Name: developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

Författarna tackar Andrey Komarov, Yuxuan Wang och Jiantao Zhu för deras hjälp med dataanalys och tackar Zhou-labbmedlemmarna för deras värdefulla diskussioner. Arbetet i Dr. Zhous laboratorium stöddes av en startfond från Washington University i St. Louis, National Institutes of Health (NIH) beviljar R01-EB025209 och R01-HL156265 och Clayco Foundation Innovative Research Award.

För denna studie, eNpHR2.0 transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, och hjärtspecifik GAL4-drivrutin som innehåller handgenreglerande fragment w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (detta drivrutinslager kommer att anges som Hand-GAL4) användes. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 användes som GFP-reporterlinje. De nämnda Drosophila-lagren erhölls från Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, se materialförteckning) och hölls vid rumstemperatur eller vid 18 °C på vanliga majsmjölsmedier. Drosophila-modellerna som utvecklats i denna studie är tillgängliga på begäran för samarbete.
1. Drosophila genetiska kors och medieberedning
<ol><li>Ändra den 3: e kromosombalanseraren TM3 Sb [1] till TM6 Sb Tb, skapa w [1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Se kompletterande figur 1 för korsningssystemet. Ställ kors i ampuller med vanliga majsmjölsmedier. OBS: Närvaron av en Tb-markör gör det möjligt för användare att skilja larver och puppor som innehåller opsintransgen och GAL4-drivrutinen från djur som innehåller opsin men ingen drivrutin25.</li>
	<li>Förvara de genetiska korsen i en 25 ° C, 70% fuktighetsinkubator på speciellt formulerade all-trans retinaI (ATR) -innehållande media (se materialtabell) i mörkret i 5 dagar för larvsamling och 6 dagar för puppsamling.</li>
	<li>Kombinera fem Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb jungfruliga honor och två till tre hanar från UAS-opsin-bestånd (eNpHR2.0 eller ReaChR) per injektionsflaska. Se korsdiagrammet för eNpHR2.0 och ReaChR opsin i figur 2A respektive figur 2B.</li>
	<li>På nästa dag, förbered ATR-innehållande mediaflaskor.<ol><li>Förbered halvdefinierad mat enligt instruktionerna i BDSC26. Istället för sackaros och glukos, tillsätt endast sackaros (5,14 g/100 ml). Kyl till ~60 °C under konstant omrörning.</li>
		<li>Förbered smala flugflaskor och tillsätt 50 μl 100 mM ATR-etanollösning till varje injektionsflaska.</li>
		<li>Använd en serologisk pipett och kassera flugmat till smala flugflaskor, 5 ml per injektionsflaska. Vortex vid maximal hastighet i 10 s.</li>
		<li>Anslut injektionsflaskorna och linda in dem i det mörka tyget för att skydda dem från ljus. Låt injektionsflaskorna torka i minst 12 timmar (över natten).</li>
	</ol></li>
	<li>Nästa dag, överför flugorna stadigt lägger ägg från steg 1.3. till injektionsflaskorna med ATR-innehållande livsmedel (steg 1.4.4). Skydda ställen med ampuller från ljus.</li>
	<li>Efter 24-48 h (beroende på antalet ägg som läggs), kassera föräldrarna för att förhindra överbefolkning av injektionsflaskan.</li>
	<li>Samla icke-Tb-avkomma och använd dem för hjärtavbildning. OBS: De fenotypiska skillnaderna vid larv- och valpstadierna demonstreras i figur 2C. Sammanfattningen och den ungefärliga tidslinjen för provberedningsstegen visas i figur 3.</li>
</ol>2. Optogenetisk kontroll av Drosophila-hjärtat 
<ol><li>Välj UAS-opsin/Hand-GAL4 larv/ puppa från injektionsflaskan (steg 1.7), sätt på vävnad och torka försiktigt av mediet från kroppsytan med en målarborste.</li>
	<li>Förbered mikroskopbilden och placera en liten bit dubbelsidig tejp i mitten.</li>
	<li>Använd en borste eller finpincett och placera försiktigt larven/puppan på tejpytan med ryggsidan uppåt och vinkelrätt mot bildens långsida. Tryck försiktigt för att fästa larven/poppen på tejpytan.</li>
	<li>Sätt upp rutschkanan på bildstadiet, larv/puppa nedåt.</li>
	<li>Slå på OCT-ljuskällan med laserkontrollprogramvara (se Materialförteckning). Öppna den specialskrivna SD-OCT-kontrollprogramvaran och klicka sedan på förhandsgranskningsfönstret .</li>
	<li>Ställ in skanningsparametrarna i SD-OCT-programvaran. OBS: Målet är att justera provet för optimal avbildning av det bultande hjärtat, så att välja X-intervall och Y-intervall täcker hjärtats region. I det här steget är både antalet A-skanningar och B-skanningar 400. Intervallet i x- och y-riktningarna är ~490 μm och ~537 μm, vilket visar hjärtats två ortogonala tvärsnitt (xz respektive yz).</li>
	<li>Använd mikromanipulatorer för att styra provsteget för att få flughjärtat i fokus. Justera brännvidden för att minimera ljusreflektion från flugans nagelbandsyta. Överväg att applicera mineralolja på larv/puppaytan för att minimera reflektion. OBS: Olja kan öka risken för djurrörelser genom att kompromissa med tejpens vidhäftande egenskaper.</li>
	<li>Se till att flyghjärtat kan ses fullt ut i bildfönstret utan några snedvridningar, blockeras av vävnad och icke-försumbara skuggor och reflektioner; annars går du tillbaka till steg 2.7.</li>
	<li>Ställ in skanningsparametrarna för OCT-bildförvärv i M-läge. OBS: Antalet A-skanningar minskas jämfört med steg 2.7. för den snabbare bildfrekvensen för att fånga flyghjärtats slagdynamik (flera Hz). Antalet B-skanningar anger antalet upprepade bildrutor för M-lägesavbildning, som kan justeras baserat på inspelningstid och tillgängligt systemminne. I detta experiment kan 128 A-skanningar tillåta en hastighet på ~ 125 ramar / s, och 4,000 upprepade B-skanningar spelas in, vilket ger en kontinuerlig inspelning på ~ 32 s.</li>
	<li>Skaffa fem uppsättningar kontrolldata utan röda ljusstimuleringspulser för att beräkna vilopulsen (RHR).</li>
	<li>Designa ljuspulsen för tempostimulering i den anpassade OCT-kontrollprogramvaran. I "Inställningar" lägger du till de designade ljuspulssekvenserna för att styra pulsfrekvens, pulsbredd, stimuleringstid och väntetid enligt olika stimuleringsprotokoll. OBS: RHR mäts från kontrollexperimentet utan ljusbelysning och används för att beräkna frekvensen vid vilken ljus ska pulseras för takypacing och bradypacing-experiment22.</li>
	<li>Öppna programvaran för ljusstyrenhet (se materialförteckning) för att generera pulser för rött ljus. Välj pulsläge i "Lägesval". Dubbelklicka på figuren för inställningarna för "Pulsprofil" och välj Följarläge. Håll OFF-intensiteten som 0 och ställ in ON-intensitetsprocenten när du beräknar den faktiska effekttätheten. OBS: Stimuleringsljuspulser utlöses av en signal från OCT-styrprogramvaran enligt inställningarna i steg 2.12.</li>
	<li>Skaffa M-mode-videor av det slående Drosophila-hjärtat med ljusstimulering genom att klicka på Acquire i OCT-kontrollprogramvaran. Upprepa mätningarna 5x.</li>
</ol>3. Bildanalys
<ol><li>Öppna den specialutvecklade programvaran för segmentering av flyghjärtan.</li>
	<li>Klicka på Välj fil och välj sedan filen som ska analyseras i GUI som visas.</li>
	<li>Ange både de lodräta och vågräta gränserna för hjärtregionen i pixlar i de översta textrutorna. Klicka på Ändra storlek. Använd skjutreglaget på botten och se till att hela hjärtregionen är synlig och att den fyller upp hela lådan för hela samlingen. Om det inte är det, upprepa denna process och justera gränserna.</li>
	<li>Klicka på Förutsäga för att förutsäga hjärtregionen. Programmet kommer nu att gå igenom varje skiva i samlingen och välja hjärtregion, vilket tar cirka 3 minuter.</li>
