Name: developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

يشكر المؤلفون أندريه كوماروف ويوشوان وانغ وجيانتاو تشو على مساعدتهم في تحليل البيانات ويشكرون أعضاء مختبر تشو على مناقشاتهم القيمة. تم دعم العمل في مختبر الدكتور تشو من قبل صندوق بدء التشغيل من جامعة واشنطن في سانت لويس ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01-EB025209 و R01-HL156265 ، وجائزة مؤسسة كلايكو للبحوث المبتكرة.

بالنسبة لهذه الدراسة ، eNpHR2.0 خط معدل وراثيا w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR خط معدل وراثيا w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO، وبرنامج تشغيل GAL4 الخاص بالقلب الذي يحتوي على جزء تنظيمي من جين اليد w[1118]؛ تم استخدام P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (سيتم الإشارة إلى مخزون برنامج التشغيل هذا على أنه Hand-GAL4). y[*] w[*]؛ P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 تم استخدامه كخط مراسل GFP. تم الحصول على مخزونات ذبابة الفاكهة المذكورة من مركز بلومنغتون لمخزون ذبابة الفاكهة (BDSC ، انظر جدول المواد) وتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة أو عند 18 درجة مئوية على وسائط دقيق الذرة القياسية. تتوفر نماذج ذبابة الفاكهة التي تم تطويرها في هذه الدراسة عند الطلب للعمل التعاوني.
1. ذبابة الفاكهة الصلبان الوراثية وإعداد الوسائط
<ol><li>تغيير موازن الكروموسوم الثالث TM3 Sb[1] إلى TM6 Sb Tb ، مما يخلق w[1118] ؛ P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). انظر الشكل التكميلي 1 للاطلاع على مخطط العبور. ضع الصلبان في قوارير مع وسائط دقيق الذرة العادية. ملاحظة: يسمح وجود علامة السل للمستخدمين بالتمييز بين اليرقات والشرانق التي تحتوي على الجين العابر للأوبسين وبرنامج تشغيل GAL4 من الحيوانات التي تحتوي على أوبسين ولكن بدون سائق25.</li>
	<li>احتفظ بالصلبان الجينية في حاضنة رطوبة تبلغ 25 درجة مئوية و 70٪ على وسائط تحتوي على شبكية العين المتحولة بالكامل (ATR) المصممة خصيصا (انظر جدول المواد) في الظلام لمدة 5 أيام لجمع اليرقات و 6 أيام لجمع الشرانق.</li>
	<li>الجمع بين خمس إناث عذراء من نوع Hand-GAL4/TM6 Sb Tb واثنين إلى ثلاثة ذكور من مخزونات UAS-opsin (eNpHR2.0 أو ReaChR) لكل قارورة. انظر الرسم البياني المتقاطع ل eNpHR2.0 و ReaChR opsin في الشكل 2A والشكل 2B ، على التوالي.</li>
	<li>في اليوم التالي ، قم بإعداد قوارير الوسائط التي تحتوي على ATR.<ol><li>تحضير الطعام شبه المحدد وفقا لتعليمات BDSC26. بدلا من السكروز والجلوكوز ، أضف السكروز فقط (5.14 جم / 100 مل). تبرد إلى ~ 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر.</li>
		<li>قم بإعداد قوارير ذبابة ضيقة ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول ATR-ethanol 100 mM إلى كل قارورة.</li>
		<li>باستخدام ماصة مصلية ، تخلص من طعام الذبابة لتضييق قوارير الذباب ، 5 مل لكل قارورة. دوامة في السرعة القصوى لمدة 10 ثوان.</li>
		<li>قم بتوصيل القوارير ، ولفها في القماش الداكن لحمايتها من الضوء. اترك القوارير تجف لمدة 12 ساعة على الأقل (طوال الليل).</li>
	</ol></li>
	<li>في اليوم التالي ، انقل الذباب الذي يضع البيض بثبات من الخطوة 1.3. إلى القوارير التي تحتوي على طعام يحتوي على ATR (الخطوة 1.4.4). حماية الرفوف مع قوارير من الضوء.</li>
	<li>بعد 24-48 ساعة (اعتمادا على عدد البيض الموضوع) ، تخلص من الوالدين لمنع زيادة عدد السكان في القارورة.</li>
	<li>جمع ذرية غير السل واستخدامها لتصوير القلب. ملاحظة: تظهر الاختلافات المظهرية في مرحلتي اليرقات والعذراء في الشكل 2C. ويبين الشكل 3 الملخص والجدول الزمني التقريبي لخطوات إعداد العينة.</li>
</ol>2. التحكم البصري الوراثي في قلب ذبابة الفاكهة
<ol><li>اختر UAS-opsin/Hand-GAL4 يرقة / خادرة من القارورة (الخطوة 1.7) ، وضعيها على الأنسجة ، وامسحي الوسائط برفق من سطح الجسم باستخدام فرشاة طلاء.</li>
	<li>قم بإعداد شريحة المجهر ووضع قطعة صغيرة من الشريط على الوجهين في المنتصف.</li>
	<li>باستخدام فرشاة أو ملاقط دقيقة ، ضع اليرقة / الخادرة بلطف على سطح الشريط مع الجانب الظهري لأعلى وعموديا على الجانب الطويل من الشريحة. ضع ضغطا لطيفا لتوصيل اليرقة / الخادرة بسطح الشريط.</li>
	<li>قم بإعداد الشريحة على مرحلة التصوير ، واليرقة / الخادرة متجهة لأسفل.</li>
	<li>قم بتشغيل مصدر ضوء OCT بواسطة برنامج التحكم بالليزر (انظر جدول المواد). افتح برنامج التحكم SD-OCT المكتوب حسب الطلب ، ثم انقر فوق نافذة المعاينة .</li>
	<li>قم بتعيين معلمات الفحص في برنامج SD-OCT. ملاحظة: الهدف هو محاذاة العينة للحصول على التصوير الأمثل للقلب النابض، لذا فإن اختيار نطاق X ونطاق Y يغطي منطقة القلب. في هذه الخطوة ، يكون كل من عدد عمليات الفحص A و B-scans 400. النطاق في الاتجاهين x و y هو ~ 490 ميكرومتر و ~ 537 ميكرومتر ، مما يدل على المقطعين العرضيين المتعامدين للقلب (xz و yz) ، على التوالي.</li>
	<li>استخدم المتلاعبين الدقيقين للتحكم في مرحلة العينة لجلب قلب الذبابة إلى بؤرة التركيز. اضبط الوضع البؤري لتقليل انعكاس الضوء من سطح بشرة الذبابة. فكر في تطبيق الزيت المعدني على سطح اليرقة / الخادرة لتقليل الانعكاس. ملاحظة: قد يزيد الزيت من خطر حركة الحيوانات عن طريق المساس بخصائص لاصق الشريط.</li>
	<li>تأكد من أن قلب الذبابة يمكن رؤيته بالكامل في نافذة الصورة دون أي تشوهات ، وحظره بواسطة الأنسجة ، والظلال والانعكاسات التي لا تكاد تذكر ؛ وإلا، ارجع إلى الخطوة 2.7.</li>
	<li>اضبط معلمات المسح الضوئي للحصول على صورة OCT في الوضع M. ملاحظة: يتم تقليل عدد عمليات الفحص A مقارنة بالخطوة 2.7. للحصول على معدل إطارات أسرع لالتقاط ديناميكيات نبض قلب الذبابة (عدة هرتز). يشير عدد عمليات المسح الضوئي B إلى عدد الإطارات المتكررة للتصوير في الوضع M ، والتي يمكن ضبطها بناء على وقت التسجيل وذاكرة النظام المتاحة. في هذه التجربة ، يمكن أن تسمح 128 عملية مسح ضوئي A بسرعة ~ 125 إطارا / ثانية ، ويتم تسجيل 4000 عملية مسح B متكررة ، مما يوفر تسجيلا مستمرا ل ~ 32 ثانية.</li>
	<li>احصل على خمس مجموعات من بيانات التحكم بدون نبضات تحفيز الضوء الأحمر لحساب معدل ضربات القلب أثناء الراحة (RHR).</li>
	<li>صمم نبضة الضوء لتحفيز السرعة في برنامج التحكم OCT المخصص. في "الإعدادات"، أضف تسلسلات نبضات الضوء المصممة للتحكم في تردد النبضة وعرض النبضة ومدة التحفيز ووقت الانتظار وفقا لبروتوكولات التحفيز المختلفة. ملاحظة: يتم قياس RHR من تجربة التحكم بدون إضاءة ضوئية ويستخدم لحساب التردد الذي يجب أن ينبض به الضوء لتجارب عدم انتظام دقات السرعة وسرعة البطء22.</li>
