Name: multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Bu araştırma Hibe No'lu destek ile yürütülmüştür. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01EB012521, R01EB028782 ve T32 GM008339.

1. Kuyu plakası perfüzyonu için parçalar hazırlayın
<ol><li>Boru hazırlama<ol>
<li>Perfüze edilecek her hücre kültürü için iki uzunlukta silikon boru (1,6 mm iç çap) kesin. Yukarı akış borusu olarak kullanılan parçanın, şırınga pompasından inkübatörün içindeki hücre kültürüne ulaşacak kadar uzun olduğundan ve aşağı akış parçasının hücre kültüründen fraksiyon toplayıcının en uzatılmış konumuna ulaşabildiğinden emin olun.</li>
		<li>Her boru parças?...

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus.">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).</li><li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume.">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).</li><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells.">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li><li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals.">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li><li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outlook+on+microfluidics:+the+promise+and+the+challenge.">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li><li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures.">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).</li><li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells.">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells.">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li><li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow,+pigeon+and+Japanese+quail,+using+cell+perfusion+systems.">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li><li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion.">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).</li><li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , (2001).</li><li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , (2006).</li><li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , (2019).</li><li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+(bypassing).">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615 (2019).</li><li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay.">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li><li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+(RTD)+tests.">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li><li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber.">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li><li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle.">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li><li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture:+residence+time+distribution.">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li><li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freix&#243;, A., S&#225;nchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor.">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li></ol>

Bu çalışma, TNF-α geçici bir darbesine yanıt olarak NF-κB güdümlü gen ekspresyonunun dinamiklerinin ölçüldüğü spesifik bir örnekle gösterilen çoklu ortam kaynaklarına sahip bir perfüzyon hücre kültürü sisteminin montajını ve çalışmasını açıklamaktadır. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'leri ölçüldü ve modellendi ve hem hücrelerin TNF-α darbesine maruz kalmasını hem de toplanan atık su orta fraksiyonlarındaki TNF-α dağılımını tahmin etmek için sinyal evrişimi kulla...

