Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Denne forskningen ble utført med støtte under Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 og T32 GM008339 fra National Institutes of Health.

1. Klargjør deler for brønnplateperfusjon
<ol><li>Forbered slangen<ol>
<li>Skjær to lengder silikonrør (1,6 mm indre diameter) for hver cellekultur som skal perfunderes. Sørg for at stykket som brukes som oppstrøms slange er langt nok til å nå fra sprøytepumpen til cellekulturen inne i inkubatoren, og at nedstrømsstykket kan nå fra cellekulturen til den lengste utvidede posisjonen til fraksjonssamleren.</li>
		<li>Gi hvert stykke rør en unik etikett på begge ender med merket tape.</li>
	</...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Dette arbeidet beskriver samlingen og driften av et perfusjonscellekultursystem med flere mediumkilder demonstrert med et spesifikt eksempel der dynamikken til NF-κB-drevet genuttrykk som respons på en forbigående puls av TNF-α ble målt. RTD-ene til perfusjonssystemkomponentene ble målt og modellert, og signalkonvolusjon ble brukt til å forutsi både cellens eksponering for TNF-α puls og TNF-α fordeling i de oppsamlede avløpsvannmediumfraksjonene. Cellene ble utsatt for puls og fraksjoner ble samlet i 40 timer,...

Mange viktige biologiske prosesser forekommer i celle- og vevskulturer på tidsskalaen fra minutter til timer 1,2,3. Mens noen av disse fenomenene kan observeres og registreres på en automatisert måte ved hjelp av time-lapse mikroskopi4, bioluminescens1 eller andre metoder, utføres eksperimenter som involverer innsamling av kultur supernatantprøver for kjemisk analyse ofte manuelt i statiske cellekulturer. Manuell prøvetaking begrenser muligheten for visse studier på grunn av ulempen med hyppige eller ettertidsprøver. Ytterligere mangler ved statiske kulturmetoder inkluderer eksperimenter som involverer kontrollerte, forbigående eksponeringer for kjemiske stimuli. I statiske kulturer må stimuli legges til og fjernes manuelt, og stimulusprofiler er begrenset til trinnendringer over tid, mens mediumendringer også legger til og fjerner andre mediumkomponenter, noe som kan påvirke celler på en ukontrollert måte5. Fluidiske systemer kan overvinne disse utfordringene, men eksisterende enheter utgjør andre utfordringer. Mikrofluidiske enheter kommer med de uoverkommelige kostnadene ved spesialutstyr og opplæring for å produsere og bruke, krever mikroanalytiske metoder for å behandle prøver, og celler er vanskelige å gjenopprette fra enhetene etter perfusjon6. Få makrofluidiske systemer er opprettet for de typer eksperimenter som er beskrevet her 7,8,9,10, og de er bygget av flere tilpassede deler laget internt og krever flere pumper eller fraksjonssamlere. Videre er forfatterne ikke klar over noen kommersielt tilgjengelige makrofluidiske perfusjonscellekultursystemer annet enn omrørte tankbioreaktorer for suspensjonskultur, som er nyttige for bioproduksjon, men er ikke designet for modellering og studier av fysiologi.
Forfatterne rapporterte tidligere om utformingen av et billig perfusjonsbioreaktorsystem som består nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler11. Basisversjonen av systemet gjør det mulig å oppbevare flere kulturer i en brønnplate i en CO2-inkubator og kontinuerlig perfunderes med medium fra en sprøytepumpe, mens avløpsvannmediumstrømmene fra kulturene automatisk fraksjoneres i prøver over tid ved hjelp av en fraksjonssamler med en tilpasset modifikasjon. Dermed muliggjør dette systemet automatisert prøvetaking av kulturmedium supernatant og kontinuerlig løsemiddelinngang til kulturene over tid. Systemet er makrofluidisk og modulært og kan enkelt endres for å møte behovene til nye eksperimentdesign.
