Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

이 연구는 그랜트 번호 (Grant Nos)의 지원을 받아 수행되었습니다. 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 R01EB012521, R01EB028782 및 T32 GM008339.

1. 우물 격판덮개 관류를 위한 부속을 준비하십시오
<ol><li>튜브 준비<ol>
<li>각 세포 배양물이 관류되도록 두 개의 길이의 실리콘 튜빙(1.6 mm 내경)을 절단한다. 업스트림 튜빙으로 사용되는 조각이 주사기 펌프에서 인큐베이터 내부의 세포 배양까지 도달하기에 충분히 길고, 하류 조각이 세포 배양물에서 분획 수집기의 가장 먼 확장 위치까지 도달 할 수 있는지 확인하십시오.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

이 작업은 TNF-α의 일시적인 펄스에 반응하여 NF-κB 구동 유전자 발현의 역학이 측정되는 구체적인 예와 함께 입증된 다수의 배지 공급원을 갖는 관류 세포 배양 시스템의 조립 및 작동을 기술한다. 관류 시스템 성분의 RTD를 측정하고 모델링하고, 신호 컨볼루션을 사용하여 수집된 유출수 배지 분획에서의 TNF-α 펄스에 대한 세포의 노출과 TNF-α 분포를 모두 예측하였다. 세포를 펄스에 노출시키고, ?...

많은 중요한 생물학적 과정은 세포 및 조직 배양물에서 분 내지 시간 1,2,3의 시간 척도에서 일어난다. 이러한 현상 중 일부는 타임랩스 현미경4, 생체발광1 또는 기타 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 관찰되고 기록될 수 있지만, 화학 분석을 위해 배양 상등액 샘플의 수집을 포함하는 실험은 종종 정적 세포 배양물에서 수동으로 수행됩니다. 수동 샘플링은 빈번한 또는 근무 후 샘플링 시간대의 불편 함으로 인해 특정 연구의 실현 가능성을 제한합니다. 정적 배양 방법의 또 다른 단점은 화학 자극에 대한 통제되고 일시적인 노출을 포함하는 실험을 포함한다. 정적 배양에서, 자극은 수동으로 추가 및 제거되어야 하며, 자극 프로파일은 시간에 따른 단계 변화로 제한되는 반면, 배지 변경은 또한 통제되지 않는 방식으로 세포에 영향을 미칠 수 있는 다른 배지 성분을 추가 및 제거한다5. 유체 시스템은 이러한 문제를 극복 할 수 있지만 기존 장치는 다른 문제를 제기합니다. 미세 유체 장치는 생산 및 사용을위한 특수 장비 및 교육의 엄청난 비용을 수반하며, 샘플을 처리하기 위해 미세 분석 방법이 필요하며 관류 후 세포가 장치에서 복구하기가 어렵습니다6. 7,8,9,10에 설명 된 실험 유형을 위해 매크로 유체 시스템이 거의 만들어지지 않았으며 사내에서 제작 된 여러 맞춤형 부품으로 제작되었으며 여러 펌프 또는 분수 수집기가 필요합니다. 또한, 저자들은 현탁 배양을 위한 교반 탱크 생물반응기 이외의 상업적으로 이용가능한 거대유체 관류 세포 배양 시스템을 알지 못하지만, 이는 생리학을 모델링하고 연구하기 위해 설계되지는 않았지만, 바이오제조에 유용하다.
저자들은 이전에 거의 전적으로 상업적으로 이용가능한 부분들(11)로 구성된 저비용 관류 생물반응기 시스템의 설계에 대해 보고하였다. 시스템의 기본 버전은 웰 플레이트의 여러 배양물을CO2 인큐베이터에 보관하고 시린지 펌프의 배지와 지속적으로 관류할 수 있게 하며, 배양물로부터의 유출 배지 스트림은 맞춤형 변형을 통해 분획 수집기를 사용하여 시간이 지남에 따라 샘플로 자동 분획됩니다. 따라서, 이 시스템은 배양 배지 상청액의 자동 샘플링 및 시간에 따른 배양물에 대한 연속 용질 투입을 가능하게 한다. 이 시스템은 거대 유동적이고 모듈식이며 새로운 실험 설계의 요구를 충족시키기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 시간에 따른 세포에 의한 물질의 분비 또는 흡수 속도가 측정되고 / 또는 세포가 정확하고 일시적인 용질 신호에 노출되는 실험을 가능하게하는 관류 세포 배양 시스템을 구성, 특성화 및 사용하는 것입니다. 이 비디오 기사에서는 단일 주사기 펌프와 변형된 분획 수집기를 사용하여 최대 여섯 개의 세포 배양물을 동시에 관류할 수 있는 기본 설정을 조립하는 방법을 설명합니다. 짧은 펄스 및 약동학 유사 프로파일(12)을 포함하는 세포를 일시적인 용질 농도 신호에 노출시키는 실험을 허용하기 위해 추가적인 펌프 및 부품을 사용하는 베이스 시스템 상의 두 가지 유용한 변이체가 또한 도 1에 제시된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> 그림 1: 관류 시스템 설계의 세 가지 변형 . (Top) 기본 관류 시스템. (중간) 여러 매체 소스에 대한 스톱콕이있는 관류 시스템. (하단) 교반된 탱크를 갖는 관류 시스템은 잘 혼합된 부피의 분포를 모방한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
흐름 내의 분산 및 확산으로 인해 용질 신호는 흐름 시스템을 통과 할 때 왜곡되거나 "번짐"됩니다. 이러한 왜곡은 체류 시간 분포(RTD)13의 사용을 통해 정량화될 수 있다. 이 문서에서는 관류 시스템의 구성 요소에 대한 추적기 실험을 수행하는 방법을 설명하고(그림 2), 측정된 데이터에서 RTD를 생성하는 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 분석에 대한 자세한 설명은 저자의 이전 논문11에서 찾을 수 있습니다. 추가적인 MATLAB 스크립트는 RTD에 적절한 기능을 적합시키고 물리적 파라미터를 추출하고, RTD를 사용하여 신호 컨볼루션을 수행하여 사용자에 의해 입력된 용질 신호가 관류 시스템(14)을 통해 어떻게 전파되고 왜곡되는지를 예측한다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> 그림 2: 체류 시간 분포. 이 튜브 길이와 같은 흐름 시스템 구성 요소의 RTD는 트레이서의 펄스를 시스템에 입력하고 수집 된 분획으로 빠져 나올 때까지 "번짐"을 측정하여 측정됩니다. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

