della configurazione della perfusione con un tracciante utilizzando MATLAB. Gli RTD sono utili per calcolare come i segnali dei soluti sono distorti dal flusso nel sistema multi-compartimento. Questo sistema è altamente robusto e riproducibile, quindi i ricercatori di base possono facilmente adottarlo senza la necessità di strutture di fabbricazione specializzate.

Il sistema di perfusione con più sorgenti medie della sezione 5 del protocollo è stato utilizzato per misurare le dinamiche di espressione di un gene reporter guidato dal fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer del fattore di trascrizione delle cellule B attivate (NF-κB) nelle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) in risposta a un impulso di 1,5 ore del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le cellule HEK293 sono state stabilmente trasdotte utilizzando vettori lentivirali con un costrutto genico cont...

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Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Questo documento presenta un metodo per costruire e gestire un sistema di coltura cellulare a perfusione multicanale a basso costo per misurare la dinamica dei tassi di secrezione e assorbimento dei soluti nei processi cellulari. Il sistema può anche esporre le cellule a profili di stimolo dinamici.

Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Questo metodo aiuta a capire come i tassi di secrezione cambiano nel tempo e come le cellule rispondono ai segnali solidi variabili nel tempo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che il suo basso costo richiede poca formazione e la configurazione del sistema di profusione può essere adattata per nuovi esperimenti. Iniziare riempiendo una siringa con una soluzione di fondo e caricarla nella prima pompa della siringa.Riempire un'altra siringa con una soluzione tracciante e caricarla nella seconda pompa della siringa. Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie utilizzando connettori luer. Chiudere il rubinetto alla soluzione di fondo e pompare la soluzione tracciante nel rubinetto fino a quando non gocciola fuori dalla porta aperta.Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa. Assicurarsi che la barra mobile delle pompe a siringa sia spinta verso l'alto contro gli stantuffi della siringa in modo che il flusso inizi immediatamente all'avvio della pompa. Chiudere il rubinetto alla soluzione tracciante e pompare la soluzione di fondo nel rubinetto fino a quando tutta la soluzione di tracciante residua non è stata scaricata dalla porta aperta.Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa. Impostare il componente del sistema di flusso desiderato per l'analisi RTD. Inserire l'estremità in un distributore di punta della pipetta e pompare la soluzione di sfondo attraverso il componente fino a quando non è completamente riempito.Impostare la pompa per la soluzione tracciante sulla portata desiderata. Chiudere il rubinetto alla soluzione di sfondo e avviare il flusso della soluzione tracciante. Allo stesso tempo, avviare il collettore di frazioni.Continuare il flusso della soluzione tracciante per un breve periodo di tempo per approssimare un input di impulso del tracciante. Una durata dell'impulso di 10 minuti è raccomandata per gli RTD ad una portata di un millilitro all'ora. Arrestare la pompa della soluzione tracciante alla fine del periodo di impulso della soluzione tracciante.Chiudere rapidamente il rubinetto alla soluzione tracciante e avviare il flusso della soluzione di fondo alla stessa portata. Lasciare che la soluzione di fondo fluisca e raccolga le frazioni fino a quando tutto il tracciante non è passato attraverso il sistema e nelle frazioni raccolte. In condizioni sterili, inserire i tappi con aghi nelle colture di piastre del pozzo con gli aghi tirati su.Dopo che il tappo è in posizione, abbassare gli aghi all'altezza desiderata per la perfusione poiché l'altezza dell'ago di uscita determina il livello stabile del liquido. Tappare gli aghi con tappi di luer maschio e tenere l'intera piastra del pozzo in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius fino all'uso. Preparare i due mezzi da utilizzare per la perfusione, etichettando il mezzo che verrà erogato prima come uno e l'altro mezzo due.Per ogni coltura da perfusare, riempire una siringa con una media per durare l'intera durata della sua erogazione più un volume sufficiente per riempire inizialmente il sistema di perfusione. Riempire una seconda siringa con due medie per durare per tutta la durata della sua erogazione. Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie.Può essere necessaria una lunghezza di tubo per collegare le siringhe ai rubinetti. Preparare i rubinetti chiudendo il rubinetto per il mezzo uno e distribuendo il mezzo due nel rubinetto fino a quando non inizia a gocciolare fuori dalla porta aperta. Quindi chiudere il rubinetto per il mezzo due ed erogare il mezzo uno nel rubinetto fino a quando tutto il mezzo residuo due non è stato espulso dalla porta aperta.Collegare il tubo a monte alla porta aperta del rubinetto utilizzando un connettore femmina a barb luer. Inserire un connettore maschio a barbo sull'altra estremità del tubo. Erogare il mezzo uno dalla siringa fino a quando il tubo a monte non viene riempito con il mezzo e procedere con la preparazione del tubo a valle come dimostrato in precedenza.Inserire un connettore luer maschio a barbo in un'estremità del tubo a valle e tapparlo con un cappuccio luer femmina. Portare con cura tutti i tubi preparati, le siringhe e la piastra del pozzo nell'incubatore che verrà utilizzato per la perfusione. Posizionare la pompa della siringa e il collettore di frazione nelle posizioni desiderate vicino all'incubatore.Posizionare la pompa della siringa sopra o vicino all'incubatore e posizionare il collettore di frazione accanto all'incubatore vicino al porto. Caricare le siringhe nella pompa. Raggruppare le estremità coperte di tutti i tubi a monte e a valle e spingerli dall'esterno dell'incubatore verso l'interno attraverso la porta.Inserire le estremità aperte dei tubi a valle nelle punte delle pipette di erogazione del distributore multitesta del collettore di frazione. All'interno dell'incubatore, tirare il più possibile i tubi a monte nell'incubatore per massimizzare la lunghezza del tubo attraverso il quale il mezzo che scorre può ricevere calore e anidride carbonica. Per ogni pozzetto collegato, scollegare rapidamente gli aghi e i tubi a monte e a valle per quel pozzo, quindi collegarli insieme ai loro connettori luer.Una volta collegate tutte le parti, far scorrere brevemente la pompa della siringa a una velocità relativamente elevata per assicurarsi che tutti i flussi scorrano correttamente. A questo punto, se si desidera iniziare l'esperimento con i tubi a valle pieni del mezzo, continuare a far funzionare la pompa fino a quando tutti non sono pieni, altrimenti, fermare la pompa. Impostare la portata della pompa della siringa per il medio uno e la frequenza di raccolta delle frazioni e avviare entrambe le macchine contemporaneamente per iniziare l'esperimento.Quando è necessario sostituire la sorgente media, arrestare rapidamente la pompa della siringa per quella media. Ruotare il rubinetto chiuso a medio uno e avviare la pompa della siringa per il mezzo due. Se lo si desidera in seguito, riportare la sorgente a quella media in modo simile.Raccogli le frazioni per la durata dell'esperimento desiderata. Le concentrazioni di traccianti nelle frazioni di due esperimenti di RTD sono state misurate e immesse nell'RTD dallo script MATLAB di dati per produrre i due RTD. Tubi singoli e più pezzi di tubi in serie si adattano bene a un singolo modello di dispersione assiale e l'aggiunta di una piastra di 48 pozzetti perfusi in linea ha causato una deviazione trascurabile che consente sia all'RTD del tubo di un metro che all'RTD dell'intero sistema di adattarsi alle funzioni di dispersione assiale.Un esempio di scarsa aderenza al modello è stato dimostrato utilizzando il modello di dispersione assiale montato sui dati RTD del tubo di un metro ed è stato tracciato insieme ai dati. Le ipotesi dei parametri iniziali sono state modificate per produrre un buon adattamento del modello in cui tau era approssimativamente uguale al volume del sistema di perfusione diviso per la sua portata volumetrica. Un impulso di 90 minuti di TNF-alfa è stato definito come il segnale di ingresso al sistema ed è stato coinvolto con l'RTD del tubo di un metro per determinare il segnale TNF-alfa all'ingresso della piastra del pozzo.Il segnale di ingresso è stato anche coinvolto con l'RTD dell'intero sistema per determinare il segnale TNF-alfa all'uscita del sistema nelle frazioni raccolte. Le cellule HEK 293 sono state progettate per secernere GLuc guidato da un promotore contenente l'elemento di risposta NF-kappaB. L'esperimento ha rivelato un significativo aumento dell'espressione e una lenta diminuzione dell'espressione di GLuc guidata da NF-kappaB dopo l'esposizione al TNF-alfa.Le variazioni del sistema sono descritte nel documento di accompagnamento, inclusa una configurazione più semplice per gli esperimenti che non richiedono l'immissione di segnali e l'esposizione delle cellule a profili di soluto connettivo pharma-hu.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

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Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

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Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

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