	<li>Klicka på HR Plot när förutsägelsen är klar. Detta öppnar ett nytt fönster som visar en tomt i hjärtområdet över tiden. Se till att rätt topp- eller dalområden väljs. Välj Puls och sedan HR för att generera en slutlig siffra, och de funktionella parametrarna sparas i de .csv filerna samtidigt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2010.">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Tsai, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning.">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li><li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy.">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li><li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+optogenetics:+a+decade+of+enlightenment.">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li><li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo.">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li><li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cardiac+function.">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li><li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies.">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li><li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation.">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li><li>Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+identification+of+genes+causing+adult+human+heart+disease.">Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).</li><li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila.">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).</li><li>Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+heart+function+in+larval+Drosophila+melanogaster+for+physiological+studies.">Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).</li><li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts:+Room+temperature,+acute+and+chronic+cold+stress.">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li><li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2++concentrations.">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).</li><li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae.">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li><li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+(OCM).">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).</li><li>Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+adult+Drosophila+melanogaster+heart+with+real-time+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography.</a> Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer's+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction.">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li><li>Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+red-light+optogenetic+control+of+Drosophila+cardiac+function.">Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function.</a> Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).</li><li>Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+pacing+in+Drosophila+melanogaster.">Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster.</a> Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).</li><li>Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chloride+flux+on+Drosophila+heart+rate.">The effects of chloride flux on Drosophila heart rate.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).</li><li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genome of Drosophila melanogaster. , (1992).</li><li>. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html</a> (2022)</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyNet+2.0:+Drosophila+heart+3D+(2D+++time)+segmentation+in+optical+coherence+microscopy+images+using+a+convolutional+long+short-term+memory+neural+network.">FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network.</a> Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-synthetic,+general-purpose+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139 (10), 56 (2019).</li><li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+genetic+screens,+and+cardiac+function.">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).</li><li>Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+homology+between+Drosophila+melanogaster+and+vertebrate+cardiovascular+systems.">Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).</li><li>Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assess+Drosophila+heart+development,+function+and+aging.">Methods to assess Drosophila heart development, function and aging.</a> Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart.">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Jämfört med våra tidigare rapporter där uttrycket av opsiner drevs inte bara i hjärtat utan också i de omgivande muskelvävnaderna, rapporterar det nuvarande arbetet med hjälp av en hjärtspecifik drivrutin, Hand-GAL4. Denna nya Hand> opsin genetiska konfiguration som används för optogenetisk hjärtreglering bekräftar ytterligare tidigare rapporterade resultat och etablerar en bättre Drosophila kardiovaskulär forskningsmodell.
Medieförberedelser är avgörande för att experimenten ska lyckas. Opsinproteiner kräver en ligand, all-trans retinal (ATR), för att fungera28. Flugor producerar inte tillräckligt med ATR, så ATR måste kompletteras med flugmedia. I denna studie ersattes den tidigare rapporterade snabbmaten med Semi-Defined media29. Det nya receptet på ATR-innehållande media introducerades för att säkerställa en enhetlig fördelning av ATR. ATR är inte lösligt i vatten; När etanolbaserad 100 mM ATR-stam tillsätts till vattenbaserade medier sprids den genom virvelbildning av injektionsflaskorna som innehåller varma halvdefinierade medier. Dessutom sänktes den tidigare rapporterade ATR-koncentrationen från 10 mM för eNpHR2,0 och 3 mM för ReaChR22 till en slutlig koncentration på 1 mM för båda. Denna koncentration är tillräcklig för att säkerställa korrekt eNpHR2.0 och ReaChR-funktion.
En viktig del av den experimentella framgången är den förbättrade databehandlingen med FlyNet 2.027. Laboratoriet har fortsatt att utveckla denna programvara för att förbättra både beräkningseffektiviteten och noggrannheten hos den automatiserade flughjärtsegmenteringsalgoritmen. Tvärsnittsmaskerna som produceras av denna programvara används för att härleda Drosophila fysiologiska data såsom fraktionerad förkortning och hjärtväggshastighet. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort effektiv dataanalys med minimal mänsklig övervakning, vilket gör det snabbare och mer tillförlitligt att karakterisera hjärtfunktionen för stora flyghjärtavbildningsdataset.
Hjärtinfarkt är fortfarande den främsta dödsorsaken, och myokardiell ischemi bidrar till två tredjedelar av alla fall av hjärtsvikt, som snabbt växer fram bland de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i USA30. Utvecklingen av nya terapier och medicintekniska produkter kräver djup kunskap om mekanismerna för hjärtsjukdomar på fysiologiska och biokemiska nivåer. Dessa mål kan uppnås med hjälp av modellorganismer. D. melanogaster har etablerat sig som en av de mest pålitliga och effektiva modellerna 31,32,33,34,35. Detta arbete har genererat de simulerade Drosophila-hjärtsjukdomarsmodellerna inducerade av ett icke-invasivt optogenetiskt tillvägagångssätt. Utvecklingen av icke-invasiv optisk hjärtpacingteknik ger en grund för att utveckla ett alternativ till traditionella elektriska hjärtpacing-enheter. Genom att använda OCT för att observera hjärtfunktionen i realtid kan studier exakt karakterisera relevant hjärtfysiologi i Drosophila-modeller för avancerade undersökningar, inklusive screening av läkemedelskandidater. OCT-avbildning har ett penetrationsdjup på ~ 1 mm, vilket fungerar bra för Drosophila-hjärtstudier men begränsar dess användning för att karakterisera hjärtfunktionen i större djurmodeller. Dessutom är det en utmaning att direkt översätta Drosophila-forskning till däggdjursmodeller. Nya optogenetiska verktyg måste utvecklas för att förbättra opsinernas känslighet och översätta dem till olika modellsystem, inklusive zebrafiskar, möss, råttor och mänskliga hjärtorganoider, för kardiovaskulär forskning.

