Name: developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00
Duration: 8 min 43 s
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Les auteurs remercient Andrey Komarov, Yuxuan Wang et Jiantao Zhu pour leur aide dans l’analyse des données et remercient les membres du laboratoire Zhou pour leurs précieuses discussions. Les travaux dans le laboratoire du Dr Zhou ont été soutenus par un fonds de démarrage de l’Université Washington à St. Louis, les subventions R01-EB025209 et R01-HL156265 des National Institutes of Health (NIH) et le prix de recherche innovante de la Fondation Clayco.

Pour la présente étude, la lignée transgénique eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgénique w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, et pilote GAL4 spécifique du cœur contenant le fragment régulateur du gène de la main w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (ce stock de pilotes sera indiqué comme Hand-GAL4) ont été utilisés. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 a été utilisé comme ligne de rapporteur GFP. Les stocks de drosophiles mentionnés ont été obtenus auprès du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, voir le tableau des matériaux) et maintenus à température ambiante ou à 18 °C sur des milieux de semoule de maïs standard. Les modèles de drosophile développés dans cette étude sont disponibles sur demande pour un travail collaboratif.
1. Croisements génétiques de drosophile et préparation des milieux
<ol><li>Changer le 3ème équilibreur chromosomique TM3 Sb[1] en TM6 Sb Tb, créant w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Voir la figure supplémentaire 1 pour le schéma de franchissement. Placer les croix dans des flacons avec des milieux de semoule de maïs ordinaires. REMARQUE : La présence d’un marqueur de la tuberculose permet aux utilisateurs de distinguer les larves et les pupes contenant le transgène de l’opsine et le pilote GAL4 des animaux contenant de l’opsine mais pas de pilote25.</li>
	<li>Conservez les croisements génétiques dans un incubateur à 25 °C, 70 % d’humidité sur un milieu contenant de la rétineI (ATR) entièrement trans (ATR) spécialement formulé (voir le tableau des matériaux) dans l’obscurité pendant 5 jours pour la collecte des larves et 6 jours pour la collecte des nymphes.</li>
	<li>Combinez cinq femelles vierges Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb et deux à trois mâles provenant de stocks d’UAS-opsin (eNpHR2.0 ou ReaChR) par flacon. Voir le diagramme croisé pour l’opsine eNpHR2.0 et ReaChR à la figure 2A et à la figure 2B, respectivement.</li>
	<li>Le lendemain, préparez des flacons contenant des ATR.<ol><li>Préparer des aliments semi-définis selon les instructions de BDSC26. Au lieu de saccharose et de glucose, ajoutez uniquement du saccharose (5,14 g/100 mL). Refroidir à ~60 °C sous agitation constante.</li>
		<li>Préparer des flacons anti-mouches étroits et ajouter 50 μL de solution ATR-éthanol de 100 mM à chaque flacon.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette sérologique, jeter la nourriture pour mouches dans des flacons étroits de mouches, 5 mL par flacon. Vortex à vitesse maximale pendant 10 s.</li>
		<li>Branchez les flacons et enveloppez-les dans le tissu foncé pour les protéger de la lumière. Laisser sécher les flacons pendant au moins 12 h (toute la nuit).</li>
	</ol></li>
	<li>Le lendemain, transférez les mouches pondant régulièrement des œufs de l’étape 1.3. aux flacons contenant des aliments contenant de l’ATR (étape 1.4.4.). Protégez les racks avec des flacons de la lumière.</li>
	<li>Après 24-48 h (en fonction du nombre d’œufs pondus), jetez les parents pour éviter la surpopulation des flacons.</li>
	<li>Recueillir des descendants autres que la tuberculose et les utiliser pour l’imagerie cardiaque. REMARQUE : Les différences phénotypiques aux stades larvaire et nymphal sont illustrées à la figure 2C. Le résumé et le calendrier approximatif des étapes de préparation des échantillons sont présentés à la figure 3.</li>