특정 세포 및 조직 기능은 기존의 배양 시스템에 의해 제대로 해결되지 않는 분에서 시간의 동적 시간 척도 내에서 작동합니다. 이 작업은 배양 배지를 세포 배양 모듈에 지속적으로 관류하고 다운스트림 모듈에서 분획하여이 규모의 역학을 측정 할 수있는 저비용 관류 생물 반응기 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 거의 전적으로 상업적으로 이용 가능한 부품으로 구성되며 병렬화되어 기존의 다중 웰 세포 배양 플레이트에서 동시에 독립적 인 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 단일 다중 채널 주사기 펌프와 최대 여섯 개의 배양물을 병렬로 관류하기 위해 수정된 분획 수집기만 있으면 되는 기본 설정을 조립하는 방법을 보여 줍니다. 모듈형 설계에 유용한 변형이 또한 제시되어 용질 펄스 또는 약동학적 유사 프로파일과 같은 제어된 자극 역학을 허용한다. 중요한 것은 용질 신호가 시스템을 통과할 때 용질 분산으로 인해 왜곡된다는 것입니다. 또한, MATLAB을 사용하여 트레이서를 사용하여 관류 설정의 구성 요소의 체류 시간 분포(RTD)를 측정하는 방법이 설명된다. RTD는 다중 구획 시스템의 흐름에 의해 용질 신호가 어떻게 왜곡되는지 계산하는 데 유용합니다. 이 시스템은 매우 견고하고 재현 가능하므로 기본 연구원은 전문 제조 시설 없이도 쉽게 채택 할 수 있습니다.

