Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Denna forskning genomfördes med stöd under Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 och T32 GM008339 från National Institutes of Health.

1. Förbered delar för perfusion av brunnsplattor
<ol><li>Förbered slangar<ol>
<li>Skär två längder silikonslang (1,6 mm innerdiameter) för varje cellodling som ska perfuseras. Se till att biten som används som uppströmsslang är tillräckligt lång för att nå från sprutpumpen till cellkulturen inuti inkubatorn, och att nedströmsbiten kan nå från cellodlingen till fraktionsuppsamlarens längsta utsträckta läge.</li>
		<li>Ge varje slangbit en unik etikett på båda ändarna med märkt t...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Detta arbete beskriver sammansättning och drift av ett perfusionscellodlingssystem med flera mediumkällor demonstrerade med ett specifikt exempel där dynamiken i NF-κB-driven genuttryck som svar på en övergående puls av TNF-α mättes. RTD-enheterna för perfusionssystemets komponenter mättes och modellerades, och signalkonvolution användes för att förutsäga både cellernas exponering för TNF-α pulsen och TNF-α fördelning i de uppsamlade avloppsmediumfraktionerna. Cellerna exponerades för pulsen och frak...

Många viktiga biologiska processer förekommer i cell- och vävnadskulturer på tidsskalan minuter till timmar 1,2,3. Medan vissa av dessa fenomen kan observeras och registreras på ett automatiserat sätt med hjälp av time-lapse-mikroskopi4, bioluminescens1 eller andra metoder, utförs experiment som involverar insamling av odlingssupernatantprover för kemisk analys ofta manuellt i statiska cellkulturer. Manuell provtagning begränsar genomförbarheten av vissa studier på grund av besväret med frekventa provtagningstidpunkter eller efter arbetstid. Ytterligare brister i statiska odlingsmetoder inkluderar experiment som involverar kontrollerad, övergående exponering för kemiska stimuli. I statiska kulturer måste stimuli läggas till och tas bort manuellt, och stimulansprofiler är begränsade till stegförändringar över tiden, medan medelstora förändringar också lägger till och tar bort andra medelkomponenter, vilket kan påverka celler på ett okontrollerat sätt5. Fluidiska system kan övervinna dessa utmaningar, men befintliga enheter utgör andra utmaningar. Mikrofluidiska enheter har de oöverkomliga kostnaderna för specialutrustning och utbildning för att producera och använda, kräver mikroanalytiska metoder för att bearbeta prover och celler är svåra att återhämta sig från enheterna efter perfusion6. Få makrofluidiska system har skapats för de typer av experiment som beskrivs här 7,8,9,10, och de är byggda av flera anpassade delar tillverkade internt och kräver flera pumpar eller fraktioner. Dessutom är författarna inte medvetna om några kommersiellt tillgängliga makrofluidiska perfusionscellodlingssystem än omrörda tankbioreaktorer för suspensionskultur, som är användbara för biotillverkning, men som inte är utformade för modellering och studier av fysiologi.
Författarna har tidigare rapporterat om utformningen av ett billigt perfusionsbioreaktorsystem som nästan helt består av kommersiellt tillgängliga delar11. Basversionen av systemet gör det möjligt att hålla flera kulturer i en brunnsplatta i enCO2-inkubator och kontinuerligt perfuseras med medium från en sprutpump, medan avloppsvattenmediumströmmarna från kulturerna automatiskt fraktioneras i prover över tid med hjälp av en fraktionsuppsamlare med en anpassad modifiering. Således möjliggör detta system automatiserad provtagning av odlingsmedium supernatant och kontinuerlig löst inmatning till kulturerna över tiden. Systemet är makrofluidiskt och modulärt och kan enkelt modifieras för att möta behoven hos nya experimentdesigner.