</ol>2. Contrôle optogénétique du cœur de la drosophile 
<ol><li>Prélevez la larve/nymphe UAS-opsin/Hand-GAL4 dans le flacon (étape 1.7.), appliquez du mouchoir en papier et essuyez délicatement le média de la surface du corps à l’aide d’un pinceau.</li>
	<li>Préparez la lame de microscope et placez un petit morceau de ruban adhésif double face au milieu.</li>
	<li>À l’aide d’une brosse ou d’une pince à épiler fine, placer délicatement la larve ou la nymphe sur la surface de la bande, la face dorsale vers le haut et perpendiculairement au côté long de la lame. Appliquez une légère pression pour attacher la larve / nymphe à la surface de la bande.</li>
	<li>Installez la lame sur la scène d’imagerie, larve/nymphe tournée vers le bas.</li>
	<li>Allumez la source lumineuse OCT à l’aide d’un logiciel de contrôle laser (voir Tableau des matériaux). Ouvrez le logiciel de contrôle SD-OCT personnalisé, puis cliquez sur la fenêtre Aperçu .</li>
	<li>Définissez les paramètres d’analyse dans le logiciel SD-OCT. REMARQUE: L’objectif est d’aligner l’échantillon pour une imagerie optimale du cœur battant, de sorte que la sélection de la plage X et de la plage Y couvre la région du cœur. À cette étape, le nombre de balayages A et B est de 400. La plage dans les directions x et y est de ~490 μm et ~537 μm, montrant les deux sections transversales orthogonales du cœur (xz et yz), respectivement.</li>
	<li>Utilisez des micromanipulateurs pour contrôler l’étape de l’échantillon afin de mettre au point le cœur de mouche. Ajustez la position focale pour minimiser la réflexion de la lumière de la surface de la cuticule de la mouche. Envisagez d’appliquer de l’huile minérale sur la surface de la larve ou de la nymphe pour minimiser la réflexion. NOTE: L’huile peut augmenter le risque de mouvement des animaux en compromettant les propriétés adhésives du ruban.</li>
	<li>S’assurer que le cœur de mouche peut être entièrement visualisé dans la fenêtre d’image sans aucune distorsion, en étant bloqué par des tissus, des ombres et des reflets non négligeables; sinon, revenez à l’étape 2.7.</li>
	<li>Définissez les paramètres de numérisation pour l’acquisition d’images OCT en mode M. REMARQUE: Le nombre de A-scans est réduit par rapport à l’étape 2.7. pour une fréquence d’images plus rapide afin de capturer la dynamique battante du cœur de mouche (plusieurs Hz). Le nombre de balayages B indique le nombre d’images répétées pour l’imagerie en mode M, qui peut être ajusté en fonction de la durée d’enregistrement et de la mémoire système disponible. Dans cette expérience, 128 balayages A peuvent permettre une vitesse de ~125 images / s, et 4 000 balayages B répétés sont enregistrés, fournissant un enregistrement continu de ~32 s.</li>
	<li>Acquérir cinq ensembles de données de contrôle sans impulsions de stimulation de la lumière rouge pour calculer la fréquence cardiaque au repos (RHR).</li>
	<li>Concevez l’impulsion lumineuse pour la stimulation de la stimulation dans le logiciel de contrôle OCT personnalisé. Dans « Paramètres », ajoutez les séquences d’impulsions lumineuses conçues pour contrôler la fréquence des impulsions, la largeur des impulsions, la durée de stimulation et le temps d’attente selon différents protocoles de stimulation. NOTE: Le RHR est mesuré à partir de l’expérience de contrôle sans éclairage lumineux et utilisé pour calculer la fréquence à laquelle la lumière doit être pulsée pour les expériences de tachypacing et de bradypacing22.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel du contrôleur de lumière (voir le tableau des matériaux) pour générer des impulsions de lumière rouge. Choisissez le mode d’impulsion dans « Sélection du mode ». Double-cliquez sur la figure des paramètres « Profil d’impulsion » et choisissez Mode suiveur. Conservez l’intensité OFF sur 0 et définissez le pourcentage d’intensité ON lors du calcul de la densité de puissance réelle. REMARQUE: Les impulsions lumineuses de stimulation sont déclenchées par un signal du logiciel de contrôle OCT conformément aux paramètres de l’étape 2.12.</li>