I slutet av 2010 valde tidskriften Nature Methods optogenetik som årets metod1. Genom att använda genetiska verktyg (transgena opsiner) som regleras av ljus för att kontrollera biologiska vävnader av intresse med oöverträffad precision och hastighet öppnades en översvämningsport för nya applikationer. Hittills hör majoriteten av prestationerna till neurovetenskap. Tekniken introducerades som en ny metod för exakt kontroll av enskilda neuroner2 och har avancerat till upptäckter inom området levande organismkognitiv funktion3. Från början visade neuroforskare förmågan att modulera hela organismens beteende. Uttryck och ljusaktivering av ChR2-opsin hos möss dopaminerga neuroner orsakade deras aktivering och var tillräckliga för att driva beteendekonditionering4. Optogenetisk hämning av en delmängd av neuroner innehållande halorhodopsin NpHR2.0 levererad till det epileptiska fokuset i gnagarhjärnan resulterade i dämpning av elektroencefalografiska anfall5.
Optogenetiska tillämpningar inom kardiologi utvecklas i stadig takt6. ChR2 uttrycktes framgångsrikt i kardiomyocyter cellodling och hos möss; hjärtpacing utfördes genom blixtar av blått ljus (utfört med användning av en implanterad fiber i levande djur)7. I zebrafisk uttrycktes ChR2 och användes för att identifiera den taktskapande hjärtregionen; NpHR-aktivering inducerad hjärtstopp8. Optogenetisk hjärtpacing har den unika potentialen för att utveckla nya pacing- och omsynkroniseringsterapier9. Försök att etablera ett autogent arytmiavslutningssystem har också rapporterats nyligen10.
Omfattande forskning och utveckling av nya terapeutiska behandlingar kräver tillämpning av olika modellsystem, från cellodling till däggdjur. Ett ryggradsdjurs hjärta är ett mycket komplext organ. Kardiomyocyter (CM) utgör en tredjedel av alla hjärtceller; Andra celler inkluderar neuroner, vaskulära glattmuskelceller och icke-exciterbara celler (dvs endotelceller, fibroblaster och immunceller). Forskning om CM-cellodling begränsar översättningen av de erhållna resultaten till humana medicinska tillämpningar. Däggdjursmodellorganismers genetiska manipulationer är begränsade och tidskrävande. Mindre ryggradslösa modeller har många fördelar; Deras kardiovaskulära system bär alla väsentliga histologiska element. Drosophila melanogaster (bananfluga) är ett enkelt och kraftfullt genetiskt modellsystem för att undersöka rollen av gener associerade med mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar11,12,13. Som kortlivade djur utgör bananflugor ett utmärkt tillfälle att modellera ålders- eller sjukdomsberoende hjärtfunktionsförändringar som kan spåras under hela livet14,15,16,17. Bananflugans hjärtrör är beläget på kroppens dorsala sida inom 200 μm från nagelbandsytan, vilket gör att synligt för nära infrarött ljus kan nå hjärtröret. Denna anatomiska funktion möjliggör icke-invasiv optisk pacing av Drosophila-hjärtat med hjälp av befintliga optogenetiska verktyg.
För att övervaka Drosophila-hjärtat utvecklades ett anpassat spektraldomän optisk koherenstomografi (SD-OCT) bildsystem med en integrerad LED-excitationsmodul för rött ljus18. Morfologiska och rytmiska förändringar i ett relativt enkelt fruktflugehjärta kan lätt analyseras med denna icke-invasiva biomedicinska bildteknik 12,19,20,21. Med förbättrad optisk sektionsprestanda och rumslig upplösning i mikronskala har OCT framgångsrikt använts för att undersöka strukturen och övervaka Drosophila-hjärtats funktion i olika utvecklingsstadier, inklusive den 3: e instarlarven och tidig puppa18. Detta system möjliggör också samtidig övervakning och stimulering av Drosophilas hjärttillstånd i det intakta djuret. En schematisk vy av ULT-systemet visas i figur 1. SD-OCT-systemet använder en superluminescerande diod (SLD) som ljuskälla (mittvåglängd: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, se materialtabell). Med hjälp av en 10x objektivlins kan OCT-bildsystemet uppnå en axiell upplösning på ~ 4,4 μm i luft och ~ 3,3 μm i vävnad och en lateral upplösning på ~ 2,8 μm, tillräckligt för att lösa fina detaljer i flyghjärtstrukturerna18,22. Interferenssignaler från reflekterat ljus från referensarmen och provarmen detekteras med hjälp av en spektrometer med en 2048-pixels linjeskanningskamera (max linjehastighet: 80 kHz, se materialförteckning). Den uppmätta systemkänsligheten är ~95,1 dB. Varje OCT-skanning i B-läge genererar en tvärsnittsbild i xz-bildplanet. Upprepade B-lägesbilder förvärvas på samma plats för att skapa M-lägesbilder som fångar det bultande hjärtat i över ~ 30 s 18,22,23. Bildfrekvensen för M-lägesavbildning är ~ 125 bilder / s, tillräckligt för att fånga bananflugans hjärtslagsdynamik.
För den optogenetiska regleringen av Drosophila-hjärtfunktionen , en belysningsmodul med en 617 nm LED-ljuskälla är integrerad med provarmen i SD-OCT-systemet. Stimuleringsljuset är fokuserat på en ~ 2.2 mm diameter fläck på provytan, i samma position som bildfokuspunkten. En specialskriven programvara används för att styra belysningsläget (ljusintensitet, pulsbredd och arbetscykel), justera ljuspulsstimuleringsfrekvensen och synkronisera LED-modulbelysningen och M-läge OCT-bildförvärv22.
Nya publikationer beskrev Drosophila transgena system bestående av spatiotemporalt reglerade ChR2, ReaChR och eNpHR2.0 opsiner med hjälp av UAS / GAL4 genetiska systemet. De erhållna resultaten har visat förmågan att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av aktivering av rött ljus av eNpHR2.0 och högre frekvens hjärtpacing orsakad av aktivering av blått ljus av ChR2. Liknande pacing-experiment utfördes med en annan channelrhodopsin, ReaChR, inducerbar genom rödljusbelysning22,23,24. Opsinuttrycket i alla de beskrivna experimenten drevs av 24B-GAL4, där opsinuttryck observerades i ett brett spektrum av vävnader, inklusive kardiomyocyter och omgivande muskelceller. I den aktuella studien ersattes 24B-GAL4 av en Hand-GAL4-drivrutin för att uppnå hjärtspecifikt eNpHR2.0- och ReaChR-opsinuttryck. 
Sammantaget visar de presenterade experimentella resultaten återställbar hjärtstillestånd och inducerbar bradykardi och takykardi hjärtsjukdomar. Ett detaljerat protokoll med steg-för-steg-instruktioner för att skapa transgena Drosophila-modeller och genomföra samtidig OCT-avbildning och optogenetiska pacing-experiment i levande djur tillhandahålls.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>18449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>02-10-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLED Light Source Control Module, 4-channel</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-SA04-US</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband Light Source Module</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>cBLMD-T-850-HP</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra-S 800 OCT Spectrometers</td>
			<td>&#160;Wasatch Photonics</td>
			<td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td>
			<td>Part of the SD-OCT imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professtional</td>
			<td>34155</td>
			<td>tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila culture bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyNet 2.0 Software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Power LED Collimator Sources</td>
			<td>Migtex Systems</td>
			<td>BLS-LCS-0617-03-22</td>
			<td>Part of the optogenetic stimulation module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-72P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow plugs for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow vials for Drosophila culture</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugs for Drosophila bottles</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1386-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT control software</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT imaging and optogenetic pacing system</td>
			<td>Z-Lab</td>
			<td></td>
			<td>Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>89-2871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 41752</td>
			<td>eNpHR2.0 transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 53748</td>
			<td>ReaChR transgenic line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock # 48396</td>
			<td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>stock #6658</td>
			<td>GFP reporter line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Lab Scientific bioKEMIX</td>
			<td>978-907-4243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing drosophila melanogaster models for imaging and optogenetic control of cardiac function

