Name: developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

Авторы благодарят Андрея Комарова, Юйсюань Вана и Цзяньтао Чжу за помощь в анализе данных и благодарят членов лаборатории Чжоу за их ценные дискуссии. Работа в лаборатории доктора Чжоу поддерживалась стартовым фондом Вашингтонского университета в Сент-Луисе, грантами Национального института здравоохранения (NIH) R01-EB025209 и R01-HL156265, а также премией Clayco Foundation Innovative Research Award.

Для настоящего исследования трансгенная линия eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, трансгенная линия ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, а также специфический для сердца драйвер GAL4, содержащий регуляторный фрагмент гена Hand w[1118]; Использовались P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (этот запас драйверов будет указан как Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 использовался в качестве репортерной линии GFP. Упомянутые запасы дрозофилы были получены из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, см. Таблицу материалов) и поддерживались при комнатной температуре или при 18 °C на стандартных средах кукурузной муки. Модели дрозофилы, разработанные в этом исследовании, доступны по запросу для совместной работы.
1. Генетические скрещивания дрозофилы и подготовка сред
<ol><li>Изменить балансировщик 3-й хромосомы TM3 Sb[1] на TM6 Sb Tb, создав w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Схему пересечения см. на дополнительном рисунке 1 . Устанавливают крестики во флаконы с обычной средой из кукурузной муки. ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие маркера Tb позволяет пользователям отличать личинок и куколок, содержащих трансген опсина, и драйвер GAL4 от животных, содержащих опсин, но без водителя25.</li>
	<li>Храните генетические кресты в инкубаторе влажности 25 °C, 70% на специально разработанных полностью транс-сетчатках (ATR)-содержащих средах (см. Таблицу материалов) в темноте в течение 5 дней для сбора личинок и 6 дней для сбора куколок.</li>
	<li>Объедините пять первичных самок Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb и двух-трех самцов из запасов UAS-опсина (eNpHR2.0 или ReaChR) на флакон. Смотрите перекрестную диаграмму для eNpHR2.0 и ReaChR opsin на рисунке 2A и рисунке 2B соответственно.</li>
	<li>На следующий день приготовьте АТР-содержащие медиа-флаконы.<ol><li>Готовьте полуопределенную пищу в соответствии с инструкциями BDSC26. Вместо сахарозы и глюкозы добавляйте только сахарозу (5,14 г/100 мл). Остудить до ~60 °C при постоянном перемешивании.</li>
		<li>Приготовьте узкие флаконы и добавьте 50 мкл 100 мМ раствора ATR-этанола в каждый флакон.</li>
		<li>Используя серологическую пипетку, утилизируйте корм для мух в узкие флаконы, 5 мл на флакон. Вихрь на максимальной скорости в течение 10 с.</li>
		<li>Заткните флаконы и заверните их в темную ткань, чтобы защитить их от света. Дайте флаконам высохнуть не менее 12 ч (на ночь).</li>
	</ol></li>
	<li>На следующий день переведите мух, неуклонно откладывающих яйца с Шага 1.3. во флаконы с АТР-содержащим пищевым продуктом (Этап 1.4.4.). Защитите стеллажи флаконами от света.</li>
	<li>Через 24-48 ч (в зависимости от количества отложенных яиц) выбросьте родителей, чтобы предотвратить перенаселение флаконов.</li>
	<li>Соберите потомство, не относящееся к туберкулезу , и используйте его для визуализации сердца. ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипические различия на личиночной и куколочной стадиях показаны на рисунке 2C. Сводка и приблизительная временная шкала этапов подготовки образца показаны на рисунке 3.</li>
</ol>2. Оптогенетический контроль сердца дрозофилы
<ol><li>Выделите из флакона ЛИЧИНКУ UAS-opsin/Hand-GAL4 (Шаг 1.7.), нанесите на ткань и аккуратно вытрите носитель с поверхности тела с помощью малярной кисти.</li>
	<li>Подготовьте слайд микроскопа и поместите небольшой кусочек двусторонней ленты посередине.</li>
	<li>С помощью щетки или тонкого пинцета аккуратно поместите личинку/куколку на поверхность ленты спинной стороной вверх и перпендикулярно длинной стороне слайда. Приложите мягкое давление, чтобы прикрепить личинку/куколку к поверхности ленты.</li>
	<li>Установите слайд на стадии визуализации, личинка/куколка обращена вниз.</li>
	<li>Включите источник света OCT с помощью программного обеспечения для управления лазером (см. Таблицу материалов). Откройте специально написанное программное обеспечение управления SD-OCT и нажмите на окно предварительного просмотра .</li>
	<li>Задайте параметры сканирования в программном обеспечении SD-OCT. ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы выровнять образец для оптимальной визуализации бьющегося сердца, поэтому выбор диапазона X и диапазона Y охватывает область сердца. На этом этапе количество как A-сканов, так и B-сканов составляет 400. Диапазон в направлениях x и y составляет ~490 мкм и ~537 мкм, показывая два ортогональных поперечных сечения сердца (xz и yz) соответственно.</li>
	<li>Используйте микроманипуляторы для управления стадией образца, чтобы сфокусировать сердце мухи. Отрегулируйте фокусное положение, чтобы свести к минимуму отражение света от поверхности мушки. Рассмотрите возможность нанесения минерального масла на поверхность личинок / куколок, чтобы свести к минимуму отражение. ПРИМЕЧАНИЕ: Масло может увеличить риск передвижения животных, ставя под угрозу адгезионные свойства ленты.</li>
	<li>Убедитесь, что сердце мухи может быть полностью просмотрено в окне изображения без каких-либо искажений, заблокированных тканью и немалыми тенями и отражениями; в противном случае вернитесь к шагу 2.7.</li>
	<li>Задайте параметры сканирования для получения изображений центра развертывания Office в режиме M. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество A-сканирований уменьшено по сравнению с шагом 2.7. для более быстрой частоты кадров для захвата динамики биения сердца мухи (несколько Гц). Количество B-сканов обозначает количество повторяющихся кадров для изображения в М-режиме, которое может быть скорректировано в зависимости от времени записи и доступной системной памяти. В этом эксперименте 128 A-сканирований могут обеспечить скорость ~ 125 кадров / с, и 4000 повторных B-сканирований записываются, обеспечивая непрерывную запись ~ 32 с.</li>
	<li>Получите пять наборов контрольных данных без импульсов стимуляции красным светом для расчета частоты сердечных сокращений в состоянии покоя (RHR).</li>