	<li>Acquérir des vidéos en mode M du cœur battant de la drosophile avec stimulation lumineuse en cliquant sur Acquérir dans le logiciel de contrôle OCT. Répétez les mesures 5x.</li>
</ol>3. Analyse d’images
<ol><li>Ouvrez le logiciel de segmentation de cœur de mouche développé sur mesure.</li>
	<li>Cliquez sur Sélectionner un fichier, puis sélectionnez le fichier à analyser dans l’interface graphique qui apparaît.</li>
	<li>Entrez les limites verticales et horizontales de la région du cœur en pixels dans les zones de texte supérieures. Cliquez sur Redimensionner. À l’aide du curseur en bas, assurez-vous que toute la région du cœur est visible et qu’elle remplit toute la boîte pour toute la collection. Si ce n’est pas le cas, répétez ce processus et ajustez les limites.</li>
	<li>Cliquez sur Prédire pour prédire la région du cœur. Le programme passera maintenant en revue chaque tranche de la collection et sélectionnera la région du cœur, ce qui prendra environ 3 minutes.</li>
	<li>Cliquez sur HR Plot une fois la prédiction terminée. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre affichant un tracé de la zone du cœur au fil du temps. Assurez-vous que les zones de pic ou de vallée correctes sont sélectionnées. Choisissez Pulse , puis HR pour générer un chiffre final, et les paramètres fonctionnels seront enregistrés simultanément dans les fichiers .csv.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Par rapport à nos rapports précédents où l’expression des opsines était conduite non seulement dans le cœur, mais aussi dans les tissus musculaires environnants, les rapports de travail actuels utilisant un pilote spécifique au cœur, Hand-GAL4. Cette nouvelle configuration génétique Hand> opsin utilisée pour la régulation cardiaque optogénétique confirme les résultats précédemment rapportés et établit un meilleur modèle de recherche cardiovasculaire sur la drosophile .
La préparation des milieux est essentielle au succès des expériences. Les protéines d’opsine nécessitent un ligand, le tout-trans rétinien (ATR), pour fonctionner28. Les mouches ne produisent pas assez d’ATR, de sorte que l’ATR doit être complété aux milieux de mouche. Dans cette étude, l’aliment instantané précédemment rapporté a été remplacé par un milieu semi-défini29. La nouvelle recette de supports contenant de l’ATR a été introduite pour assurer une distribution uniforme de l’ATR. L’ATR n’est pas soluble dans l’eau; lorsque du stock d’ATR 100 mM à base d’éthanol est ajouté aux milieux à base d’eau, il est dispersé par vortex dans les flacons contenant des milieux semi-définis chauds. De plus, la concentration d’ATR précédemment signalée a été réduite de 10 mM pour eNpHR2.0 et de 3 mM pour ReaChR22 à une concentration finale de 1 mM pour les deux. Cette concentration est suffisante pour assurer la bonne fonction eNpHR2.0 et ReaChR.
Un élément essentiel du succès expérimental est l’amélioration du traitement des données avec FlyNet 2.027. Le laboratoire a continué à développer ce logiciel pour améliorer à la fois l’efficacité de calcul et la précision de l’algorithme automatisé de segmentation du cœur de mouche. Les masques en coupe transversale produits par ce logiciel sont utilisés pour dériver des données physiologiques de la drosophile telles que le raccourcissement fractionné et la vitesse de la paroi cardiaque. Cette approche a permis une analyse efficace des données avec une supervision humaine minimale, ce qui rend plus rapide et plus fiable la caractérisation de la fonction cardiaque pour les grands ensembles de données d’imagerie cardiaque de mouches.
