Name: developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00
Duration: 8 min 43 s
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लेखक डेटा विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए एंड्री कोमारोव, युक्सुआन वांग और जियानताओ झू को धन्यवाद देते हैं और झोउ प्रयोगशाला के सदस्यों को उनकी मूल्यवान चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। झोउ की प्रयोगशाला में काम सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय से एक स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित था, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) अनुदान आर 01-ईबी 025209 और आर 01-एचएल 156265, और क्लेको फाउंडेशन इनोवेटिव रिसर्च अवार्ड।

वर्तमान अध्ययन के लिए, ईएनपीएचआर 2.0 ट्रांसजेनिक लाइन डब्ल्यू [*]; पी {वाई [+टी 7.7] डब्ल्यू [+ एमसी] = यूएएस-ईएनपीएचआर-वाईएफपी} एटीटीपी 2, रीएचआर ट्रांसजेनिक लाइन डब्ल्यू [*]; पी {वाई [+टी 7.7] डब्ल्यू [+ एमसी] = यूएएस-रीचआर} सु (एचडब्ल्यू) एटीटीपी 5 / साइओ, और हृदय-विशिष्ट जीएएल 4 ड्राइवर जिसमें हैंड जीन नियामक टुकड़ा डब्ल्यू [1118]; पी {वाई [+टी 7.7] डब्ल्यू [+ एमसी] = जीएमआर 88 डी 05-जीएएल 4} एटीटीपी 2 / टीएम 3 एसबी [1] (इस ड्राइवर स्टॉक को हैंड-जीएएल 4 के रूप में इंगित किया जाएगा) का उपयोग किया गया था। वाई [*] डब्ल्यू [*]; पी {डब्ल्यू [+एमसी]= यूएएस -2 एक्सईजीएफपी} एएच 3 का उपयोग जीएफपी रिपोर्टर लाइन के रूप में किया गया था। उल्लिखित ड्रोसोफिला स्टॉक ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (बीडीएससी, सामग्री की तालिका देखें) से प्राप्त किए गए थे और कमरे के तापमान पर या मानक कॉर्नमील मीडिया पर 18 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। इस अध्ययन में विकसित ड्रोसोफिला मॉडल सहयोगी कार्य के अनुरोध पर उपलब्ध हैं।
1. ड्रोसोफिला आनुवंशिक क्रॉस और मीडिया तैयारी
<ol><li>तीसरा गुणसूत्र बैलेंसर बदलें टीएम 3 एसबी[1] टीएम 6 एसबी टीबी में, डब्ल्यू बनाना[1118]; पी {वाई [+टी 7.7] डब्ल्यू [+ एमसी] = जीएमआर 88 डी 05-जीएएल 4} एटीटीपी 2 / टीएम 6 एसबी टीबी (हैंड-जीएएल 4 / टीएम 6 एसबी टीबी)। क्रॉसिंग योजना के लिए पूरक चित्रा 1 देखें। नियमित कॉर्नमील मीडिया के साथ शीशियों में क्रॉस सेट करें। नोट: टीबी मार्कर की उपस्थिति उपयोगकर्ताओं को ऑप्सिन ट्रांसजीन युक्त लार्वा और प्यूपा और जीएएल 4 ड्राइवर को ऑप्सिन युक्त जानवरों से अलग करने की अनुमति देती है लेकिन कोई ड्राइवर25 नहीं है।</li>
	<li>लार्वा संग्रह के लिए 5 दिनों और प्यूपा संग्रह के लिए 6 दिनों के लिए अंधेरे में विशेष रूप से तैयार ऑल-ट्रांस रेटिना (एटीआर) युक्त मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) पर 25 डिग्री सेल्सियस, 70% आर्द्रता इनक्यूबेटर में आनुवंशिक क्रॉस रखें।</li>
	<li> टीएम 6 एसबी टीबी कुंवारी महिलाओं और यूएएस-ऑप्सिन स्टॉक (ईएनपीएचआर 2.0, या रीचआर) प्रति शीशी से दो से तीन पुरुषों को मिलाएं। क्रमशः चित्रा 2 ए और चित्रा 2 बी में ईएनपीएचआर 2.0 और रीचआर ऑप्सिन के लिए क्रॉस आरेख देखें।</li>
	<li>अगले दिन, एटीआर युक्त मीडिया शीशियां तैयार करें।<ol><li>बीडीएससी26 के निर्देशों के अनुसार अर्ध-परिभाषित भोजन तैयार करें। सुक्रोज और ग्लूकोज के बजाय, केवल सुक्रोज (5.14 ग्राम / लगातार सरगर्मी के साथ ~ 60 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत।</li>
		<li>संकीर्ण मक्खी शीशियों तैयार करें, और प्रत्येक शीशी में 100 एमएम एटीआर-इथेनॉल समाधान के 50 μL जोड़ें।</li>
		<li>एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, फ्लाई शीशियों को संकीर्ण करने के लिए फ्लाई फूड का निपटान करें, 5 एमएल प्रति शीशी। 10 एस के लिए अधिकतम गति पर भंवर।</li>
		<li>शीशियों को प्लग करें, और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए उन्हें अंधेरे कपड़े में लपेटें। शीशियों को कम से कम 12 घंटे (रात भर) के लिए सूखने दें।</li>
	</ol></li>
	<li>अगले दिन, चरण 1.3 से लगातार अंडे देने वाली मक्खियों को स्थानांतरित करें। एटीआर युक्त भोजन के साथ शीशियों के लिए (चरण 1.4.4।)। प्रकाश से शीशियों के साथ रैक की रक्षा करें।</li>
	<li>24-48 घंटे के बाद (रखे गए अंडे की संख्या के आधार पर), शीशी की अधिक आबादी को रोकने के लिए माता-पिता को त्याग दें।</li>
	<li>गैर-टीबी संतानों को इकट्ठा करें और हृदय इमेजिंग के लिए उनका उपयोग करें। नोट: लार्वा और प्यूपल चरणों में फेनोटाइपिक मतभेद चित्रा 2 सी में प्रदर्शित किए जाते हैं। सारांश और नमूना तैयारी चरणों की अनुमानित समयरेखा चित्रा 3 में दिखाया गया है।</li>
</ol>2. ड्रोसोफिला दिल का ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण 
<ol><li>यूएएस-ऑप्सिन / हाथ-जीएएल 4 लार्वा / प्यूपा को शीशी से चुनें (चरण 1.7.), ऊतक पर रखें, और धीरे-धीरे पेंटिंग ब्रश का उपयोग करके शरीर की सतह से मीडिया को मिटा दें।</li>
	<li>माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें और बीच में डबल-पक्षीय टेप का एक छोटा टुकड़ा रखें।</li>
	<li>ब्रश या ठीक चिमटी का उपयोग करके, धीरे-धीरे लार्वा / प्यूपा को टेप सतह पर पृष्ठीय पक्ष के साथ रखें और स्लाइड के लंबे पक्ष के लंबवत रखें। टेप सतह पर लार्वा/प्यूपा संलग्न करने के लिए कोमल दबाव लागू करें।</li>