	<li>Проектирование светового импульса для стимуляции темпа в пользовательском программном обеспечении управления OCT. В разделе «Настройки» добавьте разработанные последовательности световых импульсов для управления частотой импульсов, шириной импульса, длительностью стимуляции и временем ожидания в соответствии с различными протоколами стимуляции. ПРИМЕЧАНИЕ: RHR измеряется на основе контрольного эксперимента без светового освещения и используется для расчета частоты, с которой свет должен быть импульсным для экспериментов с тахипацией и брадипаундированием22.</li>
	<li>Откройте программное обеспечение контроллера света (см. Таблицу материалов) для генерации импульсов красного света. Выберите импульсный режим в разделе «Выбор режима». Дважды щелкните рисунок для настроек «Pulse Profile» и выберите «Режим подписчика». Сохраните интенсивность OFF как 0 и установите процент интенсивности ON при расчете фактической плотности мощности. ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулирующие световые импульсы запускаются сигналом от программного обеспечения управления OCT в соответствии с настройками, указанными в шаге 2.12.</li>
	<li>Получите видео в М-режиме бьющегося сердца дрозофилы со световой стимуляцией, нажав на Получить в программном обеспечении управления OCT. Повторите измерения 5x.</li>
</ol>3. Анализ изображений
<ol><li>Откройте специально разработанное программное обеспечение для сегментации сердца мух.</li>
	<li>Нажмите Выбрать файл, а затем выберите файл для анализа в появившемся графическом интерфейсе.</li>
	<li>Введите вертикальные и горизонтальные границы области сердца в пикселях в верхних текстовых полях. Нажмите Изменить размер. Используя ползунок внизу, убедитесь, что вся область сердца видна и что она заполняет всю коробку для всей коллекции. Если это не так, повторите этот процесс и скорректируйте границы.</li>
	<li>Нажмите « Предсказать », чтобы предсказать область сердца. Теперь программа будет проходить через каждый кусочек в коллекции и выбирать область сердца, занимая примерно 3 минуты.</li>
	<li>Нажмите на HR Plot после завершения прогноза. Это откроет новое окно, отображающее график области сердца с течением времени. Убедитесь, что выбраны правильные пиковые или долинные участки. Выберите Pulse , а затем HR , чтобы сгенерировать окончательную цифру, и функциональные параметры будут сохранены в файлах .csv одновременно.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2010.">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Tsai, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning.">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li><li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy.">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li><li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+optogenetics:+a+decade+of+enlightenment.">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li><li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo.">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li><li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cardiac+function.">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li><li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies.">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li><li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation.">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li><li>Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+identification+of+genes+causing+adult+human+heart+disease.">Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).</li><li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila.">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).</li><li>Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+heart+function+in+larval+Drosophila+melanogaster+for+physiological+studies.">Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).</li><li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts:+Room+temperature,+acute+and+chronic+cold+stress.">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li><li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2++concentrations.">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).</li><li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae.">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li><li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+(OCM).">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).</li><li>Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+adult+Drosophila+melanogaster+heart+with+real-time+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography.</a> Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer's+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction.">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li><li>Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+red-light+optogenetic+control+of+Drosophila+cardiac+function.">Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function.</a> Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).</li><li>Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+pacing+in+Drosophila+melanogaster.">Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster.</a> Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).</li><li>Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chloride+flux+on+Drosophila+heart+rate.">The effects of chloride flux on Drosophila heart rate.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).</li><li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genome of Drosophila melanogaster. , (1992).</li><li>. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html</a> (2022)</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyNet+2.0:+Drosophila+heart+3D+(2D+++time)+segmentation+in+optical+coherence+microscopy+images+using+a+convolutional+long+short-term+memory+neural+network.">FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network.</a> Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-synthetic,+general-purpose+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139 (10), 56 (2019).</li><li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+genetic+screens,+and+cardiac+function.">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).</li><li>Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+homology+between+Drosophila+melanogaster+and+vertebrate+cardiovascular+systems.">Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).</li><li>Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assess+Drosophila+heart+development,+function+and+aging.">Methods to assess Drosophila heart development, function and aging.</a> Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart.">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