Det overordnede målet med metoden som presenteres her er å konstruere, karakterisere og bruke et perfusjonscellekultursystem som muliggjør eksperimenter der sekresjonen eller absorpsjonshastighetene til stoffer av celler over tid måles, og / eller celler blir utsatt for presise, forbigående løsemiddelsignaler. Denne videoartikkelen forklarer hvordan du monterer baseoppsettet, som er i stand til å perfusere opptil seks cellekulturer samtidig ved hjelp av en enkelt sprøytepumpe og modifisert fraksjonssamler. To nyttige varianter på basesystemet som benytter seg av ekstra pumper og deler for å muliggjøre eksperimenter som utsetter celler for forbigående løsemiddelkonsentrasjonssignaler, inkludert korte pulser og farmakokinetisk-lignende profiler12, presenteres også, vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figur 1: Tre variasjoner på perfusjonssystemdesignet. (Øverst) Det grunnleggende perfusjonssystemet. (Midten) Perfusjonssystemet med stoppekran for flere middels kilder. (Nederst) Perfusjonssystemet med en omrørt tank for å etterligne et godt blandet distribusjonsvolum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
På grunn av spredning og diffusjon i strømmen blir løsemiddelsignalene forvrengt eller "smurt" når de beveger seg gjennom strømningssystemet. Denne forvrengningen kan kvantifiseres ved bruk av oppholdstidsfordelinger (RTD)13. Denne artikkelen forklarer hvordan du utfører sporingseksperimenter på komponenter i perfusjonssystemet (figur 2), og gir MATLAB-skript for å generere RTD-er fra målte data. En detaljert forklaring på denne analysen finnes i forfatternes forrige artikkel11. Ytterligere MATLAB-skript tilpasser passende funksjoner til RTD-ene og trekker ut fysiske parametere, og utfører signalkonvolusjon ved hjelp av RTD-er for å forutsi hvordan løsemiddelsignalinngang fra brukeren vil forplante og forvrenge gjennom perfusjonssystemet14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figur 2: Fordeling av oppholdstid. RTD-ene til strømningssystemkomponenter, for eksempel denne lengden på slangen, måles ved å legge inn en puls av tracer til systemet og måle hvordan den "smører" når den går ut i de innsamlede fraksjonene. Dette tallet er modifisert fra Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Visse celle- og vevsfunksjoner opererer innenfor den dynamiske tidsskalaen minutter til timer som er dårlig løst av konvensjonelle kultursystemer. Dette arbeidet har utviklet et billig perfusjonsbioreaktorsystem som gjør at kulturmediet kontinuerlig kan perfunderes i en cellekulturmodul og fraksjoneres i en nedstrømsmodul for å måle dynamikk på denne skalaen. Systemet er konstruert nesten utelukkende av kommersielt tilgjengelige deler og kan parallelliseres for å utføre uavhengige eksperimenter i konvensjonelle flerbrønnscellekulturplater samtidig. Denne videoartikkelen viser hvordan du monterer baseoppsettet, som bare krever en enkelt flerkanals sprøytepumpe og en modifisert fraksjonssamler for å perfusere opptil seks kulturer parallelt. Nyttige varianter på den modulære designen presenteres også som muliggjør kontrollert stimuleringsdynamikk, for eksempel løsemiddelpulser eller farmakokinetisk-lignende profiler. Det er viktig at når løsemiddelsignaler beveger seg gjennom systemet, blir de forvrengt på grunn av løsemiddelspredning. Videre beskrives en metode for å måle oppholdstidsfordelingene (RTD) av komponentene i perfusjonsoppsettet med en tracer ved bruk av MATLAB. RTD-er er nyttige for å beregne hvordan løsemiddelsignaler forvrenges av strømmen i flerromssystemet. Dette systemet er svært robust og reproduserbart, slik at grunnleggende forskere enkelt kan ta det i bruk uten behov for spesialiserte fabrikasjonsanlegg.

Perfusjonssystemet med flere mediumkilder fra seksjon 5 i protokollen ble brukt til å måle ekspresjonsdynamikken til et reportergen drevet av kjernefaktoren kappa-lyskjedeforsterker av aktiverte B-celler (NF-κB) transkripsjonsfaktor i human embryonal nyre 293 (HEK293) celler som svar på en 1,5 timers puls av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler ble stabilt transdusert ved hjelp av lentivirale vektorer med en genkonstruksjon som inneholdt Gaussia luciferase (GLuc), drevet av en promotor kalt NFKB som inneho...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Denne artikkelen presenterer en metode for å konstruere og drive et billig, flerkanals perfusjonscellekultursystem for å måle dynamikken i sekresjon og absorpsjonshastigheter av løsemidler i cellulære prosesser. Systemet kan også utsette celler for dynamiske stimulusprofiler.

