Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Это исследование было проведено при поддержке гранта Nos. R01EB012521, R01EB028782 и T32 GM008339 от Национальных институтов здравоохранения.

1. Подготовьте детали для перфузии плиты скважины
<ol><li>Подготовка трубок<ol>
<li>Нарежьте две длины силиконовых трубок (внутренний диаметр 1,6 мм) для каждой культуры клеток, подлежащей перфузии. Убедитесь, что кусок, используемый в качестве трубки для восходящей трубы, достаточно ...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

В данной работе описывается сборка и функционирование системы перфузионной клеточной культуры с несколькими источниками среды, продемонстрированной на конкретном примере, в котором измерялась динамика экспрессии генов, управляемых NF-κB, в ответ на переходный импульс TNF-α. RtD компонент...

Многие важные биологические процессы происходят в клеточных и тканевых культурах во временной шкале от минут до часов 1,2,3. Хотя некоторые из этих явлений могут наблюдаться и регистрироваться автоматизированным способом с использованием покадровой микроскопии4, биолюминесценции1 или других методов, эксперименты, включающие сбор образцов супернатантов культуры для химического анализа, часто выполняются вручную в статических клеточных культурах. Ручной отбор проб ограничивает осуществимость некоторых исследований из-за неудобств, связанных с частыми или нерабочими периодами отбора проб. Другие недостатки методов статического культивирования включают эксперименты, включающие контролируемое, преходящее воздействие химических стимулов. В статических культурах стимулы должны добавляться и удаляться вручную, а профили стимулов ограничены ступенчатыми изменениями с течением времени, в то время как изменения среды также добавляют и удаляют другие компоненты среды, которые могут влиять на клетки неконтролируемым образом5. Жидкостные системы могут преодолеть эти проблемы, но существующие устройства создают другие проблемы. Микрофлюидные устройства сопряжены с непомерно высокими затратами на специализированное оборудование и обучение для производства и использования, требуют микроаналитических методов для обработки образцов, а клетки трудно восстановить из устройств после перфузии6. Несколько макрофлюидных систем были созданы для типов экспериментов, описанных здесь 7,8,9,10, и они построены из нескольких пользовательских деталей, изготовленных собственными силами, и требуют нескольких насосов или дробных коллекторов. Кроме того, авторам не известно о каких-либо коммерчески доступных макрофлюидных перфузионных клеточных культурах, кроме перемешиваемых резервуарных биореакторов для культуры суспензии, которые полезны для биопроизводства, хотя и не предназначены для моделирования и изучения физиологии.
Авторы ранее сообщали о конструкции недорогой перфузионной биореакторной системы, состоящей почти полностью из коммерчески доступных частей11. Базовая версия системы позволяет хранить несколько культур в пластине скважины в инкубаторе CO2 и непрерывно перфузить средой из шприцевого насоса, в то время как потоки сточных вод из культур автоматически фракционируются в образцы с течением времени с использованием дробного коллектора с пользовательской модификацией. Таким образом, эта система позволяет осуществлять автоматизированный отбор проб супернатанта питательной среды и непрерывный ввод растворенного вещества в культуры с течением времени. Система является макрофлюидной и модульной и может быть легко модифицирована для удовлетворения потребностей новых экспериментальных конструкций.
Общая цель метода, представленного здесь, состоит в том, чтобы построить, охарактеризовать и использовать систему перфузионных клеточных культур, которая позволяет проводить эксперименты, в которых измеряются скорости секреции или поглощения веществ клетками с течением времени и/или клетки подвергаются воздействию точных, переходных сигналов растворенного вещества. В этой видеостатье объясняется, как собрать базовую установку, которая способна перфузить до шести клеточных культур одновременно с помощью одного шприцевого насоса и модифицированного дробового коллектора. Два полезных варианта базовой системы, которые используют дополнительные насосы и детали для проведения экспериментов, которые подвергают клетки переходным сигналам концентрации растворенного вещества, включая короткие импульсы и фармакокинетические профили12, также представлены на фиг.1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Рисунок 1: Три варианта конструкции перфузионной системы. (Вверху) Базовая перфузионная система. (Средний) Перфузионная система с запорным краном для нескольких средних источников. (Внизу) Перфузионная система с перемешиваемым резервуаром для имитации хорошо смешанного объема распределения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Из-за дисперсии и диффузии внутри потока сигналы растворенного вещества искажаются или «размазываются» по мере их прохождения через систему потока. Это искажение может быть количественно определено с помощью распределений времени пребывания (RTD)13. В этой статье объясняется, как проводить трассирующие эксперименты на компонентах перфузионной системы (рисунок 2), и приводятся сценарии MATLAB для генерации RTD из измеренных данных. Подробное объяснение этого анализа можно найти в предыдущей статье авторов11. Дополнительные скрипты MATLAB подгоняют соответствующие функции к RTD и извлекают физические параметры, а также выполняют свертку сигнала с использованием RTD для прогнозирования того, как ввод сигнала растворенного вещества пользователем будет распространяться и искажаться через перфузионную систему14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Рисунок 2: Распределение времени проживания. RTD компонентов проточной системы, такие как эта длина трубки, измеряются путем ввода импульса индикатора в систему и измерения того, как он «размазывается» к тому времени, когда он выходит в собранные фракции. Эта цифра была изменена по сравнению с Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Некоторые клеточные и тканевые функции работают в динамической шкале времени от минут до часов, которые плохо разрешаются обычными системами культивирования. В рамках этой работы была разработана недорогая система перфузионного биореактора, которая позволяет непрерывно перфузить культуральную среду в модуль клеточной культуры и фракционировать в последующем модуле для измерения динамики в этом масштабе. Система построена почти полностью из коммерчески доступных частей и может быть распараллелена для проведения независимых экспериментов в обычных многоскважинных пластинах клеточной культуры одновременно. В этой видеостатье показано, как собрать базовую установку, для параллельной обработки до шести культур требуется только один многоканальный шприцевой насос и модифицированный дробовой коллектор. Также представлены полезные варианты модульной конструкции, которые позволяют контролировать динамику стимуляции, такую как импульсы растворенного вещества или фармакокинетические профили. Важно отметить, что, поскольку сигналы растворенного вещества проходят через систему, они искажаются из-за дисперсии растворенного вещества. Кроме того, описан метод измерения распределения времени пребывания (RTD) компонентов перфузионной установки с помощью индикатора с использованием MATLAB. RTD полезны для расчета того, как сигналы растворенного вещества искажаются потоком в многокамерной системе. Эта система очень надежна и воспроизводима, поэтому фундаментальные исследователи могут легко принять ее без необходимости в специализированных производственных мощностях.