Det övergripande målet med metoden som presenteras här är att konstruera, karakterisera och använda ett perfusionscellodlingssystem som möjliggör experiment där utsöndrings- eller absorptionshastigheterna för ämnen av celler över tid mäts och / eller celler utsätts för exakta, övergående lösta signaler. Den här videoartikeln förklarar hur man monterar basinställningen, som kan perfusera upp till sex cellkulturer samtidigt med en enda sprutpump och modifierad fraktionsuppsamlare. Två användbara varianter på bassystemet som använder ytterligare pumpar och delar för att möjliggöra experiment som utsätter celler för övergående koncentrationssignaler för lösta ämnen, inklusive korta pulser och farmakokinetiska profiler12, presenteras också, som visas i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Figur 1: Tre variationer på perfusionssystemets design. (Mitten) Perfusionssystemet med en stoppkran för flera medelstora källor. (Nederst) Perfusionssystemet med en omrörd tank för att efterlikna en välblandad distributionsvolym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
På grund av dispersion och diffusion i flödet blir de lösta signalerna förvrängda eller "utsmetade" när de färdas genom flödessystemet. Denna snedvridning kan kvantifieras genom användning av uppehållstidsfördelningar (FoTU)13. Den här artikeln förklarar hur man utför spårningsexperiment på komponenter i perfusionssystemet (figur 2) och tillhandahåller MATLAB-skript för att generera RTD-enheter från uppmätta data. En detaljerad förklaring av denna analys finns i författarnas tidigare artikel11. Ytterligare MATLAB-skript passar lämpliga funktioner till RTD-enheterna och extraherar fysiska parametrar och utför signalkonvolution med RTD-enheter för att förutsäga hur löst signalinmatning av användaren kommer att spridas och förvrängas genom perfusionssystemet14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Figur 2: Fördelning av uppehållstid. RTD-enheterna för flödessystemkomponenter, såsom denna slanglängd, mäts genom att mata in en puls av spårämne till systemet och mäta hur det "smetar ut" när det går ut i de uppsamlade fraktionerna. Denna siffra har modifierats från Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Vissa cell- och vävnadsfunktioner fungerar inom den dynamiska tidsskalan på minuter till timmar som är dåligt upplösta av konventionella odlingssystem. Detta arbete har utvecklat ett billigt perfusionsbioreaktorsystem som gör att odlingsmediet kontinuerligt kan perfuseras i en cellodlingsmodul och fraktioneras i en nedströmsmodul för att mäta dynamik i denna skala. Systemet är konstruerat nästan helt av kommersiellt tillgängliga delar och kan parallelliseras för att utföra oberoende experiment i konventionella flerbrunnscellodlingsplattor samtidigt. Den här videoartikeln visar hur man monterar basinställningen, som endast kräver en enda flerkanalig sprutpump och en modifierad fraktionsuppsamlare för att genomsyra upp till sex kulturer parallellt. Användbara varianter på den modulära designen presenteras också som möjliggör kontrollerad stimuleringsdynamik, såsom lösta pulser eller farmakokinetiska profiler. Det är viktigt att när lösta signaler färdas genom systemet förvrängs de på grund av upplösningsdispersion. Vidare beskrivs en metod för att mäta uppehållstidsfördelningar (RTD) för komponenterna i perfusionsinställningen med ett spårämne med MATLAB. RTD-enheter är användbara för att beräkna hur lösta signaler förvrängs av flödet i flerfackssystemet. Detta system är mycket robust och reproducerbart, så grundforskare kan enkelt anta det utan behov av specialiserade tillverkningsanläggningar.

Perfusionssystemet med flera medelkällor från avsnitt 5 i protokollet användes för att mäta uttrycksdynamiken hos en reportergen som drivs av kärnfaktorn kappa-light-chain-enhancer av aktiverade B-celler (NF-κB) transkriptionsfaktor i human embryonala njure 293 (HEK293) celler som svar på en 1,5 h puls av tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler transducerades stabilt med hjälp av lentivirala vektorer med en genkonstruktion innehållande Gaussia luciferas (GLuc), driven av en promotor som kallas NFKB som ...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Denna uppsats presenterar en metod för att konstruera och driva ett billigt, flerkanaligt perfusionscellodlingssystem för att mäta dynamiken i utsöndring och absorptionshastigheter hos lösta ämnen i cellulära processer. Systemet kan också utsätta celler för dynamiska stimulansprofiler.