По сравнению с нашими предыдущими отчетами, где экспрессия опсинов была вызвана не только в сердце, но и в окружающих мышечных тканях, настоящая работа сообщает с использованием кардиоспецифического драйвера , Hand-GAL4. Эта новая генетическая конфигурация hand> opsin, используемая для оптогенетической регуляции сердца, еще раз подтверждает ранее сообщенные результаты и устанавливает лучшую модель сердечно-сосудистых исследований дрозофилы .
Подготовка сми имеет важное значение для успеха экспериментов. Белки опсина требуют лиганда, полностью транс-ретинального (ATR), чтобы функционировать28. Мухи не производят достаточно atr, поэтому ATR должен быть дополнен в среду полета. В этом исследовании ранее сообщенная пища быстрого приготовления была заменена полуопределенной средой29. Новая рецептура ATR-содержащих сред была введена для обеспечения равномерного распределения ATR. ATR не растворим в воде; когда запас ATR на основе этанола 100 мМ добавляется в среду на водной основе, он диспергируется путем вихря флаконов, содержащих теплые полуопределенные среды. Кроме того, ранее сообщенная концентрация ATR была снижена с 10 мМ для eNpHR2,0 и 3 мМ для ReaChR22 до конечной концентрации 1 мМ для обоих. Эта концентрация достаточна для обеспечения надлежащей функции eNpHR2.0 и ReaChR.
Жизненно важным компонентом экспериментального успеха является улучшенная обработка данных с помощью FlyNet 2.027. Лаборатория продолжает разрабатывать это программное обеспечение для повышения как вычислительной эффективности, так и точности автоматизированного алгоритма сегментации сердца мухи. Маски поперечного сечения, производимые этим программным обеспечением, используются для получения физиологических данных дрозофилы , таких как дробное укорочение и скорость сердечной стенки. Этот подход позволил эффективно анализировать данные с минимальным наблюдением человека, что позволяет быстрее и надежнее охарактеризовать функцию сердца для больших наборов данных визуализации сердца мух.
Инфаркт миокарда остается ведущей причиной смерти, а ишемия миокарда способствует двум третям всех случаев сердечной недостаточности, которая стремительно вырисовывается среди ведущих причин смертности и заболеваемости в США30. Разработка новых терапевтических средств и медицинских устройств требует глубоких знаний механизмов сердечных заболеваний на физиологическом и биохимическом уровнях. Эти цели могут быть достигнуты с помощью модельных организмов. D. melanogaster зарекомендовал себя как одна из самых надежных и эффективных моделей 31,32,33,34,35. Эта работа создала смоделированные модели сердечных расстройств дрозофилы, вызванные неинвазивным оптогенетическим подходом. Развитие неинвазивных оптических технологий кардиостимуляции обеспечивает основу для разработки альтернативы традиционным электрическим кардиостимуляторам. Использование OCT для наблюдения за функцией сердца в режиме реального времени позволяет исследованиям точно охарактеризовать соответствующую физиологию сердца в моделях дрозофилы для расширенных исследований, включая скрининг кандидатов на лекарства. OCT-визуализация имеет глубину проникновения ~ 1 мм, что хорошо работает для исследований сердца дрозофилы, но ограничивает ее использование для характеристики функции сердца на более крупных животных моделях. Кроме того, прямой перевод исследований дрозофилы на модели млекопитающих представляет собой проблему. Необходимо разработать новые оптогенетические инструменты для улучшения чувствительности к опсинам и перевода их в различные модельные системы, включая рыбок данио, мышей, крыс и органоидов сердца человека, для сердечно-сосудистых исследований.