L’infarctus du myocarde reste la principale cause de décès, et l’ischémie myocardique contribue aux deux tiers de tous les cas d’insuffisance cardiaque, qui émerge rapidement parmi les principales causes de mortalité et de morbidité aux États-Unis30. Le développement de nouveaux dispositifs thérapeutiques et médicaux nécessite une connaissance approfondie des mécanismes des troubles cardiaques aux niveaux physiologique et biochimique. Ces objectifs peuvent être atteints avec l’aide d’organismes modèles. D. melanogaster s’est imposé comme l’un des modèles les plus fiables et les plus efficaces 31,32,33,34,35. Ces travaux ont généré les modèles simulés de troubles cardiaques de la drosophile induits par une approche optogénétique non invasive. Le développement de technologies de stimulation cardiaque optique non invasives fournit une base pour le développement d’une alternative aux dispositifs de stimulation cardiaque électrique traditionnels. L’utilisation de la TCO pour observer la fonction cardiaque en temps réel permet aux études de caractériser avec précision la physiologie cardiaque pertinente dans les modèles de drosophile pour des investigations avancées, y compris le dépistage de candidats médicaments. L’imagerie OCT a une profondeur de pénétration de ~1 mm, ce qui fonctionne bien pour les études cardiaques sur la drosophile, mais limite son utilisation pour caractériser la fonction cardiaque dans des modèles animaux plus grands. De plus, traduire directement la recherche sur la drosophile en modèles de mammifères représente un défi. De nouveaux outils optogénétiques doivent être développés pour améliorer la sensibilité des opsines et les traduire en divers systèmes modèles, y compris le poisson zèbre, la souris, le rat et les organoïdes cardiaques humains, pour la recherche cardiovasculaire.

Fin 2010, la revue Nature Methods a sélectionné l’optogénétique comme méthode de l’année1. L’utilisation d’outils génétiques (opsines transgéniques) régulées par la lumière pour contrôler les tissus biologiques d’intérêt avec une précision et une rapidité sans précédent a ouvert la voie à de nouvelles applications. À ce jour, la majorité des réalisations appartiennent aux neurosciences. La technologie a été introduite comme une nouvelle méthode de contrôle précis des neurones individuels2 et a progressé vers des découvertes dans le domaine des fonctions cognitives des organismes vivants3. Dès le début, les neuroscientifiques ont démontré la capacité de moduler le comportement de l’organisme entier. L’expression et l’activation lumineuse de l’opsine ChR2 chez les neurones dopaminergiques de souris ont provoqué leur activation et ont été suffisantes pour conduire le conditionnement comportemental4. L’inhibition optogénétique d’un sous-ensemble de neurones contenant de l’halorhodopsine NpHR2.0 délivrée au foyer épileptique du cerveau des rongeurs a entraîné une atténuation des crises électroencéphalographiques5.
Les applications optogénétiques en cardiologie se développent à un rythme soutenu6. ChR2 a été exprimé avec succès dans la culture cellulaire de cardiomyocytes et chez la souris; La stimulation cardiaque a été réalisée par des éclairs de lumière bleue (réalisée à l’aide d’une fibre implantée chez des animaux vivants)7. Chez le poisson zèbre, ChR2 a été exprimé et utilisé pour identifier la région cardiaque qui fait le rythme; L’activation de la NpHR a provoqué un arrêt cardiaque8. La stimulation cardiaque optogénétique a le potentiel unique de développer de nouvelles thérapies de stimulation et de resynchronisation9. Des tentatives d’établissement d’un système de terminaison d’arythmie autogène ont également été signalées récemment10.