	<li>افتح برنامج التحكم في الضوء (انظر جدول المواد) لإنشاء نبضات الضوء الأحمر. اختر وضع النبض في "تحديد الوضع". انقر نقرا مزدوجا فوق الشكل الخاص بإعدادات "ملف تعريف النبض" واختر وضع المتابع. حافظ على شدة OFF على أنها 0 ، واضبط النسبة المئوية لكثافة ON عند حساب كثافة الطاقة الفعلية. ملاحظة: يتم تشغيل نبضات ضوء التحفيز بواسطة إشارة من برنامج التحكم OCT وفقا للإعدادات الواردة في الخطوة 2.12.</li>
	<li>احصل على مقاطع فيديو M-mode لقلب ذبابة الفاكهة النابض مع التحفيز الضوئي بالنقر فوق اكتساب في برنامج التحكم OCT. كرر القياسات 5x.</li>
</ol>3. تحليل الصور
<ol><li>افتح برنامج تجزئة قلب الذبابة المطور خصيصا.</li>
	<li>انقر فوق تحديد ملف ثم حدد الملف المراد تحليله في واجهة المستخدم الرسومية التي تظهر.</li>
	<li>أدخل كلا من الحدود الرأسية والأفقية لمنطقة القلب بالبكسل في مربعات النص العلوية. انقر على تغيير الحجم. باستخدام شريط التمرير الموجود في الأسفل ، تأكد من أن منطقة القلب بأكملها مرئية وأنها تملأ الصندوق بأكمله للمجموعة بأكملها. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر هذه العملية واضبط الحدود.</li>
	<li>انقر فوق توقع للتنبؤ بمنطقة القلب. سيقوم البرنامج الآن بمراجعة كل شريحة في المجموعة وتحديد منطقة القلب ، ويستغرق حوالي 3 دقائق.</li>
	<li>انقر على HR Plot بمجرد اكتمال التنبؤ. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة تعرض قطعة أرض لمنطقة القلب بمرور الوقت. تأكد من اختيار مناطق الذروة أو الوادي الصحيحة. اختر Pulse ثم HR لإنشاء رقم نهائي ، وسيتم حفظ المعلمات الوظيفية في ملفات .csv في وقت واحد.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2010.">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Tsai, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning.">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li><li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy.">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li><li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+optogenetics:+a+decade+of+enlightenment.">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li><li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo.">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li><li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cardiac+function.">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li><li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies.">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li><li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation.">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li><li>Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+identification+of+genes+causing+adult+human+heart+disease.">Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).</li><li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila.">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).</li><li>Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+heart+function+in+larval+Drosophila+melanogaster+for+physiological+studies.">Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).</li><li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts:+Room+temperature,+acute+and+chronic+cold+stress.">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li><li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2++concentrations.">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).</li><li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae.">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li><li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+(OCM).">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).</li><li>Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+adult+Drosophila+melanogaster+heart+with+real-time+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography.</a> Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer's+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction.">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li><li>Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+red-light+optogenetic+control+of+Drosophila+cardiac+function.">Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function.</a> Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).</li><li>Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+pacing+in+Drosophila+melanogaster.">Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster.</a> Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).</li><li>Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chloride+flux+on+Drosophila+heart+rate.">The effects of chloride flux on Drosophila heart rate.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).</li><li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genome of Drosophila melanogaster. , (1992).</li><li>. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html</a> (2022)</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyNet+2.0:+Drosophila+heart+3D+(2D+++time)+segmentation+in+optical+coherence+microscopy+images+using+a+convolutional+long+short-term+memory+neural+network.">FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network.</a> Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-synthetic,+general-purpose+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139 (10), 56 (2019).</li><li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+genetic+screens,+and+cardiac+function.">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).</li><li>Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+homology+between+Drosophila+melanogaster+and+vertebrate+cardiovascular+systems.">Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).</li><li>Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assess+Drosophila+heart+development,+function+and+aging.">Methods to assess Drosophila heart development, function and aging.</a> Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart.">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