상기 프로토콜의 섹션 5로부터의 다중 배지 공급원을 갖는 관류 시스템은 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 활성화된 B 세포 (NF-κB) 전사 인자의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서에 의해 구동되는 리포터 유전자의 발현 동역학을 측정하기 위해 사용되었고, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 1.5 h 펄스에 반응하였다. HEK293 세포는 가우시아 루시퍼라아제 (GLuc)를 함유하는 유전자 작제물을 갖는 렌티바이러스 ?...

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Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

이 논문은 세포 과정에서 용질의 분비 및 흡수 속도의 역학을 측정하기 위한 저비용의 다채널 관류 세포 배양 시스템을 구축하고 운영하는 방법을 제시한다. 시스템은 또한 세포를 동적 자극 프로파일에 노출시킬 수 있다.

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

이 방법은 시간에 따라 분비 속도가 어떻게 변하는지, 그리고 세포가 시간에 따라 변화하는 고체 신호에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 비용으로 훈련이 거의 필요하지 않으며 새로운 실험에 profusion 시스템 설정을 적용 할 수 있다는 것입니다. 하나의 주사기를 배경 용액으로 채우고 첫 번째 주사기 펌프에로드하십시오.다른 주사기를 트레이서 용액으로 채우고 두 번째 주사기 펌프에 적재하십시오. 루어 커넥터를 사용하여 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결합니다. 스톱콕을 배경 용액으로 닫고 트레이서 용액을 열린 포트에서 떨어질 때까지 스톱콕에 펌핑하십시오.펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. 주사기 펌프 이동 막대가 주사기 플런저에 대해 위로 밀려 펌프가 시작될 때 즉시 흐름이 시작되도록하십시오. 트레이서 용액에 스톱콕을 닫고 모든 잔류 트레이서 용액이 열린 포트에서 플러시될 때까지 배경 용액을 스톱콕으로 펌핑합니다.펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. RTD 분석에 원하는 흐름 시스템 구성 요소를 설정합니다. 끝을 피펫 팁 디스펜서에 삽입하고 완전히 채워질 때까지 구성 요소를 통해 배경 용액을 펌핑하십시오.트레이서 용액의 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 백그라운드 솔루션에 대한 stopcock을 닫고 트레이서 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 동시에 분수 수집기를 시작하십시오.트레이서 솔루션의 흐름을 짧은 시간 동안 계속하여 트레이서의 임펄스 입력을 근사화합니다. RTD의 경우 시간당 1밀리리터의 유속으로 10분의 펄스 지속 시간을 사용하는 것이 좋습니다. 트레이서 용액 펄스 기간이 끝날 때 트레이서 용액 펌프를 정지하십시오.트레이서 솔루션에 대한 스톱콕을 빠르게 닫고 동일한 유속으로 배경 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 모든 트레이서가 시스템을 통과하여 수집된 분획으로 들어갈 때까지 배경 솔루션이 흐르고 분수를 수집하도록 허용하십시오. 멸균 조건 하에서, 바늘이 있는 마개를 바늘을 뽑아 웰 플레이트 배양물에 삽입한다.마개가 제자리에 놓인 후, 출구 바늘의 높이가 안정한 액체 수준을 결정함에 따라 관류를 위해 바늘을 원하는 높이로 낮 춥니 다. 바늘을 수컷 루어 캡으로 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 섭씨 37도에 설정된 인큐베이터에 전체 웰 플레이트를 보관하십시오. 관류에 사용할 두 개의 배지를 준비하여 먼저 분배 될 배지를 하나로, 다른 배지를 두 개로 표시하십시오.각 배양물이 관류되도록 한 개의 주사기를 배지로 채워 연금의 전체 지속 기간과 관류 시스템을 초기에 채우기에 충분한 부피를 더합니다. 두 번째 주사기를 중간 두 개로 채워 연금의 전체 기간을 지속하십시오. 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결하십시오.