Des recherches approfondies et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nécessitent l’application de divers systèmes modèles, de la culture cellulaire aux mammifères. Le cœur d’un vertébré est un organe très complexe. Les cardiomyocytes (CM) représentent un tiers de toutes les cellules cardiaques; Les autres cellules comprennent les neurones, les cellules musculaires lisses vasculaires et les cellules non excitables (c.-à-d. les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires). La recherche sur la culture cellulaire CM limite la traduction des résultats obtenus aux applications médicales humaines. Les manipulations génétiques des organismes modèles de mammifères sont limitées et prennent beaucoup de temps. Les modèles d’invertébrés plus petits présentent de nombreux avantages; Leur système cardiovasculaire porte tous les éléments histologiques essentiels. Drosophila melanogaster (mouche des fruits) est un système de modèle génétique simple et puissant pour étudier le rôle des gènes associés aux maladies humaines, y compris les maladies cardiaques11,12,13. En tant qu’animaux à courte durée de vie, les mouches des fruits représentent une excellente occasion de modéliser les changements de la fonction cardiaque liés à l’âge ou à la maladie qui peuvent être retracés tout au long de la vie14,15,16,17. Le tube cardiaque de la mouche des fruits est situé sur la face dorsale de son corps à moins de 200 μm de la surface de la cuticule, permettant à la lumière visible à proche infrarouge d’atteindre le tube cardiaque. Cette caractéristique anatomique permet une stimulation optique non invasive du cœur de la drosophile à l’aide d’outils optogénétiques existants.
Pour surveiller le cœur de la drosophile, un système d’imagerie personnalisé de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) avec un module d’excitation LED à lumière rouge intégré a été développé18. Les changements morphologiques et rythmiques dans un cœur de mouche des fruits relativement simple peuvent être facilement analysés avec cette technologie d’imagerie biomédicale non invasive 12,19,20,21. Grâce à des performances de sectionnement optique améliorées et à une résolution spatiale à l’échelle du micron, l’OCT a été utilisée avec succès pour étudier la structure et surveiller la fonction du cœur de la drosophile à différents stades de développement, y compris la larve du 3ème stade et la pupeprécoce 18. Ce système permet également de surveiller et de stimuler simultanément l’état cardiaque de la drosophile chez l’animal intact. Une vue schématique du système de l’OPO est illustrée à la figure 1. Le système SD-OCT utilise une diode superluminescente (SLD) comme source lumineuse (longueur d’onde centrale : 850 nm ± 10 nm, FWHM : 165 nm, voir Tableau des matériaux). En utilisant une lentille d’objectif 10x, le système d’imagerie OCT peut atteindre une résolution axiale de ~4,4 μm dans l’air et ~3,3 μm dans les tissus et une résolution latérale de ~2,8 μm, suffisante pour résoudre les détails fins des structures cardiaques de la mouche18,22. Les signaux d’interférence de la lumière réfléchie du bras de référence et du bras d’échantillonnage sont détectés à l’aide d’un spectromètre équipé d’une caméra à balayage linéaire de 2048 pixels (débit de ligne maximal : 80 kHz, voir le tableau des matériaux). La sensibilité du système mesurée est de ~95,1 dB. Chaque balayage OCT en mode B génère une image en coupe transversale dans le plan de l’image xz. Des images répétées en mode B sont acquises au même endroit pour créer des images en mode M capturant le cœur battant pendant plus de ~30 s 18,22,23. La fréquence d’images pour l’imagerie en mode M est de ~125 images / s, suffisante pour capturer la dynamique de battement du cœur de la mouche des fruits.
Pour la régulation optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile , un module d’éclairage avec une source lumineuse LED de 617 nm est intégré au bras échantillon du système SD-OCT. La lumière de stimulation est focalisée sur une tache de ~2,2 mm de diamètre sur la surface de l’échantillon, à la même position que la tache focale d’imagerie. Un logiciel personnalisé est utilisé pour contrôler le mode d’éclairage (intensité lumineuse, largeur d’impulsion et rapport cyclique), ajuster la fréquence de stimulation des impulsions lumineuses et synchroniser l’éclairage du module LED et l’acquisition d’images OCT en mode M22.