Birçok önemli biyolojik süreç, hücre ve doku kültürlerinde dakikalar ila saatlerarasında 1,2,3 zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu fenomenlerin bazıları hızlandırılmış mikroskopi4, biyolüminesans1 veya diğer yöntemler kullanılarak otomatik bir şekilde gözlemlenebilir ve kaydedilebilirken, kimyasal analiz için kültür süpernatant örneklerinin toplanmasını içeren deneyler genellikle statik hücre kültürlerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Manuel örnekleme, sık veya mesai saatleri dışında örnekleme zaman noktalarının rahatsızlığı nedeniyle belirli çalışmaların fizibilitesini sınırlar. Statik kültür yöntemlerinin diğer eksiklikleri, kimyasal uyaranlara kontrollü, geçici maruziyetleri içeren deneyleri içerir. Statik kültürlerde, uyaranlar manuel olarak eklenmeli ve çıkarılmalıdır ve uyaran profilleri zaman içindeki adım değişiklikleriyle sınırlıdır, orta değişiklikler de hücreleri kontrolsüz bir şekilde etkileyebilecek diğer ortam bileşenlerini ekler ve kaldırır5. Akışkan sistemler bu zorlukların üstesinden gelebilir, ancak mevcut cihazlar başka zorluklar da doğurur. Mikroakışkan cihazlar, özel ekipmanın ve üretim ve kullanım eğitiminin engelleyici maliyetleri ile birlikte gelir, numuneleri işlemek için mikroanalitik yöntemler gerektirir ve perfüzyon6'dan sonra hücrelerin cihazlardan kurtarılması zordur. Burada açıklanandeney türleri için birkaç makroakışkan sistem oluşturulmuştur 7,8,9,10 ve bunlar şirket içinde yapılan birden fazla özel parçadan yapılmıştır ve birden fazla pompa veya fraksiyon toplayıcı gerektirir. Ayrıca, yazarlar, biyoüretim için yararlı olan, ancak fizyolojiyi modellemek ve incelemek için tasarlanmamış, süspansiyon kültürü için karıştırılmış tank biyoreaktörleri dışında, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir makroakışkan perfüzyon hücre kültürü sisteminin farkında değildir.
Yazarlar daha önce neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan oluşan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sisteminin tasarımı hakkında rapor vermişlerdi11. Sistemin baz versiyonu, bir kuyu plakasındaki birden fazla kültürün bir CO2 inkübatöründe tutulmasını ve bir şırınga pompasından gelen ortamla sürekli olarak perfüze edilmesini sağlarken, kültürlerden gelen atık su ortam akışları, özel bir modifikasyona sahip bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak zaman içinde otomatik olarak numunelere bölünür. Böylece, bu sistem kültür ortamı süpernatantının otomatik örneklemesini ve zaman içinde kültürlere sürekli çözünen girdiyi mümkün kılar. Sistem makroakışkan ve modülerdir ve yeni deney tasarımlarının ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilir.
Burada sunulan yöntemin genel amacı, maddelerin zaman içinde hücreler tarafından salgılanma veya emilim oranlarının ölçüldüğü ve / veya hücrelerin hassas, geçici çözünen sinyallere maruz kaldığı deneylere olanak tanıyan bir perfüzyon hücre kültürü sistemi oluşturmak, karakterize etmek ve kullanmaktır. Bu video makalesinde, tek bir şırınga pompası ve modifiye fraksiyon toplayıcı kullanarak aynı anda altı adede kadar hücre kültürünü perfüze edebilen baz kurulumunun nasıl monte edileceği açıklanmaktadır. Baz sistemde, hücreleri kısa darbeler ve farmakokinetik benzeri profiller12 dahil olmak üzere geçici çözünen konsantrasyon sinyallerine maruz bırakan deneylere izin vermek için ek pompalar ve parçalardan yararlanan iki yararlı varyant da Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> Resim 1: Perfüzyon sistemi tasarımı üzerinde üç varyasyon . (Top) Temel perfüzyon sistemi. (Orta) Birden fazla orta kaynak için bir stopcock ile perfüzyon sistemi. (Altta) İyi karıştırılmış bir dağılım hacmini taklit etmek için karıştırılmış bir tanka sahip perfüzyon sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Akış içindeki dağılım ve difüzyon nedeniyle, çözünen sinyaller akış sisteminden geçerken bozulur veya "bulaşır". Bu bozulma, ikamet süresi dağılımları (RTD'ler) kullanılarak ölçülebilir13. Bu makalede, perfüzyon sisteminin bileşenleri üzerinde izleyici deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır (Şekil 2) ve ölçülen verilerden RTD'ler oluşturmak için MATLAB komut dosyaları sağlanmaktadır. Bu analizin ayrıntılı bir açıklaması, yazarların önceki makalesi11'de bulunabilir. Ek MATLAB komut dosyaları, RTD'lere uygun işlevler sığdırır ve fiziksel parametreleri çıkarır ve kullanıcı tarafından çözünen sinyal girişinin perfüzyon sistemi14 aracılığıyla nasıl yayılacağını ve bozulacağını tahmin etmek için RTD'leri kullanarak sinyal evrişimi gerçekleştirir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> Şekil 2: İkamet süresi dağılımları. Bu boru uzunluğu gibi akış sistemi bileşenlerinin RTD'leri, sisteme bir izleyici darbesi girerek ve toplanan fraksiyonlara çıktığı zamana kadar nasıl "bulaştığını" ölçerek ölçülür. Bu rakam Erickson ve ark.11'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-010</td>
			<td>Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFrac Fraction Collector&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410002</td>
			<td>Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12&#34; x 12&#34; x 1/8&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4615T93</td>
			<td>This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine native</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>303</td>
			<td>Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48&#160;wells, polystyrene plate, flat bottom wells</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td>Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720081</td>
			<td>Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilog Zing 24 Laser</td>
			<td>Cutting Edge Systems</td>
			<td>Epilog Zing 24</td>
			<td>Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Microcentrifuge tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>Glass tubes for collecting fractions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2707410</td>
			<td>300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td>Phosphate buffered saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>Labline 4625 Titer Shaker</td>
			<td>Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30600-04</td>
			<td>Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>UX-45501-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45508-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16&#34; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-30800-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td>Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Set F1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7410010</td>
			<td>Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>10291-TA-020</td>
			<td>Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263015-50</td>
			<td>Fits 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm</td>
			<td>Saint Gobain</td>
			<td>DX263027-10</td>
			<td>Fits 12-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>S-395-1LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Systems</td>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan LUX multimode microplate reader</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Plate reader.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10404779</td>
			<td>Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-stream perfusion bioreactor integrated with outlet fractionation for dynamic cell culture