В конце 2010 года журнал Nature Methods выбрал оптогенетику в качестве метода года1. Использование генетических инструментов (трансгенных опсинов), регулируемых светом, для контроля биологических тканей, представляющих интерес, с беспрецедентной точностью и скоростью открыло шлюз для новых применений. На сегодняшний день большинство достижений относятся к нейробиологии. Технология была внедрена как новый метод точного управления одиночными нейронами2 и продвинулась к открытиям в области когнитивных функций живого организма3. С самого начала нейробиологи продемонстрировали способность модулировать поведение всего организма. Экспрессия и легкая активация опсина ChR2 у дофаминергических нейронов мышей вызывали их активацию и были достаточными для управления поведенческим обусловливанием4. Оптогенетическое ингибирование подмножества нейронов, содержащих галорходопсин NpHR2.0, доставляемых в эпилептический очаг мозга грызунов, приводило к ослаблению электроэнцефалографических припадков5.
Оптогенетические приложения в кардиологии развиваются устойчивыми темпами6. ChR2 успешно экспрессировался в культуре клеток кардиомиоцитов и у мышей; кардиостимуляция проводилась вспышками синего света (выполнялась с использованием имплантированного волокна у живых животных)7. У рыбок данио ChR2 экспрессировался и использовался для идентификации области сердца, вызывающей темп; Активация NpHR индуцировала остановку сердца8. Оптогенетическая кардиостимуляция обладает уникальным потенциалом для разработки новых методов кардиостимуляции и ресинхронизирующейтерапии 9. Попытки установить систему прекращения аутогенной аритмии были зарегистрированы в последнее время, а также10.
Обширные исследования и разработка новых терапевтических методов лечения требуют применения различных модельных систем, от клеточной культуры до млекопитающих. Сердце позвоночных является очень сложным органом. Кардиомиоциты (КМ) составляют треть всех сердечных клеток; другие клетки включают нейроны, гладкомышечные клетки сосудов и невозбудимые клетки (то есть эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки). Исследование клеточной культуры СМ ограничивает трансляцию полученных результатов в медицинские приложения человека. Генетические манипуляции модельных организмов млекопитающих ограничены и отнимают много времени. Меньшие модели беспозвоночных имеют много преимуществ; их сердечно-сосудистая система несет в себе все необходимые гистологические элементы. Drosophila melanogaster (плодовая муха) представляет собой простую и мощную генетическую модельную систему для исследования роли генов, связанных с заболеваниями человека, включая сердечные заболевания 11,12,13. Как недолговечные животные, плодовые мушки представляют собой прекрасную возможность для моделирования возрастных или зависимых от болезней изменений сердечной функции, которые можно проследить на протяжении всей жизни 14,15,16,17. Сердечная трубка плодовой мухи расположена на спинной стороне ее тела в пределах 200 мкм от поверхности кутикулы, что позволяет видимому ближнему инфракрасному свету достигать сердечной трубки. Эта анатомическая особенность позволяет неинвазивное оптическое измерение сердца дрозофилы с использованием существующих оптогенетических инструментов.
Для мониторинга сердца дрозофилы была разработана специальная спектрально-доменная оптическая когерентная томография (SD-OCT) с интегрированным модулем возбуждения светодиодного возбуждения красного света18. Морфологические и ритмические изменения в относительно простом сердце плодовой мухи могут быть легко проанализированы с помощью этой неинвазивной биомедицинской технологии визуализации 12,19,20,21. Благодаря улучшенной производительности оптического сечения и пространственному разрешению в микронном масштабе, OCT успешно используется для исследования структуры и мониторинга функции сердца дрозофилы на разных стадиях развития, включая 3-ю звездную личинку и раннюю куколку18. Эта система также позволяет одновременно контролировать и стимулировать сердечное состояние дрозофилы у интактного животного. Схематическое представление системы центр развертывания Office показано на рисунке 1. Система SD-OCT использует сверхлюминесцентный диод (SLD) в качестве источника света (центральная длина волны: 850 нм ± 10 нм, FWHM: 165 нм, см. Таблицу материалов). Используя объективную линзу 10x, система визуализации OCT может достичь осевого разрешения ~ 4,4 мкм в воздухе и ~ 3,3 мкм в ткани и бокового разрешения ~ 2,8 мкм, достаточного для разрешения мелких деталей структур