Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
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Esta investigación se llevó a cabo con el apoyo de grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 y T32 GM008339 de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Prepare las piezas para la perfusión de la placa del pozo
<ol><li>Preparar tubos<ol>
<li>Cortar dos longitudes de tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior) para cada cultivo celular a perfundir. Asegúrese de que la pieza utilizada como tubo aguas arriba sea lo suficientemente larga como para llegar desde la bomba de la jeringa hasta el cultivo celular dentro de la incubadora, y que la pieza aguas abajo pueda llegar desde el cultivo celular hasta la posición extendida más lejana del colecto...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. 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(117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Este trabajo describe el ensamblaje y operación de un sistema de cultivo celular de perfusión con múltiples fuentes de medios demostradas con un ejemplo específico en el que se midió la dinámica de la expresión génica impulsada por NF-κB en respuesta a un pulso transitorio de TNF-α. Se midieron y modelaron los RTD de los componentes del sistema de perfusión, y se utilizó la convolución de la señal para predecir tanto la exposición de las células al pulso TNF-α como la distribución TNF-α en las fraccion...

Muchos procesos biológicos importantes ocurren en cultivos celulares y tisulares en la escala de tiempo de minutos a horas 1,2,3. Si bien algunos de estos fenómenos pueden observarse y registrarse de manera automatizada utilizando microscopía de lapso de tiempo4, bioluminiscencia1 u otros métodos, los experimentos que involucran la recolección de muestras de sobrenadantes de cultivo para análisis químico a menudo se realizan manualmente en cultivos celulares estáticos. El muestreo manual limita la viabilidad de ciertos estudios debido a la inconveniencia de los puntos de tiempo de muestreo frecuentes o fuera del horario laboral. Otras deficiencias de los métodos de cultivo estático incluyen experimentos que involucran exposiciones controladas y transitorias a estímulos químicos. En los cultivos estáticos, los estímulos deben agregarse y eliminarse manualmente, y los perfiles de estímulo se limitan a los cambios de paso a lo largo del tiempo, mientras que los cambios de medio también agregan y eliminan otros componentes del medio, que pueden afectar a las células de manera incontrolada5. Los sistemas fluídicos pueden superar estos desafíos, pero los dispositivos existentes plantean otros desafíos. Los dispositivos microfluídicos vienen con los costos prohibitivos de equipos especializados y capacitación para producir y usar, requieren métodos microanalíticos para procesar muestras y las células son difíciles de recuperar de los dispositivos después de la perfusión6. Se han creado pocos sistemas macrofluídicos para los tipos de experimentos descritos aquí 7,8,9,10, y están construidos con múltiples piezas personalizadas hechas internamente y requieren múltiples bombas o colectores de fracción. Además, los autores no tienen conocimiento de ningún sistema de cultivo de células de perfusión macrofluídica disponible comercialmente que no sean biorreactores de tanque agitado para cultivo en suspensión, que son útiles para la biofabricación, aunque no están diseñados para modelar y estudiar la fisiología.
Los autores informaron previamente sobre el diseño de un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo compuesto casi en su totalidad por partes11 disponibles comercialmente. La versión base del sistema permite que múltiples cultivos en una placa de pozo se mantengan en una incubadora de CO2 y se perfundan continuamente con el medio de una bomba de jeringa, mientras que las corrientes de medios de efluentes de los cultivos se fraccionan automáticamente en muestras a lo largo del tiempo utilizando un colector de fracción con una modificación personalizada. Por lo tanto, este sistema permite el muestreo automatizado del sobrenadante del medio de cultivo y la entrada continua de solutos a los cultivos a lo largo del tiempo. El sistema es macrofluídico y modular y se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades de nuevos diseños de experimentos.
El objetivo general del método presentado aquí es construir, caracterizar y utilizar un sistema de cultivo celular de perfusión que permita experimentos en los que se midan las tasas de secreción o absorción de sustancias por parte de las células a lo largo del tiempo, y / o las células estén expuestas a señales de soluto precisas y transitorias. Este artículo en video explica cómo ensamblar la configuración de la base, que es capaz de perfundir hasta seis cultivos celulares simultáneamente utilizando una sola bomba de jeringa y un colector de fracción modificado. También se presentan dos variantes útiles en el sistema base que hacen uso de bombas y piezas adicionales para permitir experimentos que exponen a las células a señales transitorias de concentración de solutos, incluidos pulsos breves y perfiles farmacocinéticos12, que se muestran en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figura 1: Tres variaciones en el diseño del sistema de perfusión. (Arriba) El sistema básico de perfusión. (Medio) El sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes medias. (Abajo) El sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar un volumen de distribución bien mezclado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Debido a la dispersión y difusión dentro del flujo, las señales de soluto se distorsionan o "manchan" a medida que viajan a través del sistema de flujo. Esta distorsión puede cuantificarse mediante el uso de distribuciones de tiempo de residencia (IDT)13. En este artículo se explica cómo realizar experimentos de trazador en componentes del sistema de perfusión (Figura 2) y se proporcionan scripts de MATLAB para generar RTD a partir de datos medidos. Una explicación detallada de este análisis se puede encontrar en el artículo anterior de los autores11. Los scripts adicionales de MATLAB se ajustan a las funciones adecuadas a los RTD y extraen parámetros físicos, y realizan la convolución de la señal utilizando RTD para predecir cómo se propagará y distorsionará la entrada de señal de soluto por parte del usuario a través del sistema de perfusión14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figura 2: Distribuciones del tiempo de residencia. Los RTD de los componentes del sistema de flujo, como esta longitud de tubería, se miden introduciendo un pulso de trazador en el sistema y midiendo cómo se "mancha" en el momento en que sale a las fracciones recolectadas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Ciertas funciones celulares y tisulares operan dentro de la escala de tiempo dinámica de minutos a horas que están mal resueltas por los sistemas de cultivo convencionales. Este trabajo ha desarrollado un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo que permite que el medio de cultivo se perfunda continuamente en un módulo de cultivo celular y se fraccione en un módulo aguas abajo para medir la dinámica a esta escala. El sistema está construido casi en su totalidad a partir de piezas disponibles comercialmente y se puede paralelizar para realizar experimentos independientes en placas de cultivo celular convencionales de múltiples pozos simultáneamente. Este artículo de vídeo muestra cómo ensamblar la configuración de la base, que requiere solo una bomba de jeringa multicanal y un colector de fracción modificado para perfundir hasta seis cultivos en paralelo. También se presentan variantes útiles en el diseño modular que permiten una dinámica de estimulación controlada, como pulsos de soluto o perfiles farmacocinéticos. Es importante destacar que, a medida que las señales de soluto viajan a través del sistema, se distorsionan debido a la dispersión de solutos. Además, se describe un método para medir las distribuciones de tiempo de residencia (RTD) de los componentes de la configuración de perfusión con un trazador utilizando MATLAB. Los RTD son útiles para calcular cómo las señales de soluto son distorsionadas por el flujo en el sistema multicompartimento. Este sistema es altamente robusto y reproducible, por lo que los investigadores básicos pueden adoptarlo fácilmente sin la necesidad de instalaciones de fabricación especializadas.