بالمقارنة مع تقاريرنا السابقة حيث كان التعبير عن opsins مدفوعا ليس فقط في القلب ولكن أيضا في الأنسجة العضلية المحيطة ، فإن تقارير العمل الحالية تستخدم سائقا خاصا بالقلب ، Hand-GAL4. يؤكد هذا التكوين الجيني الجديد ل Hand> opsin المستخدم في تنظيم القلب البصري الوراثي النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا ويؤسس نموذجا أفضل لأبحاث ذبابة الفاكهة القلبية الوعائية.
يعد إعداد وسائل الإعلام ضروريا لنجاح التجارب. تتطلب بروتينات Opsin شبكة شبكية متحولة بالكامل (ATR) لتعمل28. الذباب لا ينتج ما يكفي من ATR ، لذلك يجب استكمال ATR إلى وسائط الطيران. في هذه الدراسة ، تم استبدال الطعام الفوري الذي تم الإبلاغ عنه سابقا بوسائط شبه محددة29. تم تقديم الوصفة الجديدة للوسائط التي تحتوي على ATR لضمان توزيع موحد ل ATR. ATR غير قابل للذوبان في الماء. عندما يضاف مخزون ATR القائم على الإيثانول 100 mM إلى الوسائط المائية ، يتم تشتيته عن طريق دوامة القوارير التي تحتوي على وسائط دافئة شبه محددة. أيضا ، تم تخفيض تركيز ATR المبلغ عنه سابقا من 10 mM ل eNpHR2.0 و 3 mM ل ReaChR22 إلى تركيز نهائي 1 mM لكليهما. هذا التركيز كاف لضمان وظيفة eNpHR2.0 و ReaChR المناسبة.
أحد المكونات الحيوية للنجاح التجريبي هو تحسين معالجة البيانات باستخدام FlyNet 2.027. واصل المختبر تطوير هذا البرنامج لتحسين كل من الكفاءة الحسابية ودقة خوارزمية تجزئة قلب الذبابة الآلية. تستخدم أقنعة المقطع العرضي التي ينتجها هذا البرنامج لاشتقاق البيانات الفسيولوجية ذبابة الفاكهة مثل التقصير الجزئي وسرعة جدار القلب. وقد مكن هذا النهج من تحليل البيانات بكفاءة مع الحد الأدنى من الإشراف البشري، مما يجعل من الأسرع والأكثر موثوقية توصيف وظائف القلب لمجموعات بيانات تصوير القلب الذبابة الكبيرة.
لا يزال احتشاء عضلة القلب هو السبب الرئيسي للوفاة، ويساهم نقص تروية عضلة القلب في ثلثي جميع حالات قصور القلب، الذي يظهر بسرعة بين الأسباب الرئيسية للوفيات والمراضة في الولايات المتحدة30. يتطلب تطوير علاجات وأجهزة طبية جديدة معرفة عميقة بآليات اضطرابات القلب على المستويين الفسيولوجي والكيميائي الحيوي. يمكن تحقيق هذه الأهداف بمساعدة الكائنات الحية النموذجية. D. melanogaster أثبتت نفسها باعتبارها واحدة من النماذج الأكثر موثوقية وكفاءة 31،32،33،34،35. وقد ولد هذا العمل نماذج محاكاة اضطرابات القلب ذبابة الفاكهة الناجمة عن نهج البصريات الوراثية غير الغازية. يوفر تطوير تقنيات سرعة القلب البصرية غير الغازية أساسا لتطوير بديل لأجهزة سرعة القلب الكهربائية التقليدية. يسمح استخدام OCT لمراقبة وظيفة القلب في الوقت الفعلي للدراسات بتوصيف فسيولوجيا القلب ذات الصلة بدقة في نماذج ذبابة الفاكهة للتحقيقات المتقدمة ، بما في ذلك فحص مرشح الدواء. يحتوي تصوير OCT على عمق اختراق يبلغ ~ 1 مم ، والذي يعمل بشكل جيد لدراسات القلب ذبابة الفاكهة ولكنه يحد من استخدامه لتوصيف وظيفة القلب في النماذج الحيوانية الأكبر. وعلاوة على ذلك، فإن ترجمة أبحاث ذبابة الفاكهة مباشرة إلى نماذج الثدييات يمثل تحديا. هناك حاجة إلى تطوير أدوات بصرية وراثية جديدة لتحسين حساسية الأوبسينات وترجمتها إلى أنظمة نموذجية مختلفة ، بما في ذلك أسماك الزرد والفئران والجرذان والمواد العضوية في القلب البشري ، لأبحاث القلب والأوعية الدموية.