	<li>इमेजिंग चरण पर स्लाइड सेट करें, लार्वा /</li>
	<li>लेजर नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा ओसीटी प्रकाश स्रोत चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कस्टम-लिखित एसडी-ओसीटी नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें, फिर पूर्वावलोकन विंडो पर क्लिक करें।</li>
	<li>एसडी-ओसीटी सॉफ़्टवेयर में स्कैन पैरामीटर सेट करें। नोट: लक्ष्य धड़कते दिल की इष्टतम इमेजिंग के लिए नमूना संरेखित करना है, इसलिए एक्स रेंज और वाई रेंज का चयन दिल के क्षेत्र को कवर करता है। इस चरण में, ए-स्कैन और बी-स्कैन दोनों की संख्या 400 है। एक्स और वाई दिशाओं में सीमा ~ 490 μm और ~ 537 μm है, जो क्रमशः दिल के दो ऑर्थोगोनल क्रॉस-सेक्शन (एक्सजेड और वाईजेड) को दर्शाती है।</li>
	<li>मक्खी दिल को फोकस में लाने के लिए नमूना चरण को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। मक्खी छल्ली सतह से प्रकाश प्रतिबिंब को कम करने के लिए फोकल स्थिति को समायोजित करें। प्रतिबिंब को कम करने के लिए लार्वा /प्यूपा सतह पर खनिज तेल लगाने पर विचार करें। नोट: तेल टेप चिपकने वाला गुणों से समझौता करके पशु आंदोलन के जोखिम को बढ़ा सकता है।</li>
	<li>सुनिश्चित करें कि फ्लाई हार्ट को पूरी तरह से छवि खिड़की में बिना किसी विकृति के देखा जा सकता है, ऊतक द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, और गैर-नगण्य छाया और प्रतिबिंब; अन्यथा, चरण 2.7 पर वापस जाएँ।</li>
	<li>एम-मोड ओसीटी छवि अधिग्रहण के लिए स्कैन पैरामीटर सेट करें। नोट: चरण 2.7 की तुलना में ए-स्कैन की संख्या कम हो गई है। फ्लाई हार्ट (कई हर्ट्ज) की धड़कन गतिशीलता को पकड़ने के लिए तेजी से फ्रेम दर के लिए। बी-स्कैन की संख्या एम-मोड इमेजिंग के लिए दोहराए गए फ्रेम की संख्या को दर्शाती है, जिसे रिकॉर्डिंग समय और उपलब्ध सिस्टम मेमोरी के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। इस प्रयोग में, 128 ए-स्कैन ~ 125 फ्रेम / एस की गति की अनुमति दे सकते हैं, और 4,000 दोहराए गए बी-स्कैन दर्ज किए जाते हैं, जो ~ 32 एस की निरंतर रिकॉर्डिंग प्रदान करते हैं।</li>
	<li>आराम करने वाली हृदय गति (आरएचआर) की गणना करने के लिए लाल बत्ती उत्तेजना दालों के बिना नियंत्रण डेटा के पांच सेट प्राप्त करें।</li>
	<li>कस्टम ओसीटी नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पेसिंग उत्तेजना के लिए प्रकाश नाड़ी डिजाइन करें। "सेटिंग्स" में, विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल के अनुसार पल्स आवृत्ति, पल्स चौड़ाई, उत्तेजना अवधि और प्रतीक्षा समय को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रकाश पल्स अनुक्रम जोड़ें। नोट: आरएचआर प्रकाश रोशनी के बिना नियंत्रण प्रयोग से मापा जाता है और आवृत्ति जिस पर प्रकाश टैचीपेसिंग और ब्रैडीपेसिंगप्रयोगों 22 के लिए स्पंदित किया जाना चाहिए की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।</li>
	<li>लाल बत्ती दालों को उत्पन्न करने के लिए प्रकाश नियंत्रक सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। " मोड चयन " में पल्स मोड चुनें। "पल्स प्रोफ़ाइल" सेटिंग्स के लिए आकृति पर डबल-क्लिक करें और अनुयायी मोड चुनें। बंद तीव्रता को 0 के रूप में रखें, और वास्तविक शक्ति घनत्व की गणना करने पर चालू तीव्रता प्रतिशत सेट करें। नोट: उत्तेजना प्रकाश दालों चरण 2.12 में सेटिंग्स के अनुसार ओसीटी नियंत्रण सॉफ्टवेयर से एक संकेत द्वारा ट्रिगर कर रहे हैं।</li>
	<li>ओसीटी नियंत्रण सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण पर क्लिक करके प्रकाश उत्तेजना के साथ धड़कते ड्रोसोफिला दिल के एम-मोड वीडियो प्राप्त करें । माप 5x दोहराएँ।</li>
</ol>3. छवि विश्लेषण
<ol><li>कस्टम-विकसित फ्लाई हार्ट सेगमेंटेशन सॉफ़्टवेयर खोलें।</li>
	<li>फ़ाइल का चयन करें पर क्लिक करें और फिर प्रकट होने वाले जीयूआई में विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल का चयन करें।</li>
	<li>शीर्ष पाठ बक्सों में पिक्सेल में हृदय क्षेत्र की अनुलंब और क्षैतिज दोनों सीमाएँ दर्ज करें. आकार बदलें पर क्लिक करें। तल पर स्लाइडर का उपयोग करके, सुनिश्चित करें कि पूरा हृदय क्षेत्र दिखाई दे रहा है और यह पूरे संग्रह के लिए पूरे बॉक्स को भरता है। यदि ऐसा नहीं है, तो इस प्रक्रिया को दोहराएं और सीमाओं को समायोजित करें।</li>
	<li>हृदय क्षेत्र की भविष्यवाणी करने के लिए भविष्यवाणी पर क्लिक करें। कार्यक्रम अब संग्रह में हर टुकड़े के माध्यम से जाना होगा और हृदय क्षेत्र का चयन करेगा, जिसमें लगभग 3 मिनट लगेंगे।</li>
	<li>भविष्यवाणी पूरी होने के बाद एचआर प्लॉट पर क्लिक करें। यह समय के साथ हृदय क्षेत्र के एक भूखंड को प्रदर्शित करने वाली एक नई विंडो खोलेगा। सुनिश्चित करें कि सही चोटी या घाटी क्षेत्रों का चयन किया गया है। अंतिम आंकड़ा उत्पन्न करने के लिए पल्स और फिर एचआर चुनें, और कार्यात्मक पैरामीटर एक साथ .csv फ़ाइलों में सहेजे जाएंगे।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2010.">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1 (2011).</li><li>Boyden, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart.">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