Att använda Drosophila melanogaster (bananfluga) som modellorganism har säkerställt betydande framsteg inom många områden av biologisk vetenskap, från cellulär organisation och genomiska undersökningar till beteendestudier. På grund av den ackumulerade vetenskapliga kunskapen har Drosophila under de senaste åren förts till området för modellering av mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar. Det presenterade arbetet beskriver det experimentella systemet för övervakning och manipulering av hjärtfunktionen i samband med en hel levande organism med rött ljus (617 nm) och utan invasiva procedurer. Kontroll över hjärtat uppnåddes med hjälp av optogenetiska verktyg. Optogenetik kombinerar uttrycket av ljuskänsliga transgena opsiner och deras optiska aktivering för att reglera den biologiska vävnaden av intresse. I detta arbete användes ett anpassat integrerat optiskt koherenstomografi (OCT) avbildnings- och optogenetiskt stimuleringssystem för att visualisera och modulera det fungerande D. melanogasterhjärtat vid 3: e instarlarven och tidiga pupalutvecklingsstadier. UAS/GAL4 dubbla genetiska systemet användes för att uttrycka halorhodopsin (eNpHR2.0) och rödförskjutet channelrhodopsin (ReaChR), specifikt i flughjärtat. Detaljer om beredning av D. melanogaster för levande OCT-avbildning och optogenetisk pacing tillhandahålls. En laboratorieutvecklad integrationsprogramvara bearbetade bilddata för att skapa visuella presentationer och kvantitativa egenskaper hos Drosophilas hjärtfunktion. Resultaten visar möjligheten att initiera hjärtstillestånd och bradykardi orsakad av eNpHR2.0-aktivering och utföra hjärtpacing vid ReaChR-aktivering.