Перфузионная система с несколькими источниками среды из раздела 5 протокола использовалась для измерения динамики экспрессии репортерного гена, управляемого ядерным фактором каппа-лёгкой цепью-энхансером активированных В-клеток (NF-κB) транскрипционного фактора в клетках эмбриональн...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

В данной работе представлен метод построения и эксплуатации недорогой многоканальной перфузионной системы клеточных культур для измерения динамики секреции и скорости всасывания растворенных веществ в клеточных процессах. Система также может подвергать клетки динамическим профилям стимулов.

Многопоточный перфузионный биореактор, интегрированный с фракционированием на выходе для динамической клеточной культуры

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Этот метод помогает понять, как скорость секреции изменяется со временем и как клетки реагируют на изменяющиеся во времени твердые сигналы. Основные преимущества этой техники заключаются в том, что она невысока, требует небольшой подготовки, а настройка системы изобилия может быть адаптирована для новых экспериментов. Начните с заполнения одного шприца фоновым раствором и загрузите его в первый шприцевой насос.Наполните другой шприц трассирующим раствором и загрузите его во второй шприцевой насос. Подключите оба шприца к двум из трех портов четырехходового запорного крана с помощью разъемов luer. Закройте запорный кран к фоновому раствору и закачивайте следящий раствор в запорный кран до тех пор, пока он не выпадет из открытого порта.Остановите насос и не регулируйте шприц дальше. Убедитесь, что движущаяся штанга шприцевых насосов прижата к плунжерам шприца, чтобы поток начался сразу же после запуска насоса. Закройте запорный кран к трассирующему раствору и перекачивайте фоновый раствор в запорный кран до тех пор, пока весь остаточный раствор индикатора не будет смыт из открытого порта.Остановите насос и не регулируйте шприц дальше. Настройте компонент системы потока, необходимый для анализа RTD. Вставьте конец в дозатор наконечника пипетки и прокачайте фоновый раствор через компонент до тех пор, пока он не будет полностью заполнен.Установите насос для трассирующего раствора на желаемую скорость потока. Закройте запорный кран к фоновому раствору и запустите поток трассирующего раствора. Одновременно запускаем дробный коллектор.Продолжайте поток индикаторного раствора в течение короткого периода времени, чтобы приблизить импульсный вход индикатора. Длительность импульса 10 минут рекомендуется для RTD при скорости потока один миллилитр в час. Остановите насос индикаторного раствора в конце импульсного периода индикаторного раствора.Быстро закройте запорный кран к трассирующему раствору и запустите поток фонового раствора с той же скоростью потока. Позвольте фоновому раствору течь и собирать фракции до тех пор, пока весь индикатор не пройдет через систему и не попадет в собранные фракции. В стерильных условиях вводят пробки с иглами в колодец пластинчатых культур с подтянутыми вверх иглами.После того, как пробка будет на месте, опустите иглы на нужную высоту для перфузии, так как высота выходной иглы определяет стабильный уровень жидкости. Закройте иглы мужскими колпачками и держите всю пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию до использования. Подготовьте два носителя для использования для перфузии, пометив среду, которая будет распределяться первой, как одну, а другую среду две.Чтобы каждая культура была перфузирована, заполните один шприц средой, чтобы он продержался всю продолжительность его дозирования плюс достаточный объем, чтобы первоначально заполнить перфузионную систему. Наполните второй шприц средой два, чтобы продержаться весь период его дозирования. Подключите оба шприца к двум из трех портов четырехходового запорного крана.Может потребоваться длина трубки для подключения шприцев к запорным кранам. Подготовьте запорные краны, закрыв запорный кран для среднего одного и дозируя средний второй в запорный кран, пока он не начнет капать из открытого порта. Затем закройте запорный кран для среднего два и распределите средний один в запорный кран до тех пор, пока все оставшиеся среды два не будут смыты из открытого порта.Прикрепите трубку вверх по течению к открытому порту запорного крана с помощью гнездового разъема для барбера. Вставьте штекер в разъем barb luer на другом конце трубки. Дозируйте среду один из шприца до тех пор, пока трубка вверх по течению не будет заполнена средой, и приступайте к приготовлению трубки ниже по течению, как показано ранее.