Des publications récentes ont décrit le système transgénique de la drosophile constitué d’opsines ChR2, ReaChR et eNpHR2.0 régulées spatio-temporellement en utilisant le système génétique UAS/GAL4. Les résultats obtenus ont démontré la capacité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation de la lumière rouge de l’eNpHR2.0 et une stimulation cardiaque à fréquence plus élevée causée par l’activation de la lumière bleue de ChR2. Des expériences de stimulation similaires ont été réalisées avec une autre channelrhodopsine, ReaChR, inductible par l’éclairage à la lumière rouge22,23,24. L’expression de l’opsine dans toutes les expériences décrites a été déterminée par 24B-GAL4, où l’expression de l’opsine a été observée dans un large éventail de tissus, y compris les cardiomyocytes et les cellules musculaires environnantes. Dans la présente étude, le 24B-GAL4 a été remplacé par un pilote Hand-GAL4 pour obtenir une expression d’opsines eNpHR2.0 et ReaChR spécifique au cœur.
Dans l’ensemble, les résultats expérimentaux présentés démontrent un arrêt cardiaque réparateur et des affections cardiaques inductibles de bradycardie et de tachycardie. Un protocole détaillé avec des instructions étape par étape sur la création de modèles de drosophile transgénique et la réalisation simultanée d’expériences d’imagerie OCT et de stimulation optogénétique sur des animaux vivants est fourni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>18449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>02-10-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLED Light Source Control Module, 4-channel</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-SA04-US</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband Light Source Module</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>cBLMD-T-850-HP</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra-S 800 OCT Spectrometers</td>
			<td>&#160;Wasatch Photonics</td>
			<td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professtional</td>
			<td>34155</td>
			<td>tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila culture bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyNet 2.0 Software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Collimator Sources</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-LCS-0617-03-22</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-72P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow plugs for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow vials for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugs for Drosophila bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1386-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT control software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT imaging and optogenetic pacing system</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>89-2871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 41752</td>
			<td>eNpHR2.0 transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 53748</td>
			<td>ReaChR transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 48396</td>
			<td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock #6658</td>
			<td>GFP reporter line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Lab Scientific bioKEMIX</td>
			<td>978-907-4243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function

L’utilisation de Drosophila melanogaster (mouche des fruits) comme organisme modèle a permis des progrès significatifs dans de nombreux domaines de la science biologique, de l’organisation cellulaire et des enquêtes génomiques aux études comportementales. En raison des connaissances scientifiques accumulées, ces dernières années, la drosophile a été amenée dans le domaine de la modélisation des maladies humaines, y compris les troubles cardiaques. Le travail présenté décrit le système expérimental de surveillance et de manipulation de la fonction cardiaque dans le contexte d’un organisme vivant entier utilisant la lumière rouge (617 nm) et sans procédures invasives. Le contrôle du cœur a été réalisé à l’aide d’outils optogénétiques. L’optogénétique combine l’expression d’opsines transgéniques sensibles à la lumière et leur activation optique pour réguler le tissu biologique d’intérêt. Dans ce travail, un système intégré personnalisé d’imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) et de stimulation optogénétique a été utilisé pour visualiser et moduler le fonctionnement du cœur de D. melanogaster au stade larvaire du 3e stade et au début du développement nymphal. Le système génétique double UAS/GAL4 a été utilisé pour exprimer l’halorhodopsine (eNpHR2.0) et la channelrhodopsine décalée vers le rouge (ReaChR), en particulier dans le cœur de mouche. Des détails sur la préparation de D. melanogaster à l’imagerie OCT vivante et à la stimulation optogénétique sont fournis. Un logiciel d’intégration développé en laboratoire a traité les données d’imagerie pour créer des présentations visuelles et des caractéristiques quantitatives de la fonction cardiaque de la drosophile . Les résultats démontrent la faisabilité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation d’eNpHR2.0 et d’effectuer une stimulation cardiaque lors de l’activation de ReaChR.

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Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Le présent protocole décrit la génération d’opsines de Drosophila melanogaster exprimant des opsines eNpHR2.0 ou ReaChR dans le cœur pour l’imagerie OCT et la stimulation cardiaque optogénétique. Des instructions détaillées pour l’imagerie de la TCO de la drosophile et la modulation des battements cardiaques, y compris la simulation d’un arrêt cardiaque réparable, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez des animaux vivants à différents stades de développement, sont rapportées.