D. melanogasterdjur som uttrycker röda ljuskänsliga opsiner eNpHR2.0 eller ReaChR i hjärtröret genererades genom att erhålla avkomma från korsningen mellan varje UAS-opsin transgen linje och Hand-GAL4-drivrutin . Vävnadsspecificiteten hos GAL4-drivrutinen verifierades genom avbildning av GFP-uttryck (figur 4). Drosophila 3rd instar larva och tidiga puppa utvecklingsstadier användes för att visa effekterna av eNpHR2.0 och ReaChR aktivering med rött ljus. Designade ~617 nm rödljuspulser, levererade av LED, belyste larven/poppen och aktiverade eNpHR2.0 och ReaChR i hjärtat. Även om den rapporterade maximala svarsvåglängden för NpHR är ~ 580 nm och för ReaChR är ~ 600 nm, kan 617 nm ljusbelysning tränga djupare med förbättrad ljusenergileverans mot den opsinuttryckande hjärtvävnaden22.
Monterad på mikroskopbilden med ryggsidan nedåt i den inverterade mikroskopinställningen, belystes larven / poppen av en LED-ljusstråle riktad mot A7-kroppssegmentet. Exempel på kroppstvärsnittsbilder visas i figur 5A och figur 6A. Hjärtat framträder som en sammandragande och vidgande cirkulär form i videoinspelningarna som består av 4 000 bilder (kompletterande videor 1-6). För att efterlikna olika hjärtsjukdomar designades fyra typer av ljuspulser. En enda puls som varade 10 s efter 5 s väntetid genererade återställbart hjärtstopp inducerat av eNpHR2.0, som visas i figur 5B. För hjärtfrekvensen vid frekvenser som är långsammare än vilopulsen (RHR), medierad av eNpHR2.0, användes två ljuspulssekvenser med pacingfrekvenser lika med RHR/2 och RHR/4 som varade i 8 s med en väntetid på 6 s däremellan (figur 5C). Arbetscykeln för varje ljuspulssekvens var 90%. Denna ljusstimuleringsregim orsakade ett hjärtsjukdom som påminner om bradykardi. Stimuleringsmönstret för att öka hjärtfrekvensen på grund av ReaChR-aktivering bestod av tre sekvenser av ljuspulser vid frekvenser av RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz respektive RHR + 1,5 Hz med en pulsbredd på 20 ms (Figur 5D). Denna pulsregim syftade till att orsaka ett takykardiskt hjärtsjukdom. Ljuseffekten var 7,49 mW/mm2 under alla experiment. För kontrollexperiment ställdes ingen ljusbelysning in.
Varje experimentell variant registrerades fem gånger. M-mode-videor av flughjärtat bearbetades till 2D-masker med FlyNet 2.027. Denna programvara segmenterar automatiskt hjärtregionen för att producera hjärtfunktionsdatauppsättningarna. Programmet ger en mask av hjärtat i varje ram, som vid behov kan korrigeras ytterligare manuellt för att generera exakt kvantifiering av det bultande hjärtats funktionella parametrar, såsom hjärtfrekvens (HR), slutdiastolisk dimension (EDD) och slutsystolisk dimension (ESD), fraktionerad förkortning (FR), slutdiastoliskt område (EDA), slutsystoliskt område (ESA), etc. Hjärtfrekvensen mäts genom att analysera hjärtområdet över tid. Kontrollvideon utan ljuspulser används för att fastställa en baslinjepuls (t.ex. RHR) för varje djur.
Figur 5B och figur 6B visar 10 s långt hjärtstopp orsakat av Hand>eNpHR2.0-aktivering med rött ljus (617 nm) i larv respektive puppa. När det röda ljuset tändes slutade Drosophilas hjärta att slå och förblev i detta tillstånd fram till slutet av ljusbelysningen. Hjärtfunktionen återställdes efter att det röda ljuset släcktes. Djur som inte hade opsin uttryckt ("no opsin"-kontroll) svarade inte på rödljusbelysningen (tilläggsfigur 2A och tilläggsfigur 3A). Kontrollförsöken med hand>eNpHR2.0-djur där 10 s rödljusbelysning inte var påslagen ("inget ljus"-kontroll) visade att hjärtat slog normalt (kompletterande figur 4A och tilläggsfigur 4C).
Med hjälp av hand>eNpHR2.0-djur applicerades röda ljuspulser vid frekvenser lägre än RHR. Hjärtkontraktionsfrekvensen minskade efter ljussignalerna; denna långsammare hjärtfrekvens efterliknar en typ av hjärtarytmi, bradykardi (figur 5C och figur 6C för larv respektive puppa). Det långsammare hjärttempot observerades inte i "no opsin" (kompletterande figur 2B och tilläggsfigur 3B) och i kontrollexperiment med "inget ljus" (tilläggsfigur 4A och kompletterande figur 4C).
Att öka hjärtfrekvensen kan uppnås genom att aktivera Hand>ReaChR opsin med pulståg med rött ljus med en frekvens som är högre än RHR för det givna djuret. En serie av tre ljuspulståg vid olika stimuleringsfrekvenser (t.ex. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) applicerades på Hand>ReaChRlarver och pupparhjärtan. De erhållna uppgifterna visar tydligt ökad hjärtfrekvens efter ljuspulserna (figur 5D och figur 6D för larv respektive puppa). Hjärtfelet som demonstreras i dessa experiment efterliknar takykardi. Negativa kontrollexperiment visas i tilläggsfigur 2C, tilläggsfigur 3C och tilläggsfigur 4B,D.
Sammantaget visar resultaten genomförbarheten av icke-invasiv och specifik optogenetisk kontroll av hjärtrytmen i olika utvecklingsstadier i transgena djurmodeller av D. melanogaster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig01.jpg"> Figur 1: OCT-bildsystem integrerat med 617 nm LED-modul för optogenetisk kontroll av Drosophila-hjärtfunktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig02.jpg"> Figur 2: Generera D. melanogaster djur som uttrycker opsin i hjärtat. (A) Genetiskt korsdiagram. Kvinnor Hand-GAL4/TM6 SbTb korsades till hanar som bar eNpHR2.0. Den resulterande Hand-GAL4/eNpHR2.0-avkomman (markerad med den röda stjärnan) samlades in för OCT-avbildning, och Hand-GAL4/TM6 Sb Tb kasserades baserat på deras fenotypiska utseende. (B) Genetiskt korsdiagram. Kvinnor Hand-GAL4 / TM6 SbTb korsades till män som bär ReaChR. Den resulterande Hand-GAL4/ReaChR-avkomman (markerad med den röda stjärnan) samlades in för OCT-avbildning, och Hand-GAL4/TM6 Sb Tb kasserades baserat på deras fenotypiska utseende. (C) Fenotypiska skillnader mellan Hand-GAL4/opsin (röd stjärna) och Hand-GAL4/TM6 Tb avkomma. Djur som bär Tb-genmutationen på TM6-kromosomen har en "tubby" kroppsform jämfört med normal, icke-Tb-larv eller puppa. Den vänstra panelen visar larver; Den högra panelen visar tidiga puppor. Bilderna innehåller också en linjal med 1 mm märken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig03v2.jpg"> Figur 3: Schematisk presentation och tidslinje för bildberedningsprocedurerna. Föräldralager förvaras i flugflaskor; Jungfruliga kvinnor och män korsas i smala ampuller fyllda med vanlig mat (indikeras med gul färg). Aktivt äggläggande flugor överförs till ATR-innehållande media (visas i bruna) ampuller. Injektionsflaskor med utvecklande avkomma måste hållas i mörkret från detta steg. 3: e instar larver och tidig puppa samlas in från injektionsflaskans väggar för avbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig03largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig04.jpg"> Figur 4: D. melanogaster tidig puppa som uttrycker UAS-GFP (BDSC 6658) som drivs av Hand-GAL4 (BDSC 48396). Fluorescensmönstret bekräftar hjärtspecificiteten hos Hand-GAL4-drivrutinen . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig05v2.jpg"> Figur 5: Simulering av hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi i D. melanogasterlarv . A) ULT-bild av ett tvärsnitt av larvkroppen. Hjärtat framträder som en cirkel under kroppens yta. (B) Grafisk presentation av det återställbara hjärtstoppet. Den övre panelen visar tidpunkten (X-axeln) för rödljusbelysningen (Y-axeln, ljuskällans effektnivå i procent). Den mellersta panelen indikerar förändringen i hjärtområdet (Y-axel, kvadratmikrometer) över tiden (X-axeln). Den nedre panelen visar hjärtfrekvensförändringen (Y-axeln, hertz) över tid (X-axeln). (C) Grafisk presentation av eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi. Den övre panelen visar pulser av rödljusbelysningen, vilket inducerar två perioder av bradykardi: 50% av RHR och 25% av RHR. Hjärtområde och hjärtfrekvensförändringar visas på mitten respektive nedre panelerna. (D) Grafisk presentation av hjärtpacing med aktiverad ReaChR. Den övre panelen visar en serie av 20 ms röda ljuspulser som uppträder vid RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz och RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjärtkontraktionerna följer ljuspulsfrekvenserna, som visas på de mellersta och nedre panelerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig05largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig06v2.jpg"> Figur 6: Simulering av hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi i D. melanogaster puppa . (A) ULT-bild av pupalkroppstvärsnitt. Hjärtat framträder som en cirkel under kroppens yta. (B) Grafisk presentation av det återställbara hjärtstoppet. Den övre panelen visar tidpunkten (X-axeln) för rödljusbelysningen (Y-axeln, ljuskällans effektnivå i procent). Den mellersta panelen indikerar förändringen i hjärtområdet (Y-axel, kvadratmikrometer) över tiden (X-axeln). Den nedre panelen visar hjärtfrekvensförändringen (Y-axeln, hertz) över tid (X-axeln). (C) Grafisk presentation av eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi. Den övre panelen visar pulser av rödljusbelysningen, vilket inducerar två perioder av bradykardi: 50% av RHR och 25% av RHR. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområde respektive hjärtfrekvensförändringar. (D) Grafisk presentation av hjärtpacing med aktiverad ReaChR. Den övre panelen visar en serie av 20 ms röda ljuspulser vid RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz och RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjärtkontraktionerna följer ljuspulsens frekvenser, som visas på de mellersta och nedre panelerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig06largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: Genetiska korsningar för att ersätta TM3 Sb-balanseringskromosom med TM6 Sb Tb. Virgin honor Hand-GAL4 w +/ TM3 Sb korsades med nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w +/ TM6 Sb Tb hanar. Hand-GAL4 w +/ TM6 Sb Tb avkomma, inklusive jungfruliga kvinnor och män, valdes (screening för pigmenterade ögon i kombination med tubby kroppsform). Utvalda flugor korsades själv för att skapa ett stabilt lager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure1.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: I kontrollexperiment förändras inte vildtypslarvens hjärtrytm vid rödljusbelysning. (A) Inget hjärtstopp observerades under rödljusbelysningen i wt-larven. Den övre panelen visar M-läges hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. (B,C) Röda ljuspulser förändrar inte hjärtfrekvensen i wt larva. De övre panelerna visar M-läge hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure2.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 3: I kontrollexperiment förändras inte den vilda typen (wt) puppans hjärtrytm vid belysning av rött ljus. (A) Inget hjärtstopp observerades under rödljusbelysningen i wt-larven. Den övre panelen visar M-läges hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. (B,C) Röda ljuspulser ändrar inte hjärtfrekvensen i wt-puppan. De övre panelerna visar M-läge hjärtbilder. Den röda linjen indikerar belysningstiden. De mellersta och nedre panelerna visar hjärtområdet och hjärtfrekvensen under 32 s bildtid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure3.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 4: D. melanogasterlarver och puppor som uttrycker Hand> eNpHR2.0 eller Hand>ReaChR visar inte signifikanta HR-förändringar under OCT-avbildning utan rödljusbelysning. (A) Hjärtfrekvensen hos hand >eNpHR2.0 larv. (B) Hjärtfrekvensen hos Hand>ReaChR-larven . (C) Hjärtfrekvensen för Hand>eNpHR2.0 puppa. (D) Hjärtfrekvensen för Hand>ReaChR puppa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure4.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande video 1: Aktiverad eNpHR2.0 orsakar hjärtstillestånd i D. melanogaster larv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo1.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video 2: Aktiverad eNpHR2.0 orsakar hjärtstillestånd i D. melanogaster puppa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo2.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video 3: eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi i D. melanogaster larva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo3.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video 4: eNpHR2.0-medierad återställbar bradykardi i D. melanogaster puppa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo4.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video 5: Hjärtpacing genom aktiverad ReaChR i D. melanogaster larv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo5.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande video 6: Hjärtpacing genom aktiverad ReaChR i D. melanogaster puppa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo6.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function at JoVE.com