сердца мухи18,22. Интерференционные сигналы отраженного света от опорного рычага и образца манипулятора обнаруживаются с помощью спектрометра с 2048-пиксельной линейной сканирующей камерой (максимальная скорость линии: 80 кГц, см. Таблицу материалов). Измеренная чувствительность системы составляет ~95,1 дБ. Каждое сканирование центра развертывания Office в B-режиме создает изображение поперечного сечения в плоскости изображения xz. Повторяющиеся изображения B-режима получаются в одном и том же месте для создания изображений M-режима, захватывающих бьющееся сердце более 30 с 18,22,23. Частота кадров для изображения в М-режиме составляет ~ 125 кадров / с, что достаточно для захвата динамики биения сердца плодовой мухи.
Для оптогенетической регуляции функции сердца дрозофилы модуль освещения со светодиодным источником света 617 нм интегрирован с образцовым рычагом системы SD-OCT. Стимулирующий свет фокусируется на точке диаметром ~ 2,2 мм на поверхности образца, в том же положении, что и точка фокусировки изображения. Специально написанное программное обеспечение используется для управления режимом освещения (интенсивность света, ширина импульса и рабочий цикл), регулировки частоты стимуляции светового импульса и синхронизации освещения светодиодного модуля и получения изображений OCT в М-режиме22.
В недавних публикациях описывалась трансгенная система Drosophila, состоящая из пространственно-височно регулируемых chR2, ReaChR и eNpHR2.0 опсинов с использованием генетической системы UAS/GAL4. Полученные результаты продемонстрировали способность инициировать остановку сердца и брадикардию, вызванную активацией красным светом eNpHR2.0 и более высокочастотной кардиостимуляцией, вызванной активацией синим светом ChR2. Аналогичные эксперименты были проведены с другим канальнымродопсином, ReaChR, индуцируемым освещением красным светом 22,23,24. Экспрессия опсина во всех описанных экспериментах была обусловлена 24B-GAL4, где экспрессия опсина наблюдалась в широком спектре тканей, включая кардиомиоциты и окружающие мышечные клетки. В текущем исследовании 24B-GAL4 был заменен драйвером Hand-GAL4 для достижения экспрессии опсинов eNpHR2.0 и ReaChR, специфичных для сердца.
В целом, представленные экспериментальные результаты демонстрируют восстановительную остановку сердца и индуцируемую брадикардию и тахикардию сердечных заболеваний. Приведен подробный протокол с пошаговыми инструкциями по созданию трансгенных моделей дрозофилы и проведению одновременной ОКТ-визуализации и экспериментов с оптогенетическим темпом у живых животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>18449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>02-10-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLED Light Source Control Module, 4-channel</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-SA04-US</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband Light Source Module</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>cBLMD-T-850-HP</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra-S 800 OCT Spectrometers</td>
			<td>&#160;Wasatch Photonics</td>
			<td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professtional</td>
			<td>34155</td>
			<td>tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila culture bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyNet 2.0 Software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Collimator Sources</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-LCS-0617-03-22</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-72P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow plugs for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow vials for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugs for Drosophila bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1386-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT control software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT imaging and optogenetic pacing system</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>89-2871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 41752</td>
			<td>eNpHR2.0 transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 53748</td>
			<td>ReaChR transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 48396</td>
			<td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock #6658</td>
			<td>GFP reporter line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Lab Scientific bioKEMIX</td>
			<td>978-907-4243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function