हमारी पिछली रिपोर्टों की तुलना में जहां ऑप्सिन की अभिव्यक्ति न केवल हृदय में बल्कि आसपास की मांसपेशियों के ऊतकों में भी संचालित की गई थी, वर्तमान कार्य रिपोर्ट हृदय-विशिष्ट चालक, हैंड-जीएएल 4 का उपयोग करके करती है। ऑप्टोजेनेटिक हृदय विनियमन के लिए उपयोग किया जाने वाला यह नया हैंड> ऑप्सिन आनुवंशिक कॉन्फ़िगरेशन पहले से रिपोर्ट किए गए परिणामों की पुष्टि करता है और एक बेहतर ड्रोसोफिला कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च मॉडल स्थापित करता है।
प्रयोगों की सफलता के लिए मीडिया की तैयारी आवश्यक है। ऑप्सिन प्रोटीन को कार्य करने के लिए लिगैंड, ऑल-ट्रांस रेटिना (एटीआर) की आवश्यकता होतीहै 28. मक्खियां पर्याप्त एटीआर का उत्पादन नहीं करती हैं, इसलिए एटीआर को फ्लाई मीडिया के लिए पूरक किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, पहले रिपोर्ट किए गए तत्काल भोजन को अर्ध-परिभाषित मीडिया29 के साथ बदल दिया गया था। एटीआर युक्त मीडिया का नया नुस्खा एटीआर के एक समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए पेश किया गया था। एटीआर पानी में घुलनशील नहीं है; जब इथेनॉल-आधारित 100 एमएम एटीआर स्टॉक को पानी आधारित मीडिया में जोड़ा जाता है, तो इसे गर्म अर्ध-परिभाषित मीडिया वाली शीशियों को भंवर करके फैलाया जाता है। इसके अलावा, पहले रिपोर्ट की गई एटीआर एकाग्रता ईएनपीएचआर 2.0 के लिए 10 एमएम और रीचआर22 के लिए 3 एमएम से दोनों के लिए 1 एमएम अंतिम एकाग्रता तक कम हो गई थी। यह एकाग्रता उचित ईएनपीएचआर 2.0 और रीचआर फ़ंक्शन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है।
प्रयोगात्मक सफलता का एक महत्वपूर्ण घटक फ्लाईनेट 2.027 के साथ बेहतर डेटा प्रोसेसिंग है। प्रयोगशाला ने स्वचालित फ्लाई हार्ट विभाजन एल्गोरिथ्म की कम्प्यूटेशनल दक्षता और सटीकता दोनों में सुधार करने के लिए इस सॉफ्टवेयर को विकसित करना जारी रखा है। इस सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पादित क्रॉस-सेक्शनल मास्क का उपयोग ड्रोसोफिला शारीरिक डेटा जैसे आंशिक शॉर्टनिंग और हृदय की दीवार वेग प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इस दृष्टिकोण ने न्यूनतम मानव पर्यवेक्षण के साथ कुशल डेटा विश्लेषण को सक्षम किया है, जिससे बड़े फ्लाई हार्ट इमेजिंग डेटासेट के लिए हृदय समारोह को चिह्नित करने के लिए यह तेज और अधिक विश्वसनीय हो गया है।
मायोकार्डियल रोधगलन मृत्यु का प्रमुख कारण बना हुआ है, और मायोकार्डियल इस्किमिया दिल की विफलता के सभी मामलों में से दो-तिहाई में योगदान देता है, जो संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु दर और रुग्णता के प्रमुख कारणों में तेजी से उभर रहा है। नए चिकित्सीय और चिकित्सा उपकरणों के विकास के लिए शारीरिक और जैव रासायनिक स्तरों पर हृदय विकारों के तंत्र के गहरे ज्ञान की आवश्यकता होती है। इन लक्ष्यों को मॉडल जीवों की मदद से पूरा किया जा सकता है। मेलानोगास्टर ने खुद को सबसे विश्वसनीय और कुशल मॉडल 31,32,33,34,35 में से एक के रूप में स्थापित किया है। इस काम ने एक गैर-इनवेसिव ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण से प्रेरित नकली ड्रोसोफिला हृदय विकार मॉडल उत्पन्न किए हैं। गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल हार्ट पेसिंग प्रौद्योगिकियों का विकास पारंपरिक इलेक्ट्रिक हार्ट पेसिंग उपकरणों के विकल्प को विकसित करने के लिए एक आधार प्रदान करता है। वास्तविक समय में हृदय समारोह का निरीक्षण करने के लिए ओसीटी का उपयोग करने से अध्ययन को दवा उम्मीदवार स्क्रीनिंग सहित उन्नत जांच के लिए ड्रोसोफिला मॉडल में प्रासंगिक हृदय शरीर विज्ञान को सटीक रूप से चिह्नित करने की अनुमति मिलती है। ओसीटी इमेजिंग में ~ 1 मिमी की प्रवेश गहराई है, जो ड्रोसोफिला हृदय अध्ययन के लिए अच्छी तरह से काम करती है लेकिन बड़े पशु मॉडल में हृदय समारोह को चिह्नित करने के लिए इसके उपयोग को सीमित करती है। इसके अलावा, स्तनधारी मॉडल में ड्रोसोफिला अनुसंधान का सीधे अनुवाद करना एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। ऑप्सिन की संवेदनशीलता में सुधार करने और कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के लिए जेब्राफिश, चूहों, चूहों और मानव हृदय ऑर्गेनोइड सहित विभिन्न मॉडल प्रणालियों में अनुवाद करने के लिए नए ऑप्टोजेनेटिक टूल विकसित करने की आवश्यकता है।