Développement de modèles de Drosophila melanogaster pour l’imagerie et le contrôle optogénétique de la fonction cardiaque

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

Le protocole présente des modèles de drosophile où la fonction cardiaque peut être caractérisée et contrôlée à l’aide de la lumière. Cela permet aux chercheurs d’étudier les maladies cardiaques humaines chez la drosophile en utilisant des animaux intacts. Cette méthode permet d’obtenir de manière fiable une imagerie OCT non invasive et un contrôle optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile.Il a une efficacité et une qualité élevées. La stimulation optogénétique peut potentiellement être une alternative à la stimulation électrique comme thérapie pour traiter les troubles arythmiques. L’imagerie OCT et la stimulation optogénétique peuvent être étendues à d’autres systèmes modèles tels que les organoïdes cardiaques, le poisson zèbre et la gorge et le cœur embryonnaires.Pour commencer, combinez cinq mains GAL4 sur TM6 femelle vierge à double tubby et deux à trois mouches mâles de UAS Ops et Stocks par flacon. Le lendemain, préparez des aliments semi-définis selon les instructions du Bloomington Drosophila Stock Center en ajoutant 5,14 grammes par 100 millilitres de saccharose dans un récipient sur une plaque chauffante. Ensuite, refroidissez-le à 60 degrés Celsius en remuant constamment.Ensuite, préparez des flacons étroits contre les mouches en ajoutant 50 microlitres de solution d’éthanol rétinien tout-trans de 100 millimolaires à chaque flacon. Utilisez une pipette sérologique pour éliminer cinq millilitres de nourriture pour mouches par mouche étroite. Après avoir vortex à vitesse maximale pendant 10 secondes, branchez ces flacons et enveloppez-les dans le tissu sombre pour les protéger de la lumière.Le lendemain, transférer les mouches pondant régulièrement des œufs dans les flacons avec de la nourriture contenant de l’éthanol rétinien entièrement trans. Protégez les racks avec des flacons de la lumière. Après 24 à 48 heures, selon le nombre d’œufs pondus, jetez les parents pour éviter la surpopulation des flacons.Ensuite, prélevez la progéniture non tubby pour l’imagerie cardiaque. Choisissez la larve ou la nymphe GAL4 de l’option UAS dans le flacon, placez-la sur un mouchoir en papier et essuyez doucement le support de la surface du corps à l’aide d’un pinceau. Préparez la lame de microscope avec un petit morceau de ruban adhésif double face au milieu.Ensuite, placez doucement la larve ou la nymphe sur la surface de la bande avec le côté dorsal vers le haut et perpendiculairement au côté long de la lame à l’aide d’une brosse ou d’une pince à épiler fine. Appliquez une légère pression pour attacher la larve ou la nymphe à la surface de la bande. Maintenant, installez la lame sur la scène d’imagerie avec la larve ou la nymphe tournée vers le bas et allumez la tomographie par cohérence optique ou la source de lumière OCT par un logiciel de contrôle laser.Ouvrez le logiciel de contrôle OCT de domaine spectral écrit personnalisé. Ensuite, cliquez sur la fenêtre d’aperçu. Ensuite, définissez les paramètres de numérisation dans le logiciel OCT du domaine spectral.Utilisez des micro-manipulateurs pour contrôler l’étape de l’échantillon afin de mettre au point le cœur de mouche. Ajustez la position focale pour minimiser la réflexion de la lumière de la surface de la cuticule de la mouche. Pensez également à appliquer de l’huile minérale sur la surface de la larve ou de la nymphe pour minimiser la réflexion.Ensuite, définissez les paramètres de numérisation pour l’acquisition d’images OCT en mode M et acquérez cinq ensembles de données de contrôle sans impulsions de stimulation de la lumière rouge pour calculer la fréquence cardiaque au repos. Concevez l’impulsion lumineuse pour la stimulation de la stimulation dans le logiciel de contrôle OCT personnalisé. Pour cela, cliquez sur les onglets des paramètres et ajoutez les séquences d’impulsions lumineuses conçues pour contrôler la fréquence d’impulsion, la largeur d’impulsion, la durée