Использование Drosophila melanogaster (плодовая муха) в качестве модельного организма обеспечило значительный прогресс во многих областях биологической науки, от клеточной организации и геномных исследований до поведенческих исследований. Благодаря накопленным научным знаниям, в последние годы дрозофила была выведена в область моделирования заболеваний человека, в том числе сердечных заболеваний. В представленной работе описана экспериментальная система мониторинга и манипулирования функцией сердца в контексте всего живого организма с использованием красного света (617 нм) и без инвазивных процедур. Контроль над сердцем достигался с помощью оптогенетических средств. Оптогенетика сочетает в себе экспрессию светочувствительных трансгенных опсинов и их оптическую активацию для регулирования интересующей биологической ткани. В этой работе была использована специальная интегрированная оптическая когерентная томография (ОКТ) и система оптогенетической стимуляции для визуализации и модуляции функционирующего сердца D. melanogaster на 3-й стадии развития личинки звезды и ранней стадии развития куколки. Двойная генетическая система UAS/GAL4 использовалась для экспрессии галорходопсина (eNpHR2.0) и каналародопсина с красным смещением (ReaChR), особенно в сердце мухи. Приведены подробные сведения о подготовке D. melanogaster к визуализации OCT в реальном времени и оптогенетическому кардиостимуляции. Разработанное в лаборатории интеграционное программное обеспечение обрабатывало данные визуализации для создания визуальных представлений и количественных характеристик функции сердца дрозофилы . Результаты демонстрируют возможность инициирования остановки сердца и брадикардии, вызванных активацией eNpHR2.0, и выполнения кардиостимуляции при активации ReaChR.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Настоящий протокол описывает генерацию Drosophila melanogaster , экспрессирующего eNpHR2.0 или ReaChR опсины в сердце для визуализации OCT и оптогенетической кардиостимуляции. Представлены подробные инструкции по визуализации Drosophila OCT и модуляции сердцебиения, включая моделирование восстановительной остановки сердца, брадикардии и тахикардии у живых животных на разных стадиях развития.