2010 के अंत में, नेचर मेथड्स जर्नल ने ऑप्टोजेनेटिक्स को वर्ष1 की विधि के रूप में चुना। अभूतपूर्व परिशुद्धता और गति के साथ ब्याज के जैविक ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश द्वारा विनियमित आनुवंशिक उपकरण (ट्रांसजेनिक ऑप्सिन) का उपयोग करके नए अनुप्रयोगों के लिए एक बाढ़ गेट खोला गया। आज तक, अधिकांश उपलब्धियां तंत्रिका विज्ञान से संबंधित हैं। प्रौद्योगिकी को एकल न्यूरॉन्स2 के सटीक नियंत्रण की एक नई विधि के रूप में पेश किया गया था और जीवित जीव संज्ञानात्मक कार्यों के क्षेत्र में खोजों के लिए उन्नत है3. शुरुआत से, तंत्रिका विज्ञानियों ने पूरे जीव के व्यवहार को संशोधित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। चूहों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में सीएचआर 2 ऑप्सिन की अभिव्यक्ति और प्रकाश सक्रियण ने उनकी सक्रियता का कारण बना और व्यवहार कंडीशनिंग4 को चलाने के लिए पर्याप्त थे। कृंतक मस्तिष्क के मिर्गी फोकस को दिए गए हेलोरोडोप्सिन एनपीएचआर 2.0 युक्त न्यूरॉन्स के सबसेट के ऑप्टोजेनेटिक निषेध के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक दौरे का क्षीणन हुआ5.
कार्डियोलॉजी में ऑप्टोजेनेटिक अनुप्रयोग एक स्थिर गति से विकसित हो रहे हैं6. सीएचआर 2 कार्डियोमायोसाइट्स सेल संस्कृति और चूहों में सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था; दिल पेसिंग नीली रोशनी की चमक द्वारा आयोजित किया गया था (जीवित जानवरों में प्रत्यारोपित फाइबर का उपयोग करके किया गया था)7. ज़ेब्राफिश में, सीएचआर 2 को व्यक्त किया गया था और गति बनाने वाले हृदय क्षेत्र की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता था; एनपीएचआर सक्रियण प्रेरित दिल की गिरफ्तारी8. ऑप्टोजेनेटिक कार्डियक पेसिंग में नए पेसिंग और रीसिंक्रोनाइजेशन थेरेपी विकसित करने की अनूठी क्षमता है9. एक ऑटोजेनस अतालता समाप्ति प्रणाली स्थापित करने के प्रयासों को हाल ही मेंभी 10 की सूचना दी गई है।
व्यापक अनुसंधान और नए चिकित्सीय उपचार के विकास के लिए सेल संस्कृति से स्तनधारियों तक विभिन्न मॉडल प्रणालियों के अनुप्रयोग की आवश्यकता होती है। कशेरुक का हृदय एक बहुत ही जटिल अंग है। कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) में सभी हृदय कोशिकाओं का एक तिहाई हिस्सा होता है; अन्य कोशिकाओं में न्यूरॉन्स, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं और गैर-उत्तेजनीय कोशिकाएं (यानी, एंडोथेलियल कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं) शामिल हैं। सीएम सेल संस्कृति पर शोध मानव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए प्राप्त परिणामों के अनुवाद को सीमित करता है। स्तनधारी मॉडल जीवों के आनुवंशिक जोड़तोड़ सीमित और समय लेने वाले हैं। छोटे अकशेरुकी मॉडल के कई फायदे हैं; उनकी कार्डियोवैस्कुलर प्रणाली सभी आवश्यक हिस्टोलॉजिकल तत्वों को वहन करती है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फल मक्खी) हृदयरोगों 11,12,13 सहित मानव रोगों से जुड़े जीन की भूमिका की जांच करने के लिए एक सरल और शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल प्रणाली है। अल्पकालिक जानवरों के रूप में, फल मक्खियां उम्र- या रोग-निर्भर हृदय समारोह परिवर्तनों को मॉडल करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर का प्रतिनिधित्व करती हैं जो पूरे जीवन 14,15,16,17 में पता लगाया जा सकता है। फल मक्खी की हृदय ट्यूब छल्ली की सतह के 200 μm के भीतर अपने शरीर के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है, जिससे निकट-अवरक्त प्रकाश को हृदय ट्यूब तक पहुंचने की अनुमति मिलती है। यह शारीरिक विशेषता मौजूदा ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करके ड्रोसोफिला दिल के गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल पेसिंग को सक्षम बनाती है।
ड्रोसोफिला दिल की निगरानी के लिए, एक एकीकृत लाल बत्ती एलईडी उत्तेजना मॉड्यूल के साथ एक कस्टम वर्णक्रमीय-डोमेन ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी (एसडी-ओसीटी) इमेजिंग सिस्टम विकसितकिया गया था। अपेक्षाकृत सरल फल मक्खी दिल में रूपात्मक और लयबद्ध परिवर्तनों का इस गैर-इनवेसिव बायोमेडिकल इमेजिंग तकनीक12,19,20,21 के साथ आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है। उन्नत ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदर्शन और माइक्रोन-स्केल स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ, ओसीटी का उपयोग संरचना की जांच करने और विभिन्न विकास चरणों में ड्रोसोफिला दिल के कार्य की निगरानी करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जिसमें तीसरा इंस्टार लार्वा और प्रारंभिक प्यूपा18 शामिल हैं। यह प्रणाली बरकरार जानवर में ड्रोसोफिला की हृदय की स्थिति की एक साथ निगरानी और उत्तेजना को भी सक्षम बनाती है। ओसीटी प्रणाली का एक योजनाबद्ध दृश्य चित्र 1 में दिखाया गया है। एसडी-ओसीटी प्रणाली प्रकाश स्रोत के रूप में एक सुपरल्यूमिनेसेंट डायोड (एसएलडी) का उपयोग करती है (केंद्र तरंग दैर्ध्य: 850 एनएम ± 10 एनएम, एफडब्ल्यूएचएम: 165 एनएम, सामग्री की तालिका देखें)। एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हुए, OCT इमेजिंग प्रणाली हवा में ~ 4.4 μm और ऊतक में ~ 3.3 μm का एक अक्षीय संकल्प और ~ 2.8 μm का