de stimulation et le temps d’attente selon différents protocoles de stimulation.Ouvrez ensuite le logiciel de contrôle de lumière pour générer des impulsions de lumière rouge. Choisissez le mode d’impulsion dans la sélection du mode. Double-cliquez sur la figure correspondant aux paramètres du profil d’impulsion, puis choisissez le mode suiveur.Maintenez l’intensité off à zéro et réglez le pourcentage d’intensité activé lors du calcul de la densité de puissance réelle. Acquérir des vidéos en mode M du cœur battant de la drosophile avec stimulation lumineuse en cliquant sur Acquérir dans le logiciel de contrôle OCT. Enregistrez les éclairs de lumière rouge dans le cœur de la mouche pendant l’acquisition de l’imagerie.Notez que différents paramètres de stimulation sont nécessaires pour contrôler la fonction cardiaque de la mouche avec des modèles de channelrhodopsine décalée vers le rouge et de mouches NPHR. Ouvrez le logiciel de segmentation de cœur de mouche développé sur mesure et cliquez sur sélectionner un fichier. Sélectionnez ensuite le fichier à analyser dans l’interface utilisateur graphique.Entrez les limites verticales et horizontales de la région du cœur en pixels dans les zones de texte supérieures. Cliquez sur redimensionner. À l’aide du curseur en bas, assurez-vous que toute la région du cœur est visible et qu’elle remplit toute la boîte pour toute la collection.Après avoir cliqué sur l’onglet prédire, le programme passera en revue chaque tranche de la collection et sélectionnera la région du cœur en trois minutes environ. Une fois la prédiction terminée, cliquez sur le graphique HR pour afficher un tracé de la région du cœur au fil du temps dans une nouvelle fenêtre. Sélectionnez les zones de pic ou de vallée correctes, choisissez le pouls, puis les onglets HR pour générer un chiffre final.Les paramètres fonctionnels seront enregistrés simultanément dans les fichiers CSV. La spécificité tissulaire du pilote GAL4 de la main a été vérifiée par imagerie de l’expression de protéines fluorescentes vertes. Les images typiques de la TCO de la coupe transversale des larves et des nymphes sont présentées ici.Pour imiter différentes affections cardiaques, quatre types d’impulsions lumineuses ont été conçus. Une seule impulsion d’une durée de 10 secondes après cinq secondes d’attente a généré un arrêt cardiaque réparateur. Pour la stimulation cardiaque à des fréquences inférieures à la fréquence cardiaque au repos, deux séquences d’impulsions lumineuses avec des fréquences de stimulation égales à la moitié de la fréquence cardiaque au repos et un quart de la fréquence cardiaque au repos d’une durée de huit secondes avec un temps d’attente de six secondes entre les deux ont été utilisées.Le schéma de stimulation pour augmenter la fréquence cardiaque due à l’activation de la channelrhodopsine décalée vers le rouge consistait en trois séquences d’impulsions lumineuses. La fréquence réduite de contraction cardiaque suivant les signaux lumineux a entraîné un ralentissement du rythme cardiaque qui imite les larves et les nymphes. Une série de trois trains d’impulsions lumineuses à différentes fréquences de stimulation a été appliquée sur les larves et les cœurs de pupes ont clairement montré une augmentation de la fréquence cardiaque après les impulsions lumineuses.La sélection de la préparation de la descendance correcte, le montage de l’échantillon et la procédure d’imagerie sont essentiels. Nous espérons transférer la technologie de stimulation optogénétique à des modèles animaux plus grands, étudier les maladies cardiaques des mammifères et explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’arythmie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

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Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

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Création de modèles cardiaques en silicone spécifiques au patient avec des applications dans les plans pré-chirurgicaux et la formation pratique

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...