Разработка моделей Drosophila melanogaster для визуализации и оптогенетического контроля сердечной функции

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

В протоколе представлены модели дрозофилы, где функцию сердца можно охарактеризовать и контролировать с помощью света. Это позволяет исследователям изучать сердечные заболевания человека у дрозофилы с использованием интактных животных. Этот метод может надежно достичь неинвазивной визуализации OCT и оптогенетического контроля функции сердца Drosophila.Обладает высокой эффективностью и качеством. Оптогенетическое кардиостимуляция потенциально может быть альтернативой электрическому кардиостимуляции в качестве терапии для лечения аритмических расстройств. Oct-визуализация и оптогенетический темп могут быть распространены на другие модельные системы, такие как органоиды сердца, рыбы данио и эмбриональное горло и сердце.Для начала объедините пять рук GAL4 над TM6 двустворчатой девственной самкой и двумя-тремя самцами мух из UAS Ops и Stock на флакон. На следующий день приготовьте полуопределенную пищу в соответствии с инструкциями Bloomington Drosophila Stock Center, добавив 5,14 грамма на 100 миллилитров сахарозы в контейнер на горячей плите. Затем охладите его до 60 градусов Цельсия при постоянном перемешивании.Затем приготовьте узкие флаконы, добавив в каждый флакон 50 микролитров 100 миллимолярного полностью транс-раствора этанола сетчатки. Используйте серологическую пипетку, чтобы утилизировать пять миллилитров корма мухи на узкую мерзкую муху. После вихрения на максимальной скорости в течение 10 секунд заткните эти флаконы и заверните их в темную ткань, чтобы защитить их от света.На следующий день перенесите мух, неуклонно откладывающих яйца, во флаконы с полностью транс-сетчаточным этанолом, содержащим пищу. Защитите стеллажи флаконами от света. Через 24-48 часов, в зависимости от количества отложенных яиц, откажитесь от родителей, чтобы предотвратить перенаселение флаконов.Затем соберите потомство нетуби для визуализации сердца. Выберите из флакона вариант UAS личинку GAL4 или куколку, положите ее на салфетку и аккуратно вытрите носитель с поверхности тела с помощью малярной кисти. Подготовьте слайд микроскопа с небольшим кусочком двусторонней ленты посередине.Затем аккуратно поместите личинку или куколку на поверхность ленты спинной стороной вверх и перпендикулярно длинной стороне слайда с помощью щетки или тонкого пинцета. Приложите мягкое давление, чтобы прикрепить личинку или куколку к поверхности ленты. Теперь настройте слайд на стадии визуализации с личинкой или куколкой вниз и включите оптическую когерентную томографию или источник света OCT с помощью программного обеспечения для управления лазером.Откройте специально записанное программное обеспечение управления центром развертывания Office в спектральном домене. Затем нажмите на окно предварительного просмотра. Затем задайте параметры сканирования в программном обеспечении OCT спектральной области.Используйте микроманипуляторы для управления стадией образца, чтобы сфокусировать сердце мухи. Отрегулируйте фокусное положение, чтобы свести к минимуму отражение света от поверхности мушки. Кроме того, рассмотрите возможность нанесения минерального масла на поверхность личинки или куколки, чтобы свести к минимуму отражение.Затем задайте параметры сканирования для получения изображения OCT в режиме M и получите пять наборов контрольных данных без импульсов стимуляции красным светом для расчета частоты сердечных сокращений в состоянии покоя. Проектирование светового импульса для стимуляции темпа в пользовательском программном обеспечении управления OCT. Для этого нажмите на вкладки настроек и добавьте разработанные последовательности световых импульсов для управления частотой импульса, шириной импульса, длительностью стимуляции и временем ожидания в соответствии с различными протоколами стимуляции.Затем откройте программное обеспечение контроллера света, чтобы генерировать импульсы красного света. Выберите импульсный режим в выборе режима. Дважды щелкните рисунок для настроек профиля импульса и выберите режим следования.Держите интенсивность выключения на нулевом уровне и установите процент интенсивности при расчете фактической плотности мощности. Получите видео в режиме M бьющегося сердца дрозофилы со световой стимуляцией, нажав на Получить в программном обеспечении OCT Control. Записывайте вспышки красного света вниз по сердцу мухи во время получения изображений.