في نهاية عام 2010 ، اختارت مجلة Nature Methods علم البصريات الوراثي كطريقة للعام1. إن استخدام الأدوات الجينية (العمليات المعدلة وراثيا) التي ينظمها الضوء للتحكم في الأنسجة البيولوجية ذات الأهمية بدقة وسرعة غير مسبوقة فتح بوابة فيضان للتطبيقات الجديدة. حتى الآن ، تنتمي غالبية الإنجازات إلى علم الأعصاب. تم تقديم التكنولوجيا كطريقة جديدة للتحكم الدقيق في الخلايا العصبية المفردة2 وتقدمت إلى اكتشافات في مجال الوظائف المعرفية للكائنات الحية3. منذ البداية ، أظهر علماء الأعصاب القدرة على تعديل سلوك الكائن الحي بأكمله. تسبب التعبير والتنشيط الضوئي ل ChR2 opsin في الخلايا العصبية الدوبامينية للفئران في تنشيطها وكانت كافية لدفع التكييف السلوكي4. أدى التثبيط البصري الوراثي لمجموعة فرعية من الخلايا العصبية التي تحتوي على هالورهودوبسين NpHR2.0 الذي تم تسليمه إلى التركيز الصرعي لدماغ القوارض إلى تخفيف النوبات الكهربية الدماغية5.
تتطور التطبيقات البصرية الجينية في أمراض القلب بوتيرة ثابتة6. تم التعبير عن ChR2 بنجاح في زراعة خلايا الخلايا العضلية القلبية وفي الفئران. تم إجراء وتيرة القلب عن طريق ومضات من الضوء الأزرق (أجريت باستخدام ألياف مزروعة في الحيوانات الحية)7. في أسماك الزرد ، تم التعبير عن ChR2 واستخدامه لتحديد منطقة القلب التي تصنع السرعة. تنشيط NpHR الناجم عن السكتة القلبية8. تتمتع سرعة القلب البصرية الجينية بإمكانات فريدة لتطوير علاجات جديدة للسرعة وإعادة المزامنة9. تم الإبلاغ مؤخرا عن محاولات لإنشاء نظام إنهاء عدم انتظام ضربات القلب الذاتي وكذلك10.
تتطلب الأبحاث المكثفة وتطوير علاجات علاجية جديدة تطبيق أنظمة نموذجية مختلفة ، من زراعة الخلايا إلى الثدييات. قلب الفقاريات هو عضو معقد للغاية. تشكل الخلايا العضلية القلبية (CM) ثلث جميع خلايا القلب. وتشمل الخلايا الأخرى الخلايا العصبية، وخلايا العضلات الملساء الوعائية، والخلايا غير القابلة للإثارة (أي الخلايا البطانية، والخلايا الليفية، والخلايا المناعية). البحث في زراعة خلايا CM يحد من ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها إلى التطبيقات الطبية البشرية. إن التلاعب الجيني لكائنات النماذج الثديية محدود ويستغرق وقتا طويلا. نماذج اللافقاريات الأصغر لها العديد من المزايا. نظام القلب والأوعية الدموية يحمل جميع العناصر النسيجية الأساسية. ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة) هو نظام نموذج وراثي بسيط وقوي للتحقيق في دور الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية ، بما في ذلك أمراض القلب11،12،13. كحيوانات قصيرة العمر ، يمثل ذباب الفاكهة فرصة ممتازة لنمذجة تغيرات وظائف القلب التي تعتمد على العمر أو المرض والتي يمكن تتبعها طوال الحياة14،15،16،17. يقع أنبوب قلب ذبابة الفاكهة على الجانب الظهري من جسمها على بعد 200 ميكرومتر من سطح البشرة ، مما يسمح للضوء المرئي للأشعة تحت الحمراء القريبة بالوصول إلى أنبوب القلب. تتيح هذه الميزة التشريحية الوتيرة البصرية غير الغازية لقلب ذبابة الفاكهة باستخدام الأدوات البصرية الوراثية الموجودة.
لمراقبة قلب ذبابة الفاكهة ، تم تطوير نظام تصوير مقطعي بصري مخصص للتماسك البصري (SD-OCT) مع وحدة إثارة LED مدمجة للضوء الأحمر18. يمكن تحليل التغيرات المورفولوجية والإيقاعية في قلب ذبابة الفاكهة البسيط نسبيا بسهولة باستخدام تقنية التصوير الطبي الحيوي غير الغازية هذه12،19،20،21. مع تحسين أداء التقسيم البصري والدقة المكانية على نطاق ميكرون ، تم استخدام OCT بنجاح للتحقيق في بنية ومراقبة وظيفة قلب ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة ، بما في ذلك اليرقة 3rd instar والخادرة المبكرة18. يتيح هذا النظام أيضا المراقبة والتحفيز المتزامنين لحالة ذبابة الفاكهة القلبية في الحيوان السليم. يظهر الشكل 1 عرضا تخطيطيا لنظام OCT. يستخدم نظام SD-OCT الصمام الثنائي فائق الإضاءة (SLD) كمصدر للضوء (الطول الموجي للمركز: 850 نانومتر ± 10 نانومتر، FWHM: 165 نانومتر، انظر جدول المواد). باستخدام عدسة موضوعية 10x ، يمكن لنظام التصوير OCT تحقيق دقة محورية تبلغ ~ 4.4 ميكرومتر في الهواء و ~ 3.3 ميكرومتر في الأنسجة ودقة جانبية تبلغ ~ 2.8 ميكرومتر ، وهي كافية لحل التفاصيل الدقيقة لهياكل قلب الذبابة18,22. يتم الكشف عن إشارات التداخل للضوء المنعكس من الذراع المرجعي وذراع العينة باستخدام مقياس الطيف المزود بكاميرا مسح خطي بدقة 2048 بكسل (الحد الأقصى لمعدل الخط: 80 كيلو هرتز، انظر جدول المواد). حساسية النظام المقاسة هي ~ 95.1 ديسيبل. يقوم كل مسح ضوئي OCT في الوضع B بإنشاء صورة مقطعية عرضية في مستوى الصورة xz. يتم الحصول على صور B-mode المتكررة في نفس الموقع لإنشاء صور في الوضع M تلتقط القلب النابض لأكثر من 30 ثانيةتقريبا 18،22،23. يبلغ معدل الإطارات للتصوير في وضع M حوالي 125 إطارا / ثانية ، وهو ما يكفي لالتقاط ديناميكيات نبض قلب ذبابة الفاكهة.