एक पार्श्व संकल्प, मक्खी हृदय संरचनाओं18,22 के ठीक विवरण को हल करने के लिए पर्याप्त प्राप्त कर सकते हैं। संदर्भ हाथ और नमूना हाथ से परावर्तित प्रकाश के हस्तक्षेप संकेतों को 2048-पिक्सेल लाइन स्कैन कैमरा (अधिकतम लाइन दर: 80 किलोहर्ट्ज, सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके पता लगाया जाता है। मापा प्रणाली संवेदनशीलता ~ 95.1 डीबी है। प्रत्येक बी-मोड ओसीटी स्कैन एक्सजेड छवि विमान में एक क्रॉस-अनुभागीय छवि उत्पन्न करता है। बार-बार बी-मोड छवियों को ~ 30 एस 18,22,23 से अधिक के लिए धड़कते हुए दिल को कैप्चर करने वाली एम-मोड छवियों को बनाने के लिए एक ही स्थान पर अधिग्रहित किया जाता है। एम-मोड इमेजिंग के लिए फ्रेम दर ~ 125 फ्रेम / एस है, जो फल मक्खी दिल की धड़कन गतिशीलता को पकड़ने के लिए पर्याप्त है।
ड्रोसोफिला हृदय समारोह के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन के लिए, 617 एनएम एलईडी प्रकाश स्रोत के साथ एक रोशनी मॉड्यूल एसडी-ओसीटी प्रणाली के नमूना हाथ के साथ एकीकृत है। उत्तेजना प्रकाश नमूना सतह पर ~ 2.2 मिमी व्यास स्थान पर केंद्रित है, इमेजिंग फोकस स्पॉट के समान स्थिति में। एक कस्टम-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग रोशनी मोड (प्रकाश तीव्रता, नाड़ी चौड़ाई और कर्तव्य चक्र) को नियंत्रित करने, प्रकाश पल्स उत्तेजना आवृत्ति को समायोजित करने और एलईडी मॉड्यूल रोशनी और एम-मोड ओसीटी इमेजिंग अधिग्रहण22 को सिंक्रनाइज़ करने के लिए किया जाता है।
हाल के प्रकाशनों ने ड्रोसोफिला ट्रांसजेनिक प्रणाली का वर्णन किया है जिसमें यूएएस / जीएएल 4 आनुवंशिक प्रणाली का उपयोग करके स्थानिक रूप से विनियमित सीएचआर 2, रीचआर और ईएनपीएचआर 2.0 ऑप्सिन शामिल हैं। प्राप्त परिणामों ने ईएनपीएचआर 2.0 के लाल बत्ती सक्रियण और सीएचआर 2 के नीले प्रकाश सक्रियण के कारण उच्च आवृत्ति हृदय पेसिंग के कारण दिल की गिरफ्तारी और ब्रैडीकार्डिया शुरू करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। इसी तरह के पेसिंग प्रयोगों को एक अन्य चैनलरोडोप्सिन, रीचआर के साथ किया गया था, जो लाल-प्रकाश रोशनी 22,23,24 द्वारा प्रेरित था। सभी वर्णित प्रयोगों में ऑप्सिन अभिव्यक्ति 24 बी-जीएएल 4 द्वारा संचालित थी, जहां कार्डियोमायोसाइट्स और आसपास की मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में ऑप्सिन अभिव्यक्ति देखी गई थी। वर्तमान अध्ययन में, हृदय-विशिष्ट ईएनपीएचआर 2.0 और रीचआर ऑप्सिन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए 24 बी-जीएएल 4 को हैंड-जीएएल 4 ड्राइवर द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।
कुल मिलाकर, प्रस्तुत प्रयोगात्मक परिणाम पुनर्स्थापनीय दिल की गिरफ्तारी और इंड्यूसिबल ब्रैडीकार्डिया और टैचीकार्डिया हृदय की स्थिति प्रदर्शित करते हैं। ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला मॉडल बनाने और जीवित जानवरों में एक साथ ओसीटी इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग प्रयोगों का संचालन करने पर चरण-दर-चरण निर्देशों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>18449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>02-10-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLED Light Source Control Module, 4-channel</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-SA04-US</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband Light Source Module</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>cBLMD-T-850-HP</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra-S 800 OCT Spectrometers</td>
			<td>&#160;Wasatch Photonics</td>
			<td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professtional</td>
			<td>34155</td>
			<td>tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila culture bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyNet 2.0 Software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Collimator Sources</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-LCS-0617-03-22</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-72P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow plugs for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow vials for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugs for Drosophila bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1386-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT control software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT imaging and optogenetic pacing system</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>89-2871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 41752</td>
			<td>eNpHR2.0 transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 53748</td>
			<td>ReaChR transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 48396</td>
			<td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock #6658</td>
			<td>GFP reporter line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Lab Scientific bioKEMIX</td>
			<td>978-907-4243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function