Multi-Stream perfusjonsbioreaktor integrert med utløpsfraksjonering for dynamisk cellekultur

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Denne metoden bidrar til å forstå hvordan sekresjonshastighetene endres med tiden og hvordan celler reagerer på tidsvarierende faste signaler. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den lave prisen krever lite trening og profusjonssystemoppsettet kan tilpasses for nye eksperimenter. Begynn med å fylle en sprøyte med en bakgrunnsløsning og legg den inn i den første sprøytepumpen.Fyll en annen sprøyte med traceroppløsning og legg den inn i den andre sprøytepumpen. Koble begge sprøytene til to av de tre portene på en fireveis stoppekran ved hjelp av luerkontakter. Lukk stoppekranen til bakgrunnsløsningen og pump sporingsoppløsningen inn i stoppekranen til den drypper ut den åpne porten.Stopp pumpen og ikke juster sprøyten ytterligere. Forsikre deg om at sprøytepumpens bevegelige stang skyves opp mot sprøytestemplene slik at strømmen starter umiddelbart når pumpen startes. Lukk stoppekranen til sporingsoppløsningen og pump bakgrunnsoppløsningen inn i stoppekranen til all gjenværende sporstoffløsning er skyllet ut av den åpne porten.Stopp pumpen og ikke juster sprøyten ytterligere. Definer ønsket strømningssystemkomponent for RTD-analyse. Sett enden inn i en pipettespissdispenser og pump bakgrunnsløsningen gjennom komponenten til den er helt fylt.Still pumpen for sporingsløsningen til ønsket strømningshastighet. Lukk stoppekranen til bakgrunnsløsningen og start strømmen av sporingsløsningen. Start samtidig brøksamleren.Fortsett strømmen av tracer-løsning i en kort periode for å tilnærme en impulsinngang fra sporstoffet. En pulsvarighet på 10 minutter anbefales for RTD-er med en strømningshastighet på en milliliter per time. Stopp sporingsløsningspumpen på slutten av pulsperioden for traceroppløsningen.Lukk stoppekranen raskt til tracerløsningen og start strømmen av bakgrunnsløsningen med samme strømningshastighet. La bakgrunnsløsningen flyte og samle fraksjoner til hele traceren har passert gjennom systemet og inn i de innsamlede brøkene. Under sterile forhold, sett proppene med nåler inn i brønnplatekulturene med nålene trukket opp.Etter at proppen er på plass, senk nålene til ønsket høyde for perfusjon, da høyden på utløpsnålen bestemmer det stabile væskenivået. Cap nålene med mannlige luer caps og hold hele brønnplaten i en inkubator satt til 37 grader Celsius til bruk. Forbered de to mediene som skal brukes til perfusjon, og merk mediet som vil bli dispensert først som ett og det andre mediet to.For hver kultur som skal perfunderes, fyll en sprøyte med middels en for å vare hele varigheten av dispensasjonen pluss nok volum til å fylle perfusjonssystemet først. Fyll en annen sprøyte med middels to for å vare hele dispensasjonens varighet. Koble begge sprøytene til to av de tre portene på en fireveis stoppekran.En lengde på slangen for å koble sprøytene til stoppekranene kan være nødvendig. Forbered stoppekranene ved å lukke stoppekranen for medium en og dispensere medium to inn i stoppekranen til den bare begynner å dryppe ut den åpne porten. Lukk deretter stoppekranen for medium to og dispenser medium en inn i stoppekranen til alle gjenværende medium to er spylt ut av den åpne porten.Fest oppstrøms slangen til den åpne stoppekranporten ved hjelp av en hunn til barb luer-kontakt. Sett inn en hann til barb luer kontakt på den andre enden av røret. Dispenser medium én fra sprøyten til oppstrøms slangen er fylt med medium og fortsett med tilberedning av nedstrøms slanger som vist tidligere.Sett inn en hann til barb luer-kontakt i den ene enden av slangen nedstrøms og hett den med en kvinnelig luerhette. Ta forsiktig alle forberedte rør, sprøyter og brønnplaten til inkubatoren som skal brukes til perfusjon. Plasser sprøytepumpen og fraksjonssamleren på de ønskede stedene i nærheten av inkubatoren.Plasser sprøytepumpen på toppen av eller i nærheten av inkubatoren og plasser fraksjonssamleren ved siden av inkubatoren nær