Multi-Stream Perfusion Bioreactor integrerad med utloppsfraktionering för dynamisk cellodling

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Denna metod hjälper till att förstå hur utsöndringshastigheter förändras med tiden och hur celler svarar på tidsvarierande fasta signaler. De främsta fördelarna med denna teknik är att dess låga kostnad kräver liten träning och överflödssystemets inställning kan anpassas för nya experiment. Börja med att fylla en spruta med en bakgrundslösning och ladda den i den första sprutpumpen.Fyll en annan spruta med spårlösning och ladda den i den andra sprutpumpen. Anslut båda sprutorna till två av de tre portarna på en fyrvägs stoppkran med luerkontakter. Stäng stoppkranen till bakgrundslösningen och pumpa spårlösningen i stoppkranen tills den droppar ut den öppna porten.Stoppa pumpen och justera inte sprutan ytterligare. Se till att sprutpumparnas rörliga stång trycks upp mot sprutkolvarna så att flödet börjar omedelbart när pumpen startas. Stäng stoppkranen till spårlösningen och pumpa in bakgrundslösningen i stoppkranen tills all kvarvarande spårlösning har spolats ut ur den öppna porten.Stoppa pumpen och justera inte sprutan ytterligare. Ställ in den flödessystemkomponent som önskas för RTD-analys. Sätt in änden i en pipettspetsdispenser och pumpa bakgrundslösning genom komponenten tills den är helt fylld.Ställ pumpen för spårlösningen på önskad flödeshastighet. Stäng stoppkranen till bakgrundslösningen och starta flödet av spårlösningen. Starta samtidigt fraktionssamlaren.Fortsätt flödet av spårlösning under en kort tidsperiod för att approximera en impulsinmatning av spårämnet. En pulsvaraktighet på 10 minuter rekommenderas för RTD-enheter med en flödeshastighet på en milliliter per timme. Stoppa spårlösningspumpen i slutet av spårlösningspulsperioden.Stäng snabbt stoppkranen till spårlösningen och starta flödet av bakgrundslösningen med samma flödeshastighet. Låt bakgrundslösningen flöda och samla in fraktioner tills allt spårämne har passerat genom systemet och in i de uppsamlade fraktionerna. Under sterila förhållanden, sätt in propparna med nålar i brunnsplattkulturerna med nålarna uppdragna.När proppen är på plats, sänk nålarna till önskad höjd för perfusion eftersom utloppsnålens höjd bestämmer den stabila vätskenivån. Täck nålarna med manliga luerlock och håll hela brunnsplattan i en inkubator inställd på 37 grader Celsius tills den används. Förbered de två medierna som ska användas för perfusion, märk mediet som kommer att dispenseras först som ett och det andra mediet två.För att varje kultur ska perfuseras, fyll en spruta med medium en för att hålla hela varaktigheten av dess dispens plus tillräckligt med volym för att initialt fylla perfusionssystemet. Fyll en andra spruta med medium två för att hålla hela varaktigheten av dess dispension. Anslut båda sprutorna till två av de tre portarna på en fyrvägs stoppkran.En slanglängd för att ansluta sprutorna till stoppkranarna kan krävas. Förbered stoppkranarna genom att stänga stoppkranen för medium ett och fördela medium två i stoppkranen tills den bara börjar droppa ut den öppna porten. Stäng sedan stoppkranen för medium två och fördela medium ett i stoppkranen tills alla återstående medium två har spolats ut ur den öppna porten.Fäst uppströms slangen på den öppna stoppkransporten med en hona till barb luerkontakt. Sätt i en hane till barb luerkontakt i andra änden av röret. Fördela medium ett från sprutan tills uppströmsröret är fyllt med medium och fortsätt med beredningen av nedströms slangar som visats tidigare.Sätt i en hane till barb luer-kontakt i ena änden av nedströms slangen och täck den med en kvinnlig luerlock. Ta försiktigt med alla förberedda slangar, sprutor och brunnsplattan till inkubatorn som kommer att användas för perfusion. Placera sprutpumpen och fraktionsuppsamlaren på önskade platser nära inkubatorn.Placera sprutpumpen ovanpå eller nära inkubatorn och placera fraktionsuppsamlaren