एक मॉडल जीव के रूप में ड्रोसोफिला मेलानोगास्टेआर (फल मक्खी) का उपयोग करने से जैविक विज्ञान के कई क्षेत्रों में सेलुलर संगठन और जीनोमिक जांच से व्यवहार अध्ययन तक महत्वपूर्ण प्रगति सुनिश्चित हुई है। संचित वैज्ञानिक ज्ञान के कारण, हाल के वर्षों में, ड्रोसोफिला को हृदय विकारों सहित मानव रोगों के मॉडलिंग के क्षेत्र में लाया गया था। प्रस्तुत कार्य लाल बत्ती (617 एनएम) का उपयोग करके और आक्रामक प्रक्रियाओं के बिना पूरे जीवित जीव के संदर्भ में हृदय समारोह की निगरानी और हेरफेर करने के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली का वर्णन करता है। ऑप्टोजेनेटिक टूल का उपयोग करके दिल पर नियंत्रण हासिल किया गया था। ऑप्टोजेनेटिक्स ब्याज के जैविक ऊतक को विनियमित करने के लिए प्रकाश-संवेदनशील ट्रांसजेनिक ऑप्सिन और उनके ऑप्टिकल सक्रियण की अभिव्यक्ति को जोड़ती है। इस काम में, एक कस्टम एकीकृत ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना प्रणाली का उपयोग तीसरे इंस्टार लार्वा और प्रारंभिक प्यूपल विकास चरणों में कामकाज डी मेलानोगास्टर दिल की कल्पना और संशोधित करने के लिए किया गया था। जीएएल 4 दोहरी आनुवंशिक प्रणाली को हेलोरोडोप्सिन (ईएनपीएचआर 2.0) और लाल-स्थानांतरित चैनलरोडोप्सिन (रीचआर) को व्यक्त करने के लिए नियोजित किया गया था, विशेष रूप से फ्लाई हार्ट में। लाइव ओसीटी इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग के लिए डी मेलानोगास्टर तैयार करने पर विवरण प्रदान किए गए हैं। एक प्रयोगशाला द्वारा विकसित एकीकरण सॉफ्टवेयर ने दृश्य प्रस्तुतियों और ड्रोसोफिला हृदय समारोह की मात्रात्मक विशेषताओं को बनाने के लिए इमेजिंग डेटा को संसाधित किया। परिणाम ईएनपीएचआर 2.0 सक्रियण के कारण कार्डियक गिरफ्तारी और ब्रैडीकार्डिया शुरू करने और रीएचआर सक्रियण पर दिल पेसिंग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करते हैं।