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Det nuvarande protokollet beskriver genereringen av Drosophila melanogaster som uttrycker eNpHR2.0 eller ReaChR-opsiner i hjärtat för OCT-avbildning och optogenetisk hjärtpacing. Detaljerade instruktioner för Drosophila OCT-avbildning och hjärtslagsmodulering, inklusive simulering av återställbar hjärtstillestånd, bradykardi och takykardi hos levande djur i olika utvecklingsstadier, rapporteras.

Utveckla Drosophila melanogaster-modeller för avbildning och optogenetisk kontroll av hjärtfunktionen

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

Protokollet presenterar Drosophila-modeller där hjärtfunktionen kan karakteriseras och styras med hjälp av ljus. Detta gör det möjligt för forskare att studera mänskliga hjärtsjukdomar i Drosophila med intakta djur. Denna metod kan på ett tillförlitligt sätt uppnå icke-invasiv OCT-avbildning och optogenetisk kontroll av Drosophila-hjärtfunktionen.Den har hög effektivitet och kvalitet. Optogenetisk pacing kan potentiellt vara ett alternativ till elektrisk pacing som terapi för att behandla arytmiska störningar. OCT-avbildning och optogenetisk pacing kan utvidgas till andra modellsystem som hjärtorganoider, zebrafiskar och embryonal hals och hjärta.Till att börja med, kombinera fem hand GAL4 över TM6 dubbel-tubby jungfru hona och två till tre manliga flugor från UAS Ops och Stocks per injektionsflaska. Nästa dag, förbereda halvdefinierad mat enligt instruktionerna från Bloomington Drosophila Stock Center genom att tillsätta 5,14 gram per 100 ml sackaros i en behållare på en kokplatta. Kyl sedan den till 60 grader Celsius under konstant omrörning.Förbered sedan smala flugflaskor genom att tillsätta 50 mikroliter 100 millimolar all-trans retinal etanollösning till varje injektionsflaska. Använd en serologisk pipett för att kassera fem milliliter flugmat per smal fluga avskyvärd. Efter virvel med maximal hastighet i 10 sekunder, anslut dessa flaskor och linda dem i det mörka tyget för att skydda dem från ljus.Nästa dag, överför flugorna stadigt lägger ägg till flaskorna med all-trans retinal etanol som innehåller mat. Skydda ställen med ampuller från ljus. Efter 24 till 48 timmar, beroende på antalet ägg som läggs, kassera föräldrarna för att förhindra överbefolkning av injektionsflaskor.Samla sedan icke-tubby avkomma för hjärtavbildning. Välj UAS-alternativ hand GAL4 larv eller puppa från injektionsflaskan, lägg den på en vävnad och torka försiktigt av mediet från kroppsytan med en målningsborste. Förbered mikroskopbilden med en liten bit dubbelsidig tejp i mitten.Placera sedan försiktigt larven eller poppen på tejpytan med ryggsidan uppåt och vinkelrätt mot bildens långsida med en borste eller fin pincett. Applicera försiktigt tryck för att fästa larven eller poppen på bandets yta. Ställ nu in bilden på bildstadiet med larven eller poppen nedåt och slå på den optiska koherenstomografin eller OCT-ljuskällan med laserkontrollprogramvara.Öppna den specialskrivna spektraldomänen OCT-kontrollprogramvara. Klicka sedan på förhandsgranskningsfönstret. Ställ sedan in skanningsparametrarna i spektraldomänens OCT-programvara.Använd mikromanipulatorer för att styra provsteget för att få flughjärtat i fokus. Justera brännvidden för att minimera ljusreflektion från flugans nagelbandsyta. Överväg också att applicera mineralolja på larven eller poppytan för att minimera reflektion.Ställ sedan in skanningsparametrarna för OCT-bildförvärv i M-läge och skaffa fem uppsättningar kontrolldata utan röda ljusstimuleringspulser för att beräkna vilopuls. Designa ljuspulsen för tempostimulering i den anpassade OCT-kontrollprogramvaran. För detta klickar du på inställningsflikarna och lägger till de designade ljuspulssekvenserna för att styra pulsfrekvens, pulsbredd, stimuleringstid och väntetid enligt olika stimuleringsprotokoll.