El sistema de perfusión con múltiples fuentes de medios de la sección 5 del protocolo se utilizó para medir la dinámica de expresión de un gen reportero impulsado por el factor de transcripción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-κB) del factor de necrosis tumoral activado del factor de necrosis tumoral de 1,5 h (TNF-α). Las células HEK293 se transdujeron de manera estable utilizando vectores lentivirales con una construcción genética que contenía Gaussia luciferasa (GLuc), impulsada por un promotor lla...

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Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Este artículo presenta un método para construir y operar un sistema de cultivo celular de perfusión multicanal de bajo costo para medir la dinámica de las tasas de secreción y absorción de solutos en procesos celulares. El sistema también puede exponer las células a perfiles de estímulo dinámicos.

Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Este método ayuda a comprender cómo cambian las tasas de secreción con el tiempo y cómo las células responden a las señales sólidas variables en el tiempo. Las principales ventajas de esta técnica son que su bajo costo, requiere poca capacitación y la configuración del sistema de profusión se puede adaptar para experimentos novedosos. Comience llenando una jeringa con una solución de fondo y cárguela en la primera bomba de jeringa.Llene otra jeringa con solución trazadora y cárguela en la segunda bomba de jeringa. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías utilizando conectores luer. Cierre la llave de paso a la solución de fondo y bombee la solución trazadora en la llave de paso hasta que gotee por el puerto abierto.Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa. Asegúrese de que la barra móvil de las bombas de jeringa se empuje hacia arriba contra los émbolos de la jeringa para que el flujo comience inmediatamente cuando se inicie la bomba. Cierre la llave de paso a la solución trazadora y bombee la solución de fondo a la llave de paso hasta que toda la solución trazadora residual se haya eliminado del puerto abierto.Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa. Configure el componente del sistema de flujo deseado para el análisis RTD. Inserte el extremo en un dispensador de punta de pipeta y bombee la solución de fondo a través del componente hasta que esté completamente lleno.Ajuste la bomba para la solución trazadora al caudal deseado. Cierre la llave de paso a la solución de fondo e inicie el flujo de la solución trazadora. Al mismo tiempo, inicie el colector de fracciones.Continúe el flujo de la solución del trazador durante un corto período de tiempo para aproximarse a una entrada de impulso del trazador. Se recomienda una duración del pulso de 10 minutos para los RTD a un caudal de un mililitro por hora. Detenga la bomba de solución trazadora al final del período de pulso de la solución trazadora.Cierre rápidamente la llave de paso a la solución trazadora e inicie el flujo de la solución de fondo al mismo caudal. Permita que la solución de fondo fluya y recolecte fracciones hasta que todo el trazador haya pasado a través del sistema y hacia las fracciones recolectadas. En condiciones estériles, inserte los tapones con agujas en los cultivos de la placa del pozo con las agujas levantadas.Después de que el tapón esté en su lugar, baje las agujas a la altura deseada para la perfusión, ya que la altura de la aguja de salida determina el nivel estable de líquido. Tapa las agujas con tapas de luer macho y mantén toda la placa del pozo en una incubadora a 37 grados centígrados hasta su uso. Preparar los dos medios a utilizar para la perfusión, etiquetando el medio que se dispensará primero como uno y el otro medio dos.Para cada cultivo a perfundir, llene una jeringa con una mediana para que dure toda la duración de su dispensación más el volumen suficiente para llenar inicialmente el sistema de perfusión. Llene una segunda jeringa con dos medios para que dure toda la duración de su dispensación. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías.Es posible que se requiera una longitud de tubo para conectar las jeringas a las llaves de paso. Prepare las llaves de paso cerrando la llave de paso para el medio uno y dispensando el medio dos en la llave de paso hasta que comience a gotear por el puerto abierto. A continuación, cierre la llave de paso para el medio dos y dispense el medio uno en la llave de paso hasta que todo el medio residual dos haya sido expulsado del puerto abierto.Conecte el tubo aguas arriba al puerto de llave de paso abierto utilizando un conector hembra a barb luer. Inserte un conector macho a barb luer en el otro extremo del tubo. Dispense el medio uno de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba se llene con medio y proceda con la preparación del tubo aguas abajo como se demostró anteriormente.Inserte un conector macho a barb luer en un extremo del tubo aguas abajo y cúbralo con una tapa luer hembra. Lleve cuidadosamente todos los tubos preparados, jeringas y la placa del pozo a la incubadora que se utilizará para la perfusión. Coloque la bomba de jeringa y el colector de fracción en los lugares deseados cerca de la incubadora.Coloque la bomba de jeringa encima o cerca de la incubadora y coloque el colector de fracción junto a la incubadora cerca del puerto. Cargue las jeringas en la bomba. Agrupe los extremos tapados de todos los tubos aguas arriba y aguas abajo y empuje desde el exterior de la incubadora hacia el interior a través del puerto.Inserte los extremos abiertos de los tubos aguas abajo en las puntas de la pipeta dispensadora del dispensador multicabezal del colector de fracciones. Dentro de la incubadora, tire de la mayor cantidad posible de holgura de los tubos aguas arriba en la incubadora para maximizar la longitud del tubo a través del cual el medio que fluye puede recibir calor y dióxido de carbono. Para cada pozo enchufado, destape rápidamente las agujas y los tubos aguas arriba y aguas abajo para ese pozo, luego conéctelos junto con sus conectores luer.Una vez que todas las piezas estén conectadas, haga funcionar brevemente la bomba de la jeringa a una velocidad relativamente alta para asegurarse de que todas las corrientes fluyan correctamente. En este punto, si se desea comenzar el experimento con los tubos aguas abajo llenos del medio, continúe haciendo funcionar la bomba hasta que todas estén llenas, de lo contrario, detenga la bomba. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa para el medio uno y la frecuencia de recolección de fracciones y arranque ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento.Cuando sea necesario cambiar la fuente del medio, detenga rápidamente la bomba de la jeringa por una mediana. Gire la llave de paso cerrada a la mediana uno y arranque la bomba de la jeringa para el medio dos. Si lo desea más tarde, vuelva a cambiar la fuente a la mediana de manera similar.Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento. Las concentraciones de trazadores en las fracciones de dos experimentos de IDT se midieron y se introdujeron en la IDT a partir de datos del script MATLAB para producir los dos RTD. Los tubos individuales y las múltiples piezas de tubos en serie encajan bien con un solo modelo de dispersión axial y la adición de una placa perfundida de 48 pocillos en línea causó una desviación insignificante que permitió que tanto el RTD de tubo de un metro como el RTD de todo el sistema se ajustaran mediante funciones de dispersión axial.Se demostró un ejemplo de un ajuste deficiente del modelo utilizando el modelo de dispersión axial ajustado a los datos de RTD de un metro de tubo y se trazó junto con los datos. Las conjeturas iniciales de los parámetros se cambiaron para producir un buen ajuste del modelo donde tau era aproximadamente igual al volumen del sistema de perfusión dividido por su caudal volumétrico. Un pulso de 90 minutos de TNF-alfa se definió como la señal de entrada al sistema y se conplicó con el RTD de tubo de un metro para determinar la señal TNF-alfa en la entrada de la placa del pozo.La señal de entrada también se conplicó con el RTD de todo el sistema para determinar la señal TNF-alfa a la salida del sistema en las fracciones recogidas. Las células HEK 293 fueron diseñadas para secretar GLuc impulsado por un promotor que contiene el elemento de respuesta NF-kappaB. El experimento reveló un aumento significativo de la expresión y una disminución lenta en la expresión de GLuc impulsada por NF-kappaB después de la exposición a TNF-alfa.Las variaciones del sistema se describen en el documento adjunto, incluida una configuración más simple para experimentos que no requieren ingresar señales y exponer las células a perfiles de solutos conectivos pharma-hu.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Investigación

Bioingeniería

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Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

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