Обратите внимание, что для управления функцией сердца мухи требуются различные настройки темпа с помощью моделей с красным смещением ченнелордопсина и NPHR. Откройте специально разработанное программное обеспечение для сегментации сердца мухи и нажмите на выбранный файл. Затем выберите файл для анализа в графическом интерфейсе пользователя.Введите вертикальные и горизонтальные границы области сердца в пикселях в верхних текстовых полях. Нажмите на изменение размера. Используя ползунок внизу, убедитесь, что вся область сердца видна и что она заполняет всю коробку для всей коллекции.После нажатия на вкладку прогнозирования программа пройдет через каждый фрагмент в коллекции и выберет область сердца примерно через три минуты. Как только прогноз будет завершен, нажмите на график HR, чтобы отобразить график области сердца с течением времени в новом окне. Выберите правильные области пика или долины, выберите пульс, а затем вкладки HR, чтобы сгенерировать окончательную цифру.Функциональные параметры будут одновременно сохранены в CSV-файлах. Тканевая специфичность ручного драйвера GAL4 была проверена путем визуализации экспрессии зеленого флуоресцентного белка. Типичные изображения OCT поперечного сечения личинок и куколок показаны здесь.Чтобы имитировать различные сердечные заболевания, были разработаны четыре типа световых импульсов. Один импульс, длившийся 10 секунд после пяти секунд ожидания, вызвал восстановительную остановку сердца. Для кардиостимуляции на частотах ниже частоты сердечных сокращений в состоянии покоя использовались две последовательности световых импульсов с частотами темпа, равными половине частоты сердечных сокращений в состоянии покоя, и одной четверти частоты сердечных сокращений в состоянии покоя продолжительностью восемь секунд со временем ожидания в шесть секунд между ними.Схема стимуляции для увеличения частоты сердечных сокращений за счет активации красного каналародопсина состояла из трех последовательностей световых импульсов. Снижение частоты сердечных сокращений после световых сигналов привело к замедлению сердечного ритма, который имитирует личинку и куколку. Серия из трех световых импульсных поездов на разных частотах стимуляции была применена к личинкам, а сердца куколок ясно показали увеличение частоты сердечных сокращений после световых импульсов.Подготовка к выбору правильного потомства, монтаж образца и процедура визуализации имеют важное значение. Мы надеемся перенести технологию оптогенетического кардиостимуляции на более крупные модели животных, изучить болезни сердца млекопитающих и изучить новые терапевтические подходы к лечению аритмии.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Простой микрофлюидных устройства для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация<em&gt; C. Элеганс</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; И данио рерио

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Пробоподготовки Стратегии масс-спектрометрии изображений 3D-клеточной культуре Модели

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

В Vivo количественной оценки структуры миокарда, функции, перфузии и жизнеспособности Использование сердца Микро-компьютерная томография

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

Масштабные Анатомические модели Создание биомедицинских томографических изображений данных и связанные с ними метки для последующих подповерхностных лазерной гравировки (SSLE) кристаллов стекла

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Ориентация нейрональных волокна участки для глубоких мозга стимуляции терапии с использованием интерактивных, пациент конкретных моделей

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Создание простой и универсальной системы освещения для оптогенетических экспериментов

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Разработка 3D-организованной сердечной ткани человека в рамках микрофлюидной платформы

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Количественная оценка функции левого желудочка сердца мыши, деформации миокарда и гемодинамических сил с помощью сердечно-сосудистой магнитно-резонансной томографии

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Создание специфических для пациента силиконовых моделей сердца с применением в предоперационных планах и практическом обучении

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...