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Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

वर्तमान प्रोटोकॉल ओसीटी इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक हार्ट पेसिंग के लिए दिल में ईएनपीएचआर 2.0 या रीचआर ऑप्सिन व्यक्त करने वाले ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की पीढ़ी का वर्णन करता है। ड्रोसोफिला ओसीटी इमेजिंग और दिल की धड़कन मॉडुलन के लिए विस्तृत निर्देश, जिसमें विभिन्न विकास चरणों में जीवित जानवरों में पुनर्स्थापन योग्य दिल की गिरफ्तारी, ब्रैडीकार्डिया और टैचीकार्डिया का अनुकरण शामिल है, की सूचना दी गई है।

कार्डियक फंक्शन के इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मॉडल विकसित करना

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मॉडल प्रस्तुत करता है जहां हृदय समारोह को प्रकाश का उपयोग करके विशेषता और नियंत्रित किया जा सकता है। यह शोधकर्ताओं को बरकरार जानवरों का उपयोग करके ड्रोसोफिला में मानव हृदय रोगों का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। यह विधि मज़बूती से गैर-इनवेसिव ओसीटी इमेजिंग और ड्रोसोफिला हृदय समारोह के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण को प्राप्त कर सकती है।इसमें उच्च दक्षता और गुणवत्ता है। ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग संभावित रूप से अतालता संबंधी विकारों के इलाज के लिए चिकित्सा के रूप में विद्युत पेसिंग का विकल्प हो सकता है। ओसीटी इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग को हृदय ऑर्गेनोइड, ज़ेबरा मछली और भ्रूण गले और हृदय जैसे अन्य मॉडल सिस्टम तक बढ़ाया जा सकता है।शुरू करने के लिए, टीएम 6 डबल-टब्बी कुंवारी मादा पर पांच हाथ जीएएल 4 और प्रति शीशी यूएएस ऑप्स और स्टॉक्स से दो से तीन नर मक्खियों को मिलाएं। अगले दिन, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर के निर्देशों के अनुसार एक गर्म प्लेट पर एक कंटेनर में 5.14 ग्राम प्रति 100 मिलीलीटर सुक्रोज जोड़कर अर्ध परिभाषित भोजन तैयार करें। फिर इसे लगातार हिलाते हुए 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।इसके बाद, प्रत्येक शीशी में 100 मिलीमोलर ऑल-ट्रांस रेटिना इथेनॉल समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर संकीर्ण फ्लाई शीशियां तैयार करें। संकीर्ण मक्खी नीच प्रति पांच मिलीलीटर मक्खी भोजन का निपटान करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति से भंवर करने के बाद, इन शीशियों को प्लग करें और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए अंधेरे कपड़े में लपेटें।अगले दिन, भोजन युक्त सभी ट्रांस रेटिना इथेनॉल के साथ शीशियों को लगातार अंडे देने वाली मक्खियों को स्थानांतरित करें। प्रकाश से शीशियों के साथ रैक की रक्षा करें। 24 से 48 घंटों के बाद, दिए गए अंडे की संख्या के आधार पर, शीशी की अधिकता को रोकने के लिए माता-पिता को त्याग दें।अगला, हृदय इमेजिंग के लिए गैर-टब्बी संतान इकट्ठा करें। शीशी से यूएएस विकल्प हाथ जीएएल 4 लार्वा या प्यूपा उठाओ, इसे एक ऊतक पर रखें, और पेंटिंग ब्रश का उपयोग करके शरीर की सतह से मीडिया को धीरे से मिटा दें। बीच में डबल पक्षीय टेप के एक छोटे से टुकड़े के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।अगला, धीरे-धीरे लार्वा या प्यूपा को टेप सतह पर पृष्ठीय पक्ष के साथ रखें और ब्रश या ठीक चिमटी का उपयोग करके स्लाइड के लंबे पक्ष के लंबवत रखें। टेप की सतह पर लार्वा या प्यूपा संलग्न करने के लिए कोमल दबाव लागू करें। अब, लार्वा या प्यूपा के साथ इमेजिंग चरण पर स्लाइड सेट करें और लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी या ओसीटी प्रकाश स्रोत को चालू करें।कस्टम लिखित वर्णक्रमीय डोमेन OCT नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें। फिर, पूर्वावलोकन विंडो पर क्लिक करें। उसके बाद, वर्णक्रमीय डोमेन OCT सॉफ़्टवेयर में स्कैन पैरामीटर सेट करें।मक्खी दिल को फोकस में लाने के लिए नमूना चरण को नियंत्रित करने के लिए माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करें। मक्खी छल्ली सतह से प्रकाश प्रतिबिंब को कम करने के लिए फोकल स्थिति को समायोजित करें। इसके अलावा, प्रतिबिंब को कम करने के लिए लार्वा या प्यूपा सतह पर खनिज तेल लगाने पर विचार करें।अगला, एम मोड ओसीटी छवि अधिग्रहण के लिए स्कैन पैरामीटर सेट करें और आराम दिल की दर की गणना करने के लिए लाल बत्ती उत्तेजना दालों के बिना नियंत्रण डेटा के पांच सेट प्राप्त करें। कस्टम ओसीटी नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पेसिंग उत्तेजना के लिए प्रकाश नाड़ी डिजाइन करें। इसके लिए, सेटिंग्स टैब पर क्लिक करें और विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल के अनुसार पल्स आवृत्ति, पल्स चौड़ाई, उत्तेजना अवधि और प्रतीक्षा समय को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रकाश पल्स अनुक्रम जोड़ें।फिर लाल बत्ती दालों को उत्पन्न करने के लिए प्रकाश नियंत्रक सॉफ़्टवेयर खोलें। मोड चयन में पल्स मोड चुनें। पल्स प्रोफ़ाइल सेटिंग्स के लिए आकृति डबल क्लिक करें, और अनुयायी मोड चुनें।बंद तीव्रता को शून्य पर रखें और वास्तविक शक्ति घनत्व की गणना करने पर तीव्रता प्रतिशत निर्धारित करें। ओसीटी कंट्रोल सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण पर क्लिक करके प्रकाश उत्तेजना के साथ धड़कते हुए ड्रोसोफिला दिल के एम मोड वीडियो प्राप्त करें। इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान मक्खी दिल के नीचे लाल बत्ती की चमक रिकॉर्ड करें।ध्यान दें कि लाल-स्थानांतरित चैनलरोडोप्सिन और एनपीएचआर फ्लाई मॉडल के साथ फ्लाई हार्ट फ़ंक्शन को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न पेसिंग सेटिंग्स की आवश्यकता होती है। कस्टम विकसित फ्लाई हार्ट सेगमेंटेशन सॉफ़्टवेयर खोलें और चुनिंदा फ़ाइल पर क्लिक करें। फिर ग्राफिकल यूजर इंटरफेस में विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल का चयन करें।शीर्ष पाठ बक्सों में पिक्सेल में हृदय क्षेत्र की अनुलंब और क्षैतिज दोनों सीमाएँ दर्ज करें. आकार बदलें पर क्लिक करें। तल पर स्लाइडर का उपयोग करके, सुनिश्चित करें कि पूरा हृदय क्षेत्र दिखाई दे रहा है और यह पूरे संग्रह के लिए पूरे बॉक्स को भरता है।पूर्वानुमान टैब पर क्लिक करने के बाद, कार्यक्रम संग्रह में हर टुकड़े के माध्यम से जाएगा और लगभग तीन मिनट में हृदय क्षेत्र का चयन करेगा। एक बार भविष्यवाणी पूरी हो जाने के बाद, एक नई विंडो में समय के साथ हृदय क्षेत्र के भूखंड को प्रदर्शित करने के लिए एचआर प्लॉट पर क्लिक करें। सही चोटी या घाटी क्षेत्रों का चयन करें, अंतिम आंकड़ा उत्पन्न करने के लिए पल्स और फिर एचआर टैब चुनें।कार्यात्मक पैरामीटर एक साथ सीएसवी फ़ाइलों में सहेजे जाएंगे। हाथ GAL4 चालक की ऊतक विशिष्टता इमेजिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित किया गया था। लार्वा और प्यूपल बॉडी क्रॉस सेक्शन की विशिष्ट ओसीटी छवियां यहां दिखाई गई हैं।विभिन्न हृदय स्थितियों की नकल करने के लिए, चार प्रकार की हल्की दालों को डिजाइन किया गया था। प्रतीक्षा समय के पांच सेकंड के बाद 10 सेकंड तक चलने वाली एक एकल नाड़ी, पुनर्स्थापनीय दिल की गिरफ्तारी उत्पन्न करती है। आराम करने वाली हृदय गति से कम आवृत्तियों पर हृदय पेसिंग के लिए, आराम करने वाली हृदय गति के आधे के बराबर पेसिंग आवृत्तियों के साथ दो हल्के पल्स अनुक्रम, और बीच में छह सेकंड के प्रतीक्षा समय के साथ आठ सेकंड तक चलने वाली आराम करने वाली हृदय गति का एक चौथाई उपयोग किया गया था।लाल-स्थानांतरित चैनलरोडोप्सिन सक्रियण के कारण हृदय गति को बढ़ाने के लिए उत्तेजना पैटर्न में प्रकाश दालों के तीन अनुक्रम शामिल थे। प्रकाश संकेतों के बाद कम हृदय संकुचन आवृत्ति के परिणामस्वरूप धीमी हृदय गति हुई जो लार्वा और प्यूपा में नकल करती है। विभिन्न उत्तेजना आवृत्तियों पर तीन प्रकाश पल्स ट्रेनों की एक श्रृंखला लार्वा पर लागू की गई थी और प्यूपा दिल स्पष्ट रूप से प्रकाश दालों के बाद हृदय गति में वृद्धि दिखाते हैं।सही संतान की तैयारी चयन, नमूना के बढ़ते, और इमेजिंग प्रक्रिया आवश्यक हैं। हम स्तनधारी हृदय रोगों का अध्ययन करने और अतालता के इलाज के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए बड़े पशु मॉडल में ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग तकनीक को स्थानांतरित करने की उम्मीद करते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