من أجل التنظيم البصري الوراثي لوظيفة قلب ذبابة الفاكهة ، يتم دمج وحدة إضاءة مع مصدر ضوء LED 617 نانومتر مع ذراع العينة لنظام SD-CT. يركز ضوء التحفيز على بقعة قطرها ~ 2.2 مم على سطح العينة ، في نفس موضع بقعة تركيز التصوير. يتم استخدام برنامج مكتوب خصيصا للتحكم في وضع الإضاءة (شدة الضوء وعرض النبضة ودورة العمل) ، وضبط تردد تحفيز نبضة الضوء ، ومزامنة إضاءة وحدة LED واكتساب التصوير OCT في وضع M22.
وصفت المنشورات الحديثة نظام ذبابة الفاكهة المعدل وراثيا الذي يتكون من عمليات ChR2 و ReaChR و eNpHR2.0 المنظمة زمنيا والمكانية باستخدام النظام الوراثي UAS / GAL4. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها القدرة على بدء السكتة القلبية وبطء القلب الناجم عن تنشيط الضوء الأحمر ل eNpHR2.0 وسرعة القلب ذات التردد العالي الناجم عن تنشيط الضوء الأزرق ل ChR2. تم إجراء تجارب وتيرة مماثلة مع قناة أخرى ، ReaChR ، يمكن تحريضها بواسطة إضاءة الضوء الأحمر22،23،24. كان تعبير opsin في جميع التجارب الموصوفة مدفوعا ب 24B-GAL4 ، حيث لوحظ تعبير opsin في مجموعة واسعة من الأنسجة ، بما في ذلك الخلايا العضلية القلبية وخلايا العضلات المحيطة. في الدراسة الحالية ، تم استبدال 24B-GAL4 ببرنامج تشغيل Hand-GAL4 لتحقيق تعبير eNpHR2.0 و ReaChR opsins الخاص بالقلب.
بشكل عام ، تظهر النتائج التجريبية المقدمة سكتة قلبية قابلة للإصلاح وبطء القلب المستحث وأمراض القلب وعدم انتظام دقات القلب. يتم توفير بروتوكول مفصل مع تعليمات خطوة بخطوة حول إنشاء نماذج ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا وإجراء التصوير OCT المتزامن وتجارب السرعة البصرية الجينية في الحيوانات الحية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>18449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>02-10-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLED Light Source Control Module, 4-channel</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-SA04-US</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband Light Source Module</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>cBLMD-T-850-HP</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra-S 800 OCT Spectrometers</td>
			<td>&#160;Wasatch Photonics</td>
			<td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professtional</td>
			<td>34155</td>
			<td>tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila culture bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyNet 2.0 Software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Collimator Sources</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-LCS-0617-03-22</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-72P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow plugs for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow vials for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugs for Drosophila bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1386-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT control software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT imaging and optogenetic pacing system</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>89-2871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 41752</td>
			<td>eNpHR2.0 transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 53748</td>
			<td>ReaChR transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 48396</td>
			<td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock #6658</td>
			<td>GFP reporter line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Lab Scientific bioKEMIX</td>
			<td>978-907-4243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function