Öppna sedan programvaran för ljusstyrenhet för att generera pulser för rött ljus. Välj pulsläge i lägesval. Dubbelklicka på figuren för pulsprofilinställningarna och välj uppföljningsläge.Håll av-intensiteten vid noll och ställ in intensitetsprocenten vid beräkning av den faktiska effekttätheten. Skaffa M-lägesvideor av det slående Drosophila-hjärtat med ljusstimulering genom att klicka på Förvärva i OCT Control-programvaran. Spela in blinkningar av rött ljus ner i flyghjärtat under bildförvärv.Observera att olika tempoinställningar krävs för att styra flughjärtfunktionen med rödförskjutna channelrhodopsin- och NPHR-flygmodeller. Öppna den specialutvecklade programvaran för segmentering av flyghjärta och klicka på välj fil. Välj sedan filen som ska analyseras i det grafiska användargränssnittet.Ange både de lodräta och vågräta gränserna för hjärtregionen i pixlar i de översta textrutorna. Klicka på ändra storlek. Använd skjutreglaget på botten och se till att hela hjärtregionen är synlig och att den fyller upp hela lådan för hela samlingen.Efter att ha klickat på fliken förutsägelse kommer programmet att gå igenom varje skiva i samlingen och välja hjärtregionen på cirka tre minuter. När förutsägelsen är klar klickar du på HR-diagrammet för att visa ett diagram över hjärtområdet över tiden i ett nytt fönster. Välj rätt topp- eller dalområden, välj puls och sedan HR-flikar för att generera en slutlig siffra.De funktionella parametrarna sparas samtidigt i CSV-filerna. Vävnadsspecificiteten hos handens GAL4-drivrutin verifierades genom avbildning av grönt fluorescerande proteinuttryck. De typiska OCT-bilderna av larv- och valpkroppstvärsnitt visas här.För att efterlikna olika hjärtsjukdomar designades fyra typer av ljuspulser. En enda puls som varade i 10 sekunder efter fem sekunders väntetid genererade återställbart hjärtstopp. För hjärtfrekvensen vid frekvenser som är lägre än vilopulsen användes två ljuspulssekvenser med pacingfrekvenser som motsvarar hälften av vilopulsen och en fjärdedel av vilopulsen som varade i åtta sekunder med en väntetid på sex sekunder däremellan.Stimuleringsmönstret för att öka hjärtfrekvensen på grund av rödförskjuten kanalrhodopsinaktivering bestod av tre sekvenser av ljuspulser. Den minskade hjärtkontraktionsfrekvensen efter ljussignalerna resulterade i en långsammare hjärtfrekvens som härmar hos larv och puppa. En serie med tre lätta pulståg vid olika stimuleringsfrekvenser applicerades på larver och puppor hjärtan visade tydligt ökad hjärtfrekvens efter ljuspulserna.Förberedelsevalet av korrekt avkomma, montering av provet och avbildningsförfarande är avgörande. Vi hoppas kunna överföra den optogenetiska pacingtekniken till större djurmodeller, studera däggdjurs hjärtsjukdomar och utforska nya terapeutiska metoder för att behandla arytmi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Enkla mikroflödessystem enheter för<em&gt; In vivo</em&gt; Avbildning av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Och zebrafisk

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Provberedning Strategier för masspektrometri avbildning av 3D cellodlingsmodeller

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In vivo kvantitativ bedömning av Myocardial struktur, funktion, perfusion och livskraft Använda Cardiac Micro-datortomografi

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

Skalade Anatomical Modell Skapande av Biomedical tomografisk bildåtergivnings Data och associerade Etiketter för Efterföljande Sub-yta lasergravyr (SSLE) av glas Kristaller

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Inriktning neuronala Fiber skrifter för Deep Brain stimulering terapi med hjälp av interaktiva, patientspecifika modeller

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Högdimensionell flödescytometri för immunfunktionsanalys av dissekerade implantatvävnader

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Bygga ett enkelt och mångsidigt belysningssystem för optogenetiska experiment

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Utveckla 3D organiserad mänsklig hjärtvävnad inom en mikrofluidisk plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Kvantifiering av mushjärta vänster ventrikulär funktion, hjärtmuskelstam och hemodynamiska krafter genom kardiovaskulär magnetisk resonanstomografi

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Skapande av patientspecifika silikonkarminmodeller med tillämpningar i prekirurgiska planer och praktisk träning

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...