Вставьте штекер для барб-луера в один конец трубки и закройте его женским колпачком luer. Аккуратно поднесите все подготовленные трубки, шприцы и плиту колодца в инкубатор, который будет использоваться для перфузии. Поместите шприцевой насос и дробной коллектор в нужных местах рядом с инкубатором.Поместите шприцевой насос сверху или рядом с инкубатором и поместите дробный коллектор рядом с инкубатором рядом с портом. Загрузите шприцы в насос. Соедините вместе закрытые концы всех труб вверх и вниз по течению и протолкните их с внешней стороны инкубатора внутрь через порт.Вставьте открытые концы последующих трубок в наконечники дозирующих пипеток многоголовочного дозатора коллектора фракций. Внутри инкубатора потяните как можно больше слабины трубок вверх по течению в инкубатор, чтобы максимизировать длину трубки, через которую текущая среда может получать тепло и углекислый газ. Для каждого закупоренного колодца быстро отсоедините иглы и трубки вверх и вниз по течению для этого колодца, а затем прикрепите их вместе с разъемами luer.После того, как все части соединены, кратковременно запустите шприцевой насос на относительно высокой скорости, чтобы убедиться, что все потоки текут должным образом. На этом этапе, если есть желание начать эксперимент с нижестоящими трубками, полными среды, продолжайте работу насоса до тех пор, пока все не будут заполнены, в противном случае остановите насос. Установите расход шприцевого насоса для среднего и частоту сбора фракций и запустите обе машины одновременно, чтобы начать эксперимент.Когда источник среды необходимо заменить, быстро остановите шприцевой насос для среднего. Поверните закрытый запорный кран на средний и запустите шприцевой насос для среднего двух. При желании позже переключите источник обратно на средний аналогичным образом.Собирайте дроби на нужную продолжительность эксперимента. Концентрации индикаторов во фракциях из двух экспериментов с RTD были измерены и введены в RTD из скрипта MATLAB для получения двух RTD. Одиночные трубки и несколько кусков трубки последовательно подходят по одной осевой дисперсионной модели, а добавление перфузированной пластины из 48 скважин в линию вызвало незначительное отклонение, позволяющее как одномерному трубчатому RTD, так и RTD всей системы соответствовать функциям осевой дисперсии.Пример плохого соответствия модели был продемонстрирован с использованием модели осевой дисперсии, установленной на данных RTD одной метровой трубки, и был построен вместе с данными. Первоначальные догадки параметров были изменены, чтобы получить хорошую модель соответствия, где тау был примерно равен объему перфузионной системы, деленному на его объемный расход. 90-минутный импульс TNF-альфа был определен как входной сигнал в систему и был свёрнут с одномерной трубкой RTD для определения сигнала TNF-альфа на входе плиты скважины.Входной сигнал также сворачивался с RTD всей системы для определения сигнала TNF-альфа на выходе из системы в собранных фракциях. Клетки HEK 293 были спроектированы для секреции GLuc, приводимого промотором, содержащим элемент ответа NF-kappaB. Эксперимент выявил значительное увеличение экспрессии и медленное снижение экспрессии GLuc, обусловленное NF-kappaB после воздействия TNF-альфа.Вариации системы описаны в сопроводительной статье, включая более простую настройку для экспериментов, которые не требуют ввода сигналов и воздействия на клетки соединительных профилей растворенных веществ pharma-hu.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Совместное трансплантация человеческих тканей яичника с инженерии эндотелиальных клеток: несамостоятельных Cell-based стратегии ускоренного перфузии с паракринными прямой доставки

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Микрофлюидная платформа для стимулирования хондроцитов с динамическим сжатием

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Тракция Микроскопия интегрирована с микрофлюиди для хемотаксической коллективной миграции

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Закупка и перфузионно-децеллюляризация васкуляризованных лоскутов свиней в индивидуальном перфузионном биореакторе

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Закупка и децеллюляризация задних конечностей крыс с использованием биореактора ex vivo на основе перфузии для васкуляризированной композитной аллотрансплантации

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...