وقد ضمن استخدام ذبابة الفاكهة الميلانوغاست r (ذبابة الفاكهة) ككائن حي نموذجي تقدما كبيرا في العديد من مجالات العلوم البيولوجية ، من التنظيم الخلوي والتحقيقات الجينومية إلى الدراسات السلوكية. بسبب المعرفة العلمية المتراكمة ، في السنوات الأخيرة ، تم جلب ذبابة الفاكهة إلى مجال نمذجة الأمراض البشرية ، بما في ذلك اضطرابات القلب. يصف العمل المقدم النظام التجريبي لمراقبة وظيفة القلب والتلاعب بها في سياق كائن حي كامل باستخدام الضوء الأحمر (617 نانومتر) وبدون إجراءات غازية. تم تحقيق السيطرة على القلب باستخدام أدوات البصريات الوراثية. يجمع علم البصريات الوراثي بين التعبير عن الأوبسينات المعدلة وراثيا الحساسة للضوء وتنشيطها البصري لتنظيم الأنسجة البيولوجية ذات الاهتمام. في هذا العمل ، تم استخدام نظام التصوير المقطعي المتكامل للتماسك البصري (OCT) المخصص ونظام التحفيز البصري الوراثي لتصور وتعديل قلب D. melanogaster الوظيفي في 3rd instar larval ومراحل نمو العذراء المبكرة. تم استخدام النظام الوراثي المزدوج UAS/GAL4 للتعبير عن الهالورودوبسين (eNpHR2.0) وقناة رودوبسين ذات الانزياح الأحمر (ReaChR)، وتحديدا في قلب الذبابة. يتم توفير تفاصيل حول إعداد D. melanogaster للتصوير المباشر OCT والسرعة البصرية الوراثية. قام برنامج تكامل تم تطويره في المختبر بمعالجة بيانات التصوير لإنشاء عروض مرئية وخصائص كمية لوظيفة القلب ذبابة الفاكهة . تظهر النتائج جدوى بدء السكتة القلبية وبطء القلب الناجم عن تنشيط eNpHR2.0 وأداء سرعة القلب عند تنشيط ReaChR.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