주사기를 스톱콕에 연결하기 위한 튜빙의 길이가 필요할 수 있다. 중간 하나에 대한 스톱콕을 닫고 열린 포트에서 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 중간 매체 두 개를 스톱콕에 분배하여 스톱콕을 준비하십시오. 그런 다음 중간 두 개에 대한 스톱콕을 닫고 모든 잔류 매체 두 개가 열린 포트에서 플러시 될 때까지 매체 하나를 스톱콕에 분배하십시오.암-헛간 루어 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 개방형 스톱콕 포트에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 있는 미늘 루어 커넥터에 남성을 삽입합니다. 상류 튜브가 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지 하나를 분배하고 앞서 입증된 바와 같이 하류 튜빙의 준비를 진행한다.수컷 투 바브 루어 커넥터를 다운스트림 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 암 루어 캡으로 캡핑합니다. 준비된 모든 튜브, 주사기 및 웰 플레이트를 관류에 사용할 인큐베이터로 조심스럽게 가져 오십시오. 주사기 펌프와 분획 수집기를 인큐베이터 근처의 원하는 위치에 놓습니다.주사기 펌프를 인큐베이터 위 또는 근처에 놓고 분획 수집기를 포트 근처의 인큐베이터 옆에 놓습니다. 주사기를 펌프에 적재하십시오. 모든 상류 및 하류 튜브의 뚜껑이 덮인 끝을 함께 묶어서 인큐베이터 외부에서 포트를 통해 내부로 밀어 넣으십시오.다운스트림 튜브의 열린 끝을 분수 컬렉터의 다중 헤드 디스펜서의 분배 피펫 팁에 삽입합니다. 인큐베이터 내부에서, 흐르는 매체가 열과 이산화탄소를 받을 수 있는 튜브의 길이를 최대화하기 위해 상류 튜브의 느슨한 부분을 인큐베이터로 가능한 한 많이 당겨 넣는다. 각 꽂힌 우물에 대해 바늘과 상류 및 하류 튜브의 뚜껑을 신속하게 풀고 루어 커넥터와 함께 부착하십시오.모든 부품이 연결되면 주사기 펌프를 비교적 빠른 속도로 간단히 실행하여 모든 스트림이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오. 이 시점에서, 매체로 가득 찬 다운스트림 튜브로 실험을 시작하고자 하는 경우, 모두가 채워질 때까지 펌프를 계속 가동하고, 그렇지 않으면 펌프를 정지시킨다. 중간 하나에 대한 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오.배지 공급원을 변경해야 할 때, 중간 공급원을 위한 주사기 펌프를 신속하게 정지시키십시오. 스톱콕을 중간 크기로 닫은 상태로 돌리고 중간 두 개의 주사기 펌프를 시작하십시오. 나중에 원하는 경우 소스를 다시 중간 소스로 전환하십시오.원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다. 두 개의 RTD 실험에서 분획의 트레이서 농도를 측정하고 데이터 MATLAB 스크립트에서 RTD에 입력하여 두 개의 RTD를 생성했습니다. 단일 튜브와 직렬로 연결된 여러 개의 튜브 조각이 단일 축 분산 모델에 의해 잘 맞고 관류 된 48 웰 플레이트를 라인에 추가하면 무시할 수있는 편차가 발생하여 한 미터 튜브 RTD와 전체 시스템의 RTD가 축 분산 기능에 맞을 수 있습니다.불량한 모델 적합성의 예는 1미터 튜브 RTD 데이터에 적합된 축방향 분산 모델을 사용하여 입증되었으며 데이터와 함께 플롯팅되었습니다. 초기 파라미터 추측은 타우가 용적 유량으로 나눈 관류 시스템 부피와 거의 동일한 양호한 모델 핏을 생성하도록 변경되었습니다. TNF-알파의 90분 펄스는 시스템에 대한 입력 신호로서 정의되었고, 웰 플레이트 입구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 일미터 튜빙 RTD와 컨볼링되었다.입력 신호는 또한 수집된 분획에서 시스템의 출구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 전체 시스템의 RTD와 컨볼링되었다. HEK 293 세포는 NF-카파B 반응 요소를 함유하는 프로모터에 의해 구동되는 GLuc를 분비하도록 조작되었다. 실험은 TNF-알파 노출 후 NF-카파B에 의해 구동되는 GLuc 발현의 유의한 발현 증가 및 느린 감소를 밝혀냈다.시스템의 변형은 신호를 입력하고 세포를 제약 후 결합 용질 프로파일에 노출시킬 필요가없는 실험을위한 간단한 설정을 포함하여 첨부 된 논문에 설명되어 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...