bredvid inkubatorn nära porten. Ladda sprutorna i pumpen. Bunta ihop de täckta ändarna på alla uppströms och nedströms rör och skjut dem från utsidan av inkubatorn till insidan genom porten.För in de öppna ändarna av nedströmsrören i doseringspipettspetsarna på fraktionsuppsamlarens flerhuvudsdispenser. Inuti inkubatorn, dra så mycket slack av uppströmsrören som möjligt in i inkubatorn för att maximera längden på slangen genom vilken det strömmande mediet kan ta emot värme och koldioxid. För varje pluggad brunn, lossa snabbt nålarna och uppströms- och nedströms rören för den brunnen och fäst dem sedan tillsammans med sina luerkontakter.När alla delar är anslutna, kör sprutpumpen kort med relativt hög hastighet för att säkerställa att alla strömmar flyter ordentligt. Vid denna tidpunkt, om det är önskvärt att börja experimentet med nedströmsrören fulla av mediet, fortsätt att köra pumpen tills alla är fyllda, annars, stoppa pumpen. Ställ in sprutpumpens flödeshastighet för medium ett och frekvensen för fraktionsuppsamling och starta båda maskinerna samtidigt för att påbörja experimentet.När mediumkällan behöver bytas, stoppa snabbt sprutpumpen för medium. Vrid stoppkranen stängd till medium ett och starta sprutpumpen för medium två. Om så önskas senare, byt tillbaka källan till medium på samma sätt.Samla in fraktioner för önskad experimentvaraktighet. Spårämneskoncentrationerna i fraktionerna från två RTD-experiment mättes och matades in i RTD från data MATLAB-skript för att producera de två RTD-enheterna.Ett exempel på en dålig modellpassning demonstrerades med hjälp av den axiella dispersionsmodellen monterad på RTD-data för en meter rör och ritades tillsammans med data. De ursprungliga parametergissningarna ändrades för att ge en bra modellpassning där tau var ungefär lika med perfusionssystemets volym dividerat med dess volymetriska flödeshastighet. En 90 minuters puls av TNF-alfa definierades som insignalen till systemet och var invecklad med en meter slang RTD för att bestämma TNF-alfasignalen vid brunnsplattans inlopp.Insignalen var också konvolverad med RTD för hela systemet för att bestämma TNF-alfasignalen vid systemets utlopp i de uppsamlade fraktionerna. HEK 293-celler konstruerades för att utsöndra GLuc som drivs av en promotor som innehåller NF-kappaB-svarselementet. Experimentet avslöjade en signifikant uttrycksökning och långsam minskning av GLuc-uttryck som drivs av NF-kappaB efter TNF-alfa-exponering.Variationer av systemet beskrivs i medföljande papper, inklusive en enklare installation för experiment som inte kräver inmatning av signaler och exponering av celler för läkemedelsbindande lösta profiler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabricerade Plattformar för Mekaniskt Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation och Bioreaktor Mognad för brosk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Samtidig transplantation av mänskliga äggstocksvävnad med bearbetade Endothelial celler: en Cell-baserad strategi kombinera accelererade Perfusion med direkta parakrin leverans

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggandet av ett Multilayered mesenkymala stamceller blad med ett 3D dynamisk kultur System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

En Mikrofluidisk plattform för att stimulera kondrocyter med dynamisk kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopi integrerat med mikrofluidik för Chemotactic kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Imaging-guided bioreaktor för generering av bioengineered luftvägsvävnad

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Upphandling och perfusion-decellularisering av vaskulära klaffar av svin i en anpassad perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Upphandling och decellularisering av råtta bakben med hjälp av en ex vivo perfusionsbaserad bioreaktor för vaskulariserad kompositallotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...