يصف هذا البروتوكول جيل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر التي تعبر عن eNpHR2.0 أو ReaChR opsins في القلب لتصوير OCT وسرعة القلب البصرية الوراثية. تم الإبلاغ عن تعليمات مفصلة لتصوير ذبابة الفاكهة OCT وتعديل ضربات القلب ، بما في ذلك محاكاة السكتة القلبية القابلة للاستعادة ، وبطء القلب ، وعدم انتظام دقات القلب في الحيوانات الحية في مراحل النمو المختلفة.

تطوير نماذج ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر للتصوير والتحكم البصري الوراثي لوظيفة القلب

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

يقدم البروتوكول نماذج ذبابة الفاكهة حيث يمكن تمييز وظيفة القلب والتحكم فيها باستخدام الضوء. وهذا يمكن الباحثين من دراسة أمراض القلب البشرية في ذبابة الفاكهة باستخدام الحيوانات السليمة. يمكن لهذه الطريقة أن تحقق بشكل موثوق تصوير OCT غير الغازي والتحكم البصري الوراثي في وظيفة القلب ذبابة الفاكهة.لديها كفاءة وجودة عالية. يمكن أن تكون الوتيرة البصرية الجينية بديلا للوتيرة الكهربائية كعلاج لعلاج اضطرابات عدم انتظام ضربات القلب. يمكن توسيع نطاق التصوير OCT والوتيرة البصرية الجينية إلى أنظمة نموذجية أخرى مثل عضويات القلب وأسماك الحمار الوحشي والحلق الجنيني والقلب.للبدء ، اجمع بين خمسة GAL4 يدوية على TM6 أنثى عذراء مزدوجة الأنابيب واثنين إلى ثلاثة ذباب ذكور من UAS Ops و Stocks لكل قارورة. في اليوم التالي ، قم بإعداد طعام شبه محدد وفقا لتعليمات مركز بلومنجتون لذبابة الفاكهة عن طريق إضافة 5.14 جرام لكل 100 ملليلتر من السكروز إلى وعاء على طبق ساخن. ثم قم بتبريده إلى 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر.بعد ذلك ، قم بإعداد قوارير ذبابة ضيقة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الإيثانول الشبكي الشبكية بالكامل إلى 100 ملليمول إلى كل قارورة. استخدم ماصة مصلية للتخلص من خمسة ملليلترات من طعام الذبابة لكل ذبابة ضيقة. بعد الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان ، قم بتوصيل هذه القوارير ولفها في القماش الداكن لحمايتها من الضوء.في اليوم التالي ، انقل الذباب الذي يضع البيض بثبات إلى القوارير مع الإيثانول الشبكي الذي يحتوي على طعام. حماية الرفوف مع قوارير من الضوء. بعد 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على عدد البيض الموضوعة ، تخلص من الوالدين لمنع الاكتظاظ السكاني في القارورة.بعد ذلك ، جمع ذرية غير أنبوبي لتصوير القلب. اختر خيار UAS اليد GAL4 يرقة أو خادرة من القارورة ، وضعها على منديل ، وامسح الوسائط بلطف من سطح الجسم باستخدام فرشاة الطلاء. تحضير شريحة المجهر مع قطعة صغيرة من الشريط على الوجهين في الوسط.بعد ذلك ، ضع اليرقة أو الخادرة برفق على سطح الشريط مع الجانب الظهري لأعلى وعموديا على الجانب الطويل من الشريحة باستخدام فرشاة أو ملاقط دقيقة. ضع ضغطا لطيفا لتوصيل اليرقة أو الخادرة بسطح الشريط. الآن ، قم بإعداد الشريحة على مرحلة التصوير مع توجيه اليرقة أو الخادرة لأسفل وتشغيل التصوير المقطعي للتماسك البصري أو مصدر ضوء OCT بواسطة برنامج التحكم بالليزر.افتح برنامج التحكم OCT المخصص للمجال الطيفي المكتوب. ثم انقر فوق نافذة المعاينة. ثم قم بتعيين معلمات المسح الضوئي في برنامج OCT للمجال الطيفي.استخدم المتلاعبين الدقيقين للتحكم في مرحلة العينة لجلب قلب الذبابة إلى بؤرة التركيز. اضبط الوضع البؤري لتقليل انعكاس الضوء من سطح بشرة الذبابة. أيضا ، فكر في تطبيق الزيت المعدني على سطح اليرقة أو الخادرة لتقليل الانعكاس.بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات المسح الضوئي للحصول على صورة OCT في الوضع M والحصول على خمس مجموعات من بيانات التحكم بدون نبضات تحفيز الضوء الأحمر لحساب معدل ضربات القلب أثناء الراحة. صمم نبضة الضوء لتحفيز السرعة في برنامج التحكم OCT المخصص. لهذا ، انقر فوق علامات تبويب الإعدادات وأضف تسلسلات نبضات الضوء المصممة للتحكم في تردد النبض وعرض النبضة ومدة التحفيز ووقت الانتظار وفقا لبروتوكولات التحفيز المختلفة.ثم افتح برنامج التحكم في الضوء لتوليد نبضات الضوء الأحمر. اختر وضع النبض في تحديد الوضع. انقر نقرا مزدوجا فوق الشكل الخاص بإعدادات ملف تعريف النبض، واختر وضع المتابع.