Bazı hücre ve doku fonksiyonları, geleneksel kültür sistemleri tarafından zayıf bir şekilde çözülen dakikalar ila saatler arasındaki dinamik zaman ölçeği içinde çalışır. Bu çalışma, kültür ortamının sürekli olarak bir hücre kültürü modülüne perfüze edilmesini ve bu ölçekteki dinamikleri ölçmek için bir aşağı akış modülünde fraksiyone edilmesini sağlayan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sistemi geliştirmiştir. Sistem neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan inşa edilmiştir ve aynı anda geleneksel çok kuyulu hücre kültürü plakalarında bağımsız deneyler yapmak için paralelleştirilebilir. Bu video makalesinde, yalnızca tek bir çok kanallı şırınga pompası ve paralel olarak altı kültüre kadar perfüze etmek için modifiye edilmiş bir fraksiyon kolektörü gerektiren taban kurulumunun nasıl monte edileceği gösterilmektedir. Modüler tasarımdaki yararlı varyantlar, çözünen darbeler veya farmakokinetik benzeri profiller gibi kontrollü stimülasyon dinamiklerine izin veren de sunulmaktadır. Daha da önemlisi, çözünen sinyaller sistemden geçerken, çözünmüş dağılım nedeniyle bozulurlar. Ayrıca, perfüzyon kurulumunun bileşenlerinin ikamet süresi dağılımlarını (RTD'ler) MATLAB kullanarak bir izleyici ile ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RTD'ler, çözünen sinyallerin çok bölmeli sistemdeki akış tarafından nasıl bozulduğunu hesaplamak için kullanışlıdır. Bu sistem son derece sağlam ve tekrarlanabilir, bu nedenle temel araştırmacılar özel üretim tesislerine ihtiyaç duymadan kolayca benimseyebilirler.

Protokolün 5. bölümünden çoklu ortam kaynaklarına sahip perfüzyon sistemi, tümör nekroz faktörü alfasının (TNF-α) 1.5 saatlik nabzına yanıt olarak, insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinde aktive edilmiş B hücrelerinin (NF-κB) transkripsiyon faktörünün nükleer faktör kappa-hafif zincir-arttırıcısı tarafından yönlendirilen bir muhabir genin ekspresyon dinamiklerini ölçmek için kullanıldı. HEK293 hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için floresan ile aktive ...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture at JoVE.com