के लिए सरल microfluidic उपकरणों<em&gt; Vivo में</em&gt; इमेजिंग<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt;<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; और Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

3 डी सेल संस्कृति मॉडल का मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के लिए तैयारी रणनीतियाँ नमूना

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

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Myocardial संरचना, समारोह के vivo मात्रात्मक आकलन में, छिड़काव और व्यवहार्यता कार्डिएक माइक्रो-गणना टोमोग्राफी का प्रयोग

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

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ग्लास क्रिस्टल के बाद उप सतह लेजर उत्कीर्णन (SSLE) के लिए स्केल्ड बायोमेडिकल tomographic इमेजिंग डेटा का शारीरिक मॉडल निर्माण और संबद्ध लेबल

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

डीप ब्रेन उत्तेजना थेरेपी इंटरैक्टिव, रोगी विशेष मॉडल का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन फाइबर इलाकों लक्ष्यीकरण

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

विच्छेदित प्रत्यारोपण ऊतकों के प्रतिरक्षा समारोह विश्लेषण के लिए उच्च-आयामीता प्रवाह साइटोमेट्री

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए एक सरल और बहुमुखी रोशनी प्रणाली का निर्माण

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर 3डी संगठित मानव हृदय ऊतक का विकास

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

कार्डियोवस्कुलर मैग्नेटिक रेओनेंस इमेजिंग द्वारा माउस हार्ट लेफ्ट वेंट्रिकुलर फंक्शन, मायोकार्डियल स्ट्रेन और हेमोडायनामिक फोर्सेज का क्वांटिफिकेशन

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

पूर्व-सर्जिकल योजनाओं और हाथों पर प्रशिक्षण में अनुप्रयोगों के साथ रोगी-विशिष्ट सिलिकॉन कार्डियक मॉडल का निर्माण

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...