porten. Legg sprøytene inn i pumpen. Bunt sammen de kappede endene av alle oppstrøms og nedstrøms rør og skyv dem fra utsiden av inkubatoren til innsiden gjennom porten.Sett de åpne endene av rørene nedstrøms inn i pipettespissene på fraksjonssamlerens flerhodedispenser. Inne i inkubatoren, trekk så mye slakk av oppstrømsrørene som mulig inn i inkubatoren for å maksimere lengden på slangen gjennom hvilken det flytende mediet kan motta varme og karbondioksid. For hver plugget brønn, fjern raskt nålene og oppstrøms og nedstrøms rør for den brønnen, og fest dem deretter sammen med luerkontaktene.Når alle delene er koblet til, kjører du sprøytepumpen kort med relativt høy hastighet for å sikre at alle strømmer flyter riktig. På dette tidspunktet, hvis det er ønskelig å starte eksperimentet med nedstrømsrørene fulle av mediet, fortsett å kjøre pumpen til alle er fylt, ellers stopp pumpen. Still inn sprøytepumpens strømningshastighet for middels en og hyppigheten av fraksjonsoppsamling og start begge maskinene samtidig for å starte eksperimentet.Når mediumkilden må skiftes, må du raskt stoppe sprøytepumpen for middels en. Vri stoppekranen lukket til middels en og start sprøytepumpen for middels to. Hvis ønskelig senere, bytt kilden tilbake til middels en på samme måte.Samle brøker for ønsket eksperimentvarighet. Sporingskonsentrasjonene i fraksjonene fra to RTD-eksperimenter ble målt og lagt inn i RTD fra data MATLAB-skript for å produsere de to RTDene. Enkeltrør og flere rørstykker i serie passer godt ved en enkelt aksial dispersjonsmodell og tilsetning av en perfusert 48 brønnplate i linje forårsaket ubetydelig avvik slik at både en meter rør RTD og hele systemets RTD passer med aksiale dispersjonsfunksjoner.Et eksempel på dårlig modelltilpasning ble demonstrert ved hjelp av den aksiale dispersjonsmodellen montert på RTD-dataene fra en meter rør og ble plottet sammen med dataene. De opprinnelige parametergjettingene ble endret for å produsere en god modelltilpasning der tau var omtrent lik perfusjonssystemvolumet dividert med dets volumetriske strømningshastighet. En 90 minutters puls av TNF-alfa ble definert som inngangssignalet til systemet og ble konvolvert med en meter rør RTD for å bestemme TNF-alfa-signalet ved brønnplateinnløpet.Inngangssignalet ble også konvolvert med RTD for hele systemet for å bestemme TNF-alfa-signalet ved utløpet av systemet i de innsamlede fraksjonene. HEK 293-celler ble konstruert for å skille ut GLuc drevet av en promotor som inneholder NF-kappaB-responselementet. Eksperimentet viste en signifikant uttrykksøkning og langsom reduksjon i GLuc-uttrykk drevet av NF-kappaB etter TNF-alfa-eksponering.Variasjoner av systemet er beskrevet i medfølgende papir, inkludert et enklere oppsett for eksperimenter som ikke krever inntasting av signaler og eksponering av celler for pharma-hu bindende løsemiddelprofiler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregation og bioreaktor Modning for Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikasjon og validering av en Organ-on-chip System med integrerte elektrodene direkte kvantifisere Transendothelial elektrisk motstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Co transplantasjon av menneskelig Ovarian vev med konstruert endotelceller: en celle-basert strategi kombinere akselerert perfusjon med direkte Paracrine levering

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggingen av et flerlags Mesenchymal stamceller ark med en 3D dynamisk kultur-systemet

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

En Mikrovæskebasert plattform for stimulerende chondrocytes med dynamisk kompresjon

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Innkjøp og perfusjon-decellularisering av svin vaskulariserte klaffer i en tilpasset perfusjonsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Innkjøp og decellularisering av rotte bakben ved bruk av en ex vivo perfusjonsbasert bioreaktor for vaskularisert kompositt allotransplantasjon

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...