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Bu yöntem, sekresyon oranlarının zamanla nasıl değiştiğini ve hücrelerin zamanla değişen katı sinyallere nasıl tepki verdiğini anlamaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetinin, çok az eğitim gerektirmesi ve bolluk sistemi kurulumunun yeni deneyler için uyarlanabilmesidir. Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurarak başlayın ve ilk şırınga pompasına yükleyin.Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin. Her iki şırıngayı da luer konektörlerini kullanarak dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın. Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici solüsyonunu açık porttan damlayana kadar stopcock'a pompalayın.Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. Şırınga pompalarının hareket çubuğunun şırınga pistonlarına doğru itildiğinden emin olun, böylece pompa başlatıldığında akış hemen başlar. Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın.Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın. RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ucu bir pipet ucu dağıtıcısına yerleştirin ve arka plan solüsyonunu tamamen dolana kadar bileşenden pompalayın.İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. RTD'ler için saatte bir mililitre akış hızında 10 dakikalık bir nabız süresi önerilir. İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda izleyici çözeltisi pompasını durdurun.Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın. Arka plan çözeltisinin, izleyicinin tümü sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar fraksiyonları akmasına ve toplamasına izin verin. Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin.Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin. İğneleri erkek luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde tutun. Perfüzyon için kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı bir ve diğer ortam iki olarak etiketleyin.Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı orta bir taneyle doldurun ve dispansyonunun tüm süresi boyunca artı başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacimle doldurun. Sökülmesinin tüm süresi boyunca dayanması için ikinci bir şırıngayı orta iki ile doldurun. Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.Şırıngaları stopcocklara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir. Stopcock'u orta bir için kapatarak ve açık porttan damlamaya başlayana kadar orta ikiyi stopcock'a dağıtarak stopcock'ları hazırlayın. Ardından, orta iki için stopcock'u kapatın ve kalan tüm orta iki açık porttan temizlenene kadar orta olanı stopcock'a dağıtın.Dişi - dikenli luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin. Yukarı akış tüpü orta ile doldurulana kadar şırıngadan bir ortam dağıtın ve daha önce gösterildiği gibi aşağı akış borusunun hazırlanmasına devam edin.Aşağı akış borusunun bir ucuna bir erkek - diken luer konektörü yerleştirin ve dişi bir luer kapağı ile kapatın. Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin. Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin.Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına portun yanına yerleştirin. Şırıngaları pompaya yükleyin. Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.Çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin. İnkübatörün içinde, akan ortamın ısı ve karbondioksit alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre yukarı akış tüplerinin mümkün olduğunca gevşekliğini çekin. Takılan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın, ardından bunları luer konektörleriyle birbirine takın.Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın. Bu noktada, deneye ortamla dolu aşağı akış tüpleri ile başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin, aksi takdirde pompayı durdurun. Şırınga pompası akış hızını orta ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.Orta kaynağın değiştirilmesi gerektiğinde, şırınga pompasını orta kaynak için hızlı bir şekilde durdurun. Stopcock'u orta seviyeye kapatın ve şırınga pompasını orta iki için çalıştırın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta seviyeye geri döndürün.İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın. İki RTD deneyinden elde edilen fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonları ölçüldü ve iki RTD'yi üretmek için veri MATLAB komut dosyasından RTD'ye girdi. Tek tüpler ve seri halinde birden fazla boru parçası, tek bir eksenel dağılım modeli ile iyi uyum sağladı ve aynı doğrultuda perfüze edilmiş bir 48 kuyu plakası eklenmesi, hem bir metre tüp RTD'nin hem de tüm sistemin RTD'sinin eksenel dağılım fonksiyonlarına uymasına izin veren ihmal edilebilir sapmaya neden oldu.Bir metre tüp RTD verilerine takılan eksenel dağılım modeli kullanılarak zayıf bir model uyumu örneği gösterildi ve verilerle birlikte çizildi. İlk parametre tahminleri, tau'nun hacimsel akış hızına bölünen perfüzyon sistemi hacmine yaklaşık olarak eşit olduğu iyi bir model uyumu üretmek için değiştirildi. 90 dakikalık bir TNF-alfa darbesi, sisteme giriş sinyali olarak tanımlandı ve kuyu plakası girişindeki TNF-alfa sinyalini belirlemek için bir metrelik boru RTD ile birleştirildi.Giriş sinyali, toplanan fraksiyonlarda sistemin çıkışındaki TNF-alfa sinyalini belirlemek için tüm sistemin RTD'si ile de birleştirildi. HEK 293 hücreleri, NF-kappaB yanıt elemanını içeren bir promotör tarafından tahrik edilen GLuc'u salgılamak üzere tasarlanmıştır. Deney, TNF-alfa maruziyetini takiben NF-kappaB tarafından yönlendirilen GLuc ekspresyonunda önemli bir ekspresyon artışı ve yavaş bir azalma olduğunu ortaya koydu.Sistemin varyasyonları, sinyallerin girilmesini gerektirmeyen ve hücreleri farmasötik-hu bağlayıcı çözünen profillere maruz bırakan deneyler için daha basit bir kurulum da dahil olmak üzere beraberindeki makalede açıklanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Özelleştirilmiş Perfüzyon Biyoreaktöründe Domuz Vaskülarize Fleplerinin Tedariği ve Perfüzyon-Desellülarizasyonu

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Vaskülarize Kompozit Allotransplantasyon için Ex Vivo Perfüzyon Bazlı Biyoreaktör Kullanılarak Sıçan Arka Bacaklarının Tedariği ve Desellülarizasyonu

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...