حافظ على شدة التوقف عند الصفر واضبط النسبة المئوية للكثافة عند حساب كثافة الطاقة الفعلية. احصل على مقاطع فيديو في وضع M لقلب ذبابة الفاكهة النابض مع التحفيز الخفيف بالنقر فوق اكتساب في برنامج OCT Control. سجل ومضات من الضوء الأحمر أسفل قلب الذبابة أثناء الحصول على التصوير.لاحظ أن إعدادات السرعة المختلفة مطلوبة للتحكم في وظيفة قلب الذبابة باستخدام طرز ذبابة channelrhodopsin و NPHR ذات الانزياح الأحمر. افتح برنامج تجزئة قلب الذبابة المطور المخصص وانقر على ملف محدد. ثم حدد الملف المراد تحليله في واجهة المستخدم الرسومية.أدخل كلا من الحدود الرأسية والأفقية لمنطقة القلب بالبكسل في مربعات النص العلوية. انقر على تغيير الحجم. باستخدام شريط التمرير الموجود في الأسفل ، تأكد من أن منطقة القلب بأكملها مرئية وأنها تملأ الصندوق بأكمله للمجموعة بأكملها.بعد النقر فوق علامة التبويب "توقع" ، سيمر البرنامج عبر كل شريحة في المجموعة ويحدد منطقة القلب في حوالي ثلاث دقائق. بمجرد اكتمال التنبؤ ، انقر فوق مخطط الموارد البشرية لعرض مخطط لمنطقة القلب بمرور الوقت في نافذة جديدة. حدد مناطق الذروة أو الوادي الصحيحة ، واختر النبض ثم علامات تبويب الموارد البشرية لإنشاء شكل نهائي.سيتم حفظ المعلمات الوظيفية في وقت واحد في ملفات CSV. تم التحقق من خصوصية الأنسجة لسائق GAL4 اليدوي عن طريق تصوير تعبير البروتين الفلوري الأخضر. يتم عرض صور OCT النموذجية للمقطع العرضي لليرقات والعذراء هنا.لتقليد أمراض القلب المختلفة ، تم تصميم أربعة أنواع من نبضات الضوء. نبضة واحدة تستمر 10 ثوان بعد خمس ثوان من وقت الانتظار ، ولدت سكتة قلبية قابلة للترميم. بالنسبة لسرعة القلب عند ترددات أقل من معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، تم استخدام تسلسلين لنبضات الضوء بترددات سرعة تساوي نصف معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، وربع معدل ضربات القلب أثناء الراحة لمدة ثماني ثوان مع وقت انتظار مدته ست ثوان بينهما.يتكون نمط التحفيز لزيادة معدل ضربات القلب بسبب تنشيط قناة رودوبسين ذات الانزياح الأحمر من ثلاث تسلسلات من نبضات الضوء. أدى انخفاض وتيرة تقلص القلب بعد الإشارات الضوئية إلى تباطؤ معدل ضربات القلب الذي يحاكي اليرقة والخادرة. تم تطبيق سلسلة من ثلاثة قطارات نبضات ضوئية بترددات تحفيز مختلفة على اليرقات وأظهرت قلوب الشرانق بوضوح زيادة معدل ضربات القلب بعد نبضات الضوء.يعد اختيار إعداد النسل الصحيح ، وتركيب العينة ، وإجراء التصوير أمرا ضروريا. نأمل في نقل تكنولوجيا الوتيرة البصرية الجينية إلى نماذج حيوانية أكبر ، لدراسة أمراض قلب الثدييات واستكشاف طرق علاجية جديدة لعلاج عدم انتظام ضربات القلب.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

في فيفو التقييم الكمي للبنية عضلة القلب، وظيفة، الإرواء والجدوى عن طريق احتساب الصغرى القلب المقطعي

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

تحجيم نموذج تشريحي إنشاء الطبية الحيوية بيانات التصوير الشعاعي الطبقي والأفراد المرتبطين تسميات اللاحقة سطح الفرعي النقش بالليزر (SSLE) من بلورات الزجاج

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

استهداف مساحات الألياف العصبية للعلاج تحفيز الدماغ العميق باستخدام نماذج تفاعلية، والخاصة بالمريض

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

بناء نظام إضاءة بسيط ومتعدد الاستخدامات لتجارب البصريات الوراثية

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

تطوير أنسجة القلب البشرية المنظمة ثلاثية الأبعاد ضمن منصة ميكروفلويديك

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

القياس الكمي لوظيفة البطين الأيسر لقلب الفأر، وسلالة عضلة القلب، والقوى الديناميكية الدموية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي القلبي الوعائي

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

إنشاء نماذج القلب السيليكون المريض محددة مع تطبيقات في خطط ما